醫(yī)學遺傳學-臨床遺傳學

醫(yī)學遺傳學臨床遺傳學臨床遺傳學(clinicalgenetics)：是研究臨床各種遺傳病的診斷、產前診斷、預防、遺傳咨詢以及治療，以降低遺傳病在人群中的危害，提高人們的遺傳素質。臨床遺傳學第一節(jié)遺傳病診斷臨床遺傳學遺傳病的診斷方法具有普遍性診斷原則，又有遺傳學的診斷手段。遺傳病的診斷主要包括產前診斷(prenataldiagnosis)、癥狀前診斷(presymptomaticdiagnosis)和現癥狀病人診斷(symptomaticdiagnosis)。其中以產前診斷和癥狀前診斷尤其重要。臨床遺傳學臨床診斷病史、癥狀和體征家族史應特別注意患者和代述人所提供的家族各成員的體征、癥狀和關系的準確性。臨床遺傳學臨床診斷病史、癥狀和體征婚姻史著重了解婚齡、次數、配偶健康情況以及是否是近親婚配。臨床遺傳學臨床診斷病史、癥狀和體征生育史著重詢問生育年齡、子女數目及健康情況，有無流產、死產和早產史，新生兒死亡或患兒。除詢問上述情況外，還應了解患兒有無產傷、窒息，妊娠早期有無患病毒性疾病和接觸過致畸因素等。臨床遺傳學臨床診斷病史、癥狀和體征癥狀和體征遺傳病除有和其他疾病相同體征外，又有其本身特異性癥候群，為初步診斷提供初步線索。如苯丙酮尿癥患兒常伴有智力低下和特殊腐臭尿；Down綜合征患兒伴有智力低下、眼距寬、眼裂小、張口伸舌等體征。臨床遺傳學臨床診斷系譜分析系譜分析(pedigreeanalysis)是在調查患者及家族各成員的發(fā)病情況后按一定規(guī)律繪制一個圖解并行分析。臨床遺傳學臨床診斷系譜分析系譜分析(pedigreeanalysis)是在調查患者及家族各成員的發(fā)病情況后按一定規(guī)律繪制一個圖解并行分析。系譜分析，有助于區(qū)別遺傳病和非遺傳病，單基因或多基因病，顯性、隱性，常染色體遺傳病或性染色體遺傳病。臨床遺傳學臨床診斷系譜分析應該注意以下幾個方面系譜本身的全面、準確、可靠性要注意辨別區(qū)別孟德爾式遺傳病、非孟德爾式遺傳病和一些特殊的遺傳現象，如遺傳印記和動態(tài)突變等臨床遺傳學臨床診斷系譜分析應該注意以下幾個方面外顯不全而使系譜呈現隔代遺傳遲發(fā)顯性新的突變產生顯性和隱性的相對性家系小而選樣偏倚現象臨床遺傳學細胞遺傳學診斷染色體檢查或稱核型分析(karyotypeanalysis)是輔助診斷和確診染色體疾病的主要方法之一。臨床遺傳學細胞遺傳學診斷性染色質檢查正常女性細胞中有兩條X染色體，其中一條有活性，另一條無轉錄活性，在間期細胞中呈異固縮而形成一個約1

m大小的貼近核膜內緣的濃染小體，稱為X染色質(X-chromatin)或Barr小體。臨床遺傳學細胞遺傳學診斷性染色質檢查在男性間期細胞核中，應用熒光染料染色后可見一個約為0.3

m大小的強熒光小體，即Y染色質(Y-chromatin)或Y小體。臨床遺傳學細胞遺傳學診斷染色體核型分析染色體數目異常和結構畸變的分析。一般觀察30～50個細胞，其中有3～5個形態(tài)結構異常完全相同的核型，即可做出初步診斷。臨床遺傳學細胞遺傳學診斷染色體核型分析高齡孕婦(35歲以上)多發(fā)性流產的婦女及其丈夫原發(fā)閉經和男女不孕癥者智能發(fā)育不全、生長遲緩或伴有其他先天畸形者夫婦中有染色體異常，如平衡易位、嵌合體等家族中已發(fā)現染色體異?；蛳忍旎蝹€體有兩性內外生殖器畸形者臨床遺傳學細胞遺傳學診斷染色體原位雜交應用標記的DNA探針與載玻片上的染色體或間期細胞的DNA或RNA雜交，研究核酸片段的位置，相互關系稱為原位雜交。臨床遺傳學細胞遺傳學診斷染色體原位雜交用生物素、地高辛等標記DNA探針，原位雜交后。用熒光生物素和抗體進行免疫檢測和放大雜交信號，使探針雜交區(qū)域發(fā)出熒光，這種原位雜交稱為熒光原位雜交(FISH)。臨床遺傳學細胞遺傳學診斷染色體原位雜交檢測染色體缺失、插入、易位及擴增等結構異常，也可檢測間期核判定染色體數目異常。雙色FISH，多色FISH以及染色體涂染方法的應用，提高了異常染色體的檢出率和準確性。臨床遺傳學生化檢查基因突變引起的單基因病往往表現在酶和蛋白質的質和量的改變和缺如。因此，酶和蛋白質的定量、定性分析是診斷單基因病或先天代謝病的主要方法。臨床遺傳學生化檢查代謝產物的檢測DMD可檢測血清中磷酸肌酸激酶活性；苯丙酮尿癥患者可檢測血清苯丙氨酸或尿中苯乙酸濃度做出判斷等。臨床遺傳學生化檢查酶和蛋白質的分析基因突變導致表達調控異?；蚍g后加工修飾缺陷，使酶蛋白缺如或功能異常。通過酶活性檢測而診斷某些遺傳代謝病。臨床遺傳學基因診斷分子生物學技術極大的豐富了我們對人類遺傳病的分子病理學研究的認識，同時也提供了從DNA水平對遺傳病基因診斷的手段。基因診斷(genediagnosis)是利用DNA分析技術直接從基因水平(DNA或RNA)檢測遺傳病的基因缺陷而做出診斷。臨床遺傳學基因診斷的原理核酸分子雜交是基因診斷的最基本方法之一。其基本原理是根據堿基互補原則，互補的DNA單鏈在一定條件下結合成雙鏈，即分子雜交。臨床遺傳學基因診斷的原理結合是特異性的，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也能在DNA和RNA之間進行。當用一段已知基因的核苷酸序列作為探針，與變性后的單鏈基因組DNA混合時，如果兩者的堿基互補配對，結合成雙鏈，從而表明被檢測的基因組DNA中含有已知的基因序列。臨床遺傳學基因診斷的原理進行基因檢測有兩個必要條件，一是必需有特異的DNA探針，二是必需有基因組DNA。當二者均變性呈單鏈時，即可進行分子雜交。臨床遺傳學基因診斷的原理基因探針基因探針(geneprobe)就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以是基因的一部分，可以是DNA本身，也可以是由之轉錄而來的RNA。臨床遺傳學基因探針探針來源基因組探針(genomicprobe)cDNA探針(cDNAprobe)人工合成的寡核苷酸探針基因診斷的原理臨床遺傳學基因探針探針制備進行分子雜交需要大量的探針拷貝，一般是通過分子克隆(molecularcloning)獲得的?？寺?clone)是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細胞或分子的大量復制品?；蛟\斷的原理臨床遺傳學探針制備基因組DNA探針應先制備基因組文庫，從中篩選出含有目的基因片段的克隆，再通過細菌擴增，制備出大量探針?；蛱结樆蛟\斷的原理臨床遺傳學探針制備cDNA探針首先需提取純化mRNA，從組織、細胞中提取mRNA，以其為模板，在逆轉錄酶的作用下合成與之互補的DNA(即cDNA)?；蛱结樆蛟\斷的原理臨床遺傳學探針制備寡核苷酸探針(ASO)是根據已知基因序列合成的與其互補的核苷酸片段，長度可十幾個至幾十個核苷酸。其序列跨越基因突變位點，每一突變位點有兩種ASO探針，分別與正常序列和異常序列互補?；蛱结樆蛟\斷的原理臨床遺傳學探針標記目的是使探針帶有標識物與DNA結合后產生可識別信號。通常采用放射性同位素32P標記探針的某種核苷酸的α磷酸基。近年來發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標記物的方法?；蛱结樆蛟\斷的原理臨床遺傳學探針標記缺口平移法(nicktranslation)基因探針基因診斷的原理臨床遺傳學缺口平移法臨床遺傳學限制性酶限制性核酸內切酶(restrictionendonuclease)，又簡稱限制酶或內切酶。是重組DNA技術和基因診斷中最重要的一類工具酶。限制酶能特異地識別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。臨床遺傳學限制酶的命名限制性酶EcoRⅠ屬名種名菌株名酶的序號臨床遺傳學限制酶識別序列和切割形式限制性酶HaeⅢ5’3’3’5’GGCCCCGG5’3’3’5’GGCCCCGGMboⅠ5’3’3’5’GATCCTAG5’3’3’5’GATCCTAGBamHⅠ5’3’3’5’GGATCCCCTAGG5’3’3’5’GCCTAGGATCCGPstⅠ5’3’3’5’CTGCAGGACGTC5’3’3’5’CTGCAGGACGTC臨床遺傳學限制酶識別序列和切割形式限制性酶平末端(bluntend)：對稱軸切，連接效果差粘性末端(stickyend)：交錯切臨床遺傳學DNA多態(tài)性一個人的兩套單倍體DNA是不完全相同的，一般每100～500個堿基對就有一個是不相同的。換言之，如果把兩套基因組的DNA(各2.8×109bp)排列起來，那么平均有1000萬處不同，它們多位于內含子序列中。實際上，除單卵雙生子外，人群中沒有兩個個體的基因組DNA是完全相同的。臨床遺傳學RFLP：第一代多態(tài)標記VNTR，STR：第二代多態(tài)標記SNP：第三代多態(tài)標記DNA多態(tài)性臨床遺傳學RFLP：第一代多態(tài)標記DNA多態(tài)性由于堿基的變異可能導致酶切點的消失或新的切點出現，從而引起不同個體DNA在用同一限制酶切時，DNA片段長度出現差異，這種由于內切酶切點變化所導致的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP)。臨床遺傳學RFLP：第一代多態(tài)標記DNA多態(tài)性8kb5kb3kb等位基因1等位基因2探針位置

2/21/11/28kb5kb3kb等位基因臨床遺傳學VNTR，STR：第二代多態(tài)標記DNA多態(tài)性在人類基因組中還存在一類DNA重復序列，稱為小衛(wèi)星DNA。每一個單位通常只有16～28bp長，但其重復次數在人群中是高度變異的。當用限制酶切割VNTR區(qū)時，只要酶切位點不在重復區(qū)內，就可能得到各種長度不同的片段。限制性片段大小的差異取決于兩個酶切位點之間的串聯(lián)重復單位數目的不同。臨床遺傳學VNTR，STR：第二代多態(tài)標記DNA多態(tài)性另一類重復序列是微衛(wèi)星DNA。它們的基本序列只有2～6bp，如(TA)n、(CGG)n等，通常重復10～60次并呈高度的多態(tài)性。臨床遺傳學SNP：第三代多態(tài)標記DNA多態(tài)性單核苷酸重復(A)n的位點極其豐富，遍及整個基因組，具有高度多態(tài)。據估計基因組中大約平均1000bp就會出現一個SNP，這樣SNP在整個基因組的分布就會達到300萬個。應用于搜尋多基因遺傳病相關基因，對重要疾病進行連鎖分析，進行致病基因定位和克隆等。臨床遺傳學Southern印跡雜交基因診斷技術與方法同源的兩條DNA-DNA在一定條件下結合形成雙鏈。臨床遺傳學Southern印跡雜交基因診斷技術與方法基因組DNA提取DNA限制性內切酶酶解基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片段凝膠中DNA片段原位堿變性凝膠中單鏈DNA的Southern印跡轉移探針標記分子雜交放射(熒光)自顯影或顯色結果分析臨床遺傳學Southern印跡雜交基因診斷技術與方法同源的兩條DNA-DNA在一定條件下結合形成雙鏈。缺失、插入、倒位、基因擴增檢測RFLP連鎖分析臨床遺傳學Southern印跡雜交基因診斷技術與方法臨床遺傳學Northern印跡雜交基因診斷技術與方法是指DNA-RNA分子雜交，應用特異性基因探針分析基因的轉錄水平。臨床遺傳學Northern印跡雜交基因診斷技術與方法提取T、Cell總RNA提純分離mRNA瓊脂糖凝膠電泳分離RNA轉移至硝酸纖維素膜雜交檢測臨床遺傳學Northern印跡雜交基因診斷技術與方法是指DNA-RNA分子雜交，應用特異性基因探針分析基因的轉錄水平。檢測mRNA長度分子量大小(依電泳遷移率估計)mRNA的含量，即基因表達高低。臨床遺傳學聚合酶鏈反應(PCR)基因診斷技術與方法PCR(polymerasechainreaction)是模擬體內DNA復制條件，應用DNA聚合酶反應，特異性擴增某一DNA片段的技術。體外程序化的DNA合成技術。臨床遺傳學聚合酶鏈反應(PCR)基因診斷技術與方法合成待擴增區(qū)域兩端已知序列，與模板DNA互補的寡核苷酸特異性引物，引物的序列決定擴增片段的長度。臨床遺傳學聚合酶鏈反應(PCR)基因診斷技術與方法反應體系：DNA模板，TaqDNA聚合酶，dNTPs。臨床遺傳學聚合酶鏈反應(PCR)基因診斷技術與方法反應程序變性(94~95℃)

復性

延伸(37~55℃)(70~72℃)30-35cyclesDNA擴增100萬倍臨床遺傳學聚合酶鏈反應(PCR)基因診斷技術與方法臨床遺傳學聚合酶鏈反應(PCR)基因診斷技術與方法優(yōu)點特異性強、靈敏度高、穩(wěn)定可靠、快速微量的模板DNA即可擴增大量產物臨床遺傳學聚合酶鏈反應(PCR)基因診斷技術與方法應用基因組DNA分析遺傳物質的鑒定遺傳病的診斷臨床遺傳學聚合酶鏈反應(PCR)基因診斷技術與方法缺點需靶DNA序列的信息產物短小，DNA復制不精確臨床遺傳學PCR相關技術基因診斷技術與方法增效PCR(boosterPCR)當擴增少于1000拷貝的模板DNA時會遇到兩個問題：形成引物二聚體非特異擴增.消耗了引物和酶，而特異擴增片段產量降低。臨床遺傳學PCR相關技術基因診斷技術與方法增效PCR(boosterPCR)對于這種情況，可設置二步PCR，先用較低濃度的引物進行初級PCR，此時由于引物少，形成產物二聚體的可能減少，但并不影響靶序列的擴增，只是產量不高。約經15~20個循環(huán)后補充引物量，以初級PCR產物為模板進行擴增，靶序列的產量將相應增加。臨床遺傳學PCR相關技術基因診斷技術與方法巢式PCR(nestPCR)進行二步PCR，其中第二級PCR另設反應體系，并應用另外的PCR引物，新引物的位置位于初級PCR引物的內側，只有初級PCR中特異的擴增片段才能被二級引物擴增。除了達到增效PCR同樣的目的外，還提高了最終產物的特異性。臨床遺傳學PCR相關技術基因診斷技術與方法多重PCR在同一PCR體系中加入若干對PCR引物，這些引物的退火溫度相近，且所覆蓋的區(qū)域不重疊，這樣的反應體系可同時擴增多個DNA片段。多重PCR常用來檢測同一基因的多個外顯子的缺失，或在檢測缺失設置內對照。臨床遺傳學PCR相關技術基因診斷技術與方法RT-PCR以mRNA為模板，經逆轉錄酶作用合成cDNA。使微量的mRNA(pg水平)迅速擴增(達ng~

g水平)，大大提高mRNA的檢出靈敏度。應用于基因表達與調控的研究。臨床遺傳學擴增片段長度多態(tài)性基因診斷技術與方法小衛(wèi)星DNA和微衛(wèi)星DNA的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，稱為擴增片段長度多態(tài)性(Amp-FLP)連鎖分析法。PCR擴增后，產物既等位片段之間的差別有時只有幾個核苷酸。多用于突變性質不明的連鎖分析。臨床遺傳學等位基因特異性寡核苷酸探針基因診斷技術與方法當基因的突變部位和性質完全明了時，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針(ASO)，用同位素或非同位素標記來進行診斷。探針為20bp左右的核苷酸。臨床遺傳學等位基因特異性寡核苷酸探針基因診斷技術與方法用于檢測點突變時一般需要合成兩種探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢?，能與之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列穩(wěn)定雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正?；蛐蛄蟹€(wěn)定雜交，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來。臨床遺傳學PCR-SSCP基因診斷技術與方法聚合酶鏈反應-單鏈構象多態(tài)性(PCR-singlestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)分析。臨床遺傳學PCR-SSCP基因診斷技術與方法原理是對已知有點突變的遺傳病，在疑有突變的DNA片段附近設計一對引物進行PCR擴增，然后將擴增產物用甲酰胺變性，并在不含變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，突變所引起的DNA構象差異將出現泳動變位，表現為電泳帶位置的差異，從而可據之做出診斷。臨床遺傳學基因診斷應用利用分子生物學技術從DNA水平檢測人類遺傳性疾病的基因缺陷，又稱DNA分析法。傳統(tǒng)診斷：表現型→基因型基因診斷：基因型→表現型(逆向診斷)直接診斷間接診斷臨床遺傳學直接診斷遺傳病診斷舉例鐮狀細胞貧血(HbS):code5~7MstⅡ:CCTNAGG

A:CCTGAGGAG

S:CCTGTGGAG1.2kb

0.2kb

A

A

A

S

S

S1.40kb1.20kb0.20kb臨床遺傳學直接診斷遺傳病診斷舉例ASO探針斑點雜交PKU,AR正常探針突變探針臨床遺傳學間接診斷遺傳病診斷舉例Southernblot-RFLP20.0Kb5.0Kb甲型血友病(BglⅠ)，XR12ⅠⅡ12345臨床遺傳學第二節(jié)遺傳病的治療臨床遺傳學隨著醫(yī)學遺傳學的迅速發(fā)展，人們對遺傳病的發(fā)病機理認識逐漸深入，重組DNA技術在醫(yī)學中廣泛應用，使遺傳病的治療有了長足的進步，逐漸從傳統(tǒng)的手術治療、藥物療法、飲食治療等步入了基因治療，技術方法的日益成熟，為根治遺傳病開辟了廣闊前景。臨床遺傳學手術治療某種遺傳病發(fā)展到各種臨床癥狀都已顯現，尤其是器官組織出現損傷時，手術治療可以有效地改善某些遺傳病的癥狀，減輕病痛。臨床遺傳學手術治療對某些受損器官的修補與切除，矯正畸形，例如，唇裂和(或)腭裂的修補；多指(趾)癥的切除；先天性心臟病的手術矯正等，改善癥狀。手術矯正臨床遺傳學手術治療免疫學知識和技術的發(fā)展，免疫排斥問題得到控制，應用組織器官移植技術緩解和治療遺傳病得以開展。器官和組織移植腎移植肝移植骨髓移植臨床遺傳學藥物及飲食治療飲食治療遺傳病的原則是禁其所忌。由于酶缺乏不能對底物進行正常代謝的患者，可以控制底物或前體物質的攝入量，降低代謝底物的堆積，以達到治療的目的。禁其所忌產前治療現癥病人治療臨床遺傳學藥物及飲食治療由于酶促反應障礙，體內貯積過多“毒物”，此時可使用各種理化方法將過多的“毒物”排除或抑制其生成，改善患者癥狀。去其所余應用螯合劑應用促排泄劑應用代謝抑制劑血漿置換和血漿過濾平衡清除法臨床遺傳學藥物及飲食治療先天代謝病往往是由于基因突變所致的酶缺失或活性下降或蛋白質缺乏，可用誘導和補充方法治療。補其所缺酶誘導治療蛋白酶補充療法臨床遺傳學基因治療基因治療(genetherapy)是指將外源正?；驅氚屑毎约m正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療的目的。臨床遺傳學基因治療基因治療的原理與策略生殖細胞基因治療體細胞基因治療臨床遺傳學基因治療基因治療的方法與應用目的基因的轉移基因的分離與克隆外源基因的轉移臨床遺傳學基因轉移方法化學法基因治療臨床遺傳學物理法電穿孔法顯微注射法脂質體法基因轉移方法基因治療臨床遺傳學同源重組法(homologousrecombination)是將外源基因定位導入受體細胞的染色體上，在該座位因有同源序列，通過單交換或雙交換，外源基因片段替換有缺陷的片段，達到修正缺陷的目的?；蜣D移方法基因治療臨床遺傳學病毒介導基因轉移(viralmediatedgenetransfer)以病毒為目的基因載體(vector)，將外源目的基因通過基因重組技術組裝于病毒載體(viralvector)上，再去感染宿主細胞。目前常用的病毒有逆轉錄病毒、牛乳頭瘤病毒、腺病毒、巨細胞病毒等?；蜣D移方法基因治療臨床遺傳學逆轉錄病毒是RNA病毒，但有逆轉錄酶，可使RNA逆轉錄為DNA，再整合到宿主細胞基因組。逆轉錄病毒載體病毒載體臨床遺傳學優(yōu)點逆轉錄病毒載體病毒載體高效感染宿主細胞，近100%的受體細胞被感染，轉化細胞效率高它能感染廣譜動物物種和細胞類型而無嚴格的宿主特異性隨機整合的病毒可長期存留，一般無害于細胞臨床遺傳學缺點逆轉錄病毒載體病毒載體病毒分子量小，最大插入片段在7kb左右隨機插入靶細胞基因組中只能把DNA整合到分裂旺盛的細胞基因組中具有致癌作用，可使受體細胞癌變臨床遺傳學一般認為這類病毒難于改造成缺陷型病毒，使用意義不大，但牛乳頭瘤病毒重組后，可在宿主染色體外獨立復制，不會因插入宿主染色體而引起插入突變，并表達出基因產物。DNA病毒載體病毒載體臨床遺傳學優(yōu)點DNA病毒載體病毒載體該病毒可感染分裂和非分裂的細胞，并能得到大量基因產物病毒顆粒相對穩(wěn)定，并易于純化和濃縮，且感染力不降低可有效轉導多種靶細胞后而游離于細胞基因組外，并持續(xù)表達臨