waters色譜柱相關(guān)知識

液相色譜基礎(chǔ)知識色譜柱基礎(chǔ)知識對HPLC柱填料的了解平均顆粒度，顆粒度分布顆粒度(dp)顆粒度越?。褐г礁?傳質(zhì)好，渦流擴(kuò)散小)

柱壓越高(滲透性差)顆粒分布顆粒分布越寬∶柱效低(滲透性差)顆粒形狀球型∶柱效高、重現(xiàn)性好、柱床結(jié)構(gòu)均勻無定型：柱床結(jié)構(gòu)不均勻

流動相線性速度不均勻

譜帶擴(kuò)展對HPLC柱填料的了解（二）平均孔徑/孔體積孔徑/孔體積分布大的孔徑可分析高分子量的分子對HPLC柱填料的了解（三）鍵合相化學(xué)影響化合物的分離度：a

不同鍵合相對不同種類的化合物分離不同可能導(dǎo)致色譜的分離機(jī)理不同如：C18、C8、CN硅膠表面及鍵合相鍵合相色譜柱以硅膠為基質(zhì)，通過化學(xué)鍵合方式把碳十八、碳八、胺基等基團(tuán)聯(lián)在基質(zhì)上，作為固定相。優(yōu)點(diǎn)∶固定相穩(wěn)定，不易流失應(yīng)用廣泛，可使用多種溶劑消除硅羥基的不良影響缺點(diǎn)∶pH值不能小于3同樣填料，各種牌號色譜柱不盡相同對HPLC柱填料的了解（四）含碳量含碳量越高，k'值越大（固定相傳質(zhì)效應(yīng)增加）高含碳量有利于不易保留的化合物的分離水解穩(wěn)定性好，重現(xiàn)性好有利于極性化合物的拖尾改善低含碳量有利于分析中性及堿性化合物降低溶劑損耗不同色譜柱的含碳量

色譜柱 C% k'苊(50/50的乙腈/水)SymmetryC18 19 17ZorbaxODS 17 15.7LiChrosorbRP-18 15 10.3SymmetryC8 12 12.5ResolveC-18 12 12.4UltrasphereODS 11 11.3PartisilODS-3 11 12.0mBondpakC-18 10 7.9Nova-PakC-18 7 5.5對HPLC柱填料的了解(五)填料的端基封口封口殘余硅羥基減少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）殘基處理的效果NovaPakC18未封口C18①抗壞血酸②煙酰胺③對氨基苯甲酸④哌咯西叮⑤核黃素⑥苯酚⑦鹽酸硫胺對HPLC柱填料的了解（六）硅膠的活性主要影響堿性化合物的保留行為：k'生產(chǎn)硅膠時(shí)處理溫度不同，硅膠活性也不同是選擇性差異的主要來源硅膠的雜質(zhì)含量重金屬含量低，硅羥基活性小，拖尾減小是色譜柱質(zhì)量好壞的重要標(biāo)志對HPLC柱填料的了解（七）填料的穩(wěn)定性硅膠填料pH：2-8聚合物填料pH：2-12pH值小于2時(shí)

鍵合相水解填料基質(zhì)物理性質(zhì)的影響所有C18柱都是相同的嗎?填料基質(zhì)的物理性質(zhì)對色譜柱的影響平均孔徑及其分布∶影響被分析樣品的分子量，大孔徑的可分析高分子量樣品平均孔體積及其分布∶影響同孔徑含碳量∶影響化合物的保留時(shí)間，高含碳量保留時(shí)間長填料的端基封口∶主要影響堿性化合物的峰形，未封口會使堿性化合物拖尾硅膠的活性∶主要影響堿性化合物的保留行為：K’，高活性的K’大硅膠的雜質(zhì)含量∶更苛刻條件下的堿性化合物峰形Waters色譜柱的內(nèi)徑分析柱：WatersSpherisorb及其它公司品牌的色譜柱多為4.6mm內(nèi)徑。Waters傳統(tǒng)品牌的分析柱以3.9mm內(nèi)徑為主，比一般分析柱(4.6mm)細(xì)，因此：相對靈敏度高省溶劑，可用相對較低的流速同樣的流速下，柱壓較高(高效柱尤為明顯)注意在用文獻(xiàn)方法時(shí)轉(zhuǎn)換流速,即:降低流速,以保持線速度相同。色譜柱化學(xué)及外形結(jié)構(gòu)的關(guān)系對HPLC柱的了解理論塔板數(shù)(N),容量因子(K’),選擇性系數(shù)(

),其影響因素有∶N：受平均顆粒度及顆粒度分布的影響,顆粒度越小,N越高：受填料表面化學(xué)性質(zhì)對色譜柱的影響,不同鍵合相對不同種類樣品分離不同K’：受鍵合相表面含碳量的影響,含碳量高時(shí)保留時(shí)間長在同樣情況下保留行為也有差異因此：需要對色譜化學(xué)品(色譜柱)有更多的了解需要不同品牌，即各個(gè)因素有較大差異的色譜柱，以得到更多種選擇性Waters擁有眾多不同品牌的色譜柱，目的就是：供不同應(yīng)用的要求用不同品牌的色譜柱時(shí)，色譜方法有時(shí)可能需要重新開發(fā)Waters各種硅膠基質(zhì)的色譜柱Waters不同品牌的色譜柱m-BondaPak文獻(xiàn)背景強(qiáng),是工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)平均孔徑125?，10mm高活性、無定形硅膠中等疏水性表面，端基封口。有獨(dú)特選擇性Nova-Pak平均孔徑60?，4mm高韌度低活性球形硅膠低酸性，高疏水性,極好的端基封口有利于小分子物質(zhì)的分析Waters不同品牌的色譜柱Resolve平均孔徑90?，5/10mm低活性硅膠非常高的疏水性,無端基封口有利于低保留的中性及酸性化合物分離Delta-Pak有100?和300?兩種孔徑，5/15mm硅膠中到高的疏水性，端基封口適合于多肽、蛋白的分離及制備色譜新一代硅膠基質(zhì)的色譜柱Symmetry高純度硅膠：Fe,Al,Mg等均<10ppm孔徑100?，5m球形顆粒，端基封口超高含碳量：C18/19%，C8/12%表面積：300m2/g孔體積：1mL/g特點(diǎn)對稱峰形，好重現(xiàn)性，不同的選擇性，使用壽命長由于拖尾引起的靈敏度差異

他莫昔芬0.25

g/mL信噪比11.06.5AUSymmetryC18AU5.0010.00MinutesConventionalC1899.6%99.8%99.9%峰面積回收率T=1.0092.3%95.3%97.8%T=1.58Waters21,379峰面積回收率由于拖尾引起的積分誤差超越極限：全新Xterra色譜柱集硅膠與聚合物基質(zhì)填料的優(yōu)點(diǎn)為一體,突破常規(guī)高效色譜柱的極限高效、高速分離不僅能夠使用極小粒徑的填料以進(jìn)行高分辨及快速分析，而且允許在高溫下進(jìn)行分離峰形優(yōu)異--對堿性化合物尤其如此pH范圍可與聚合物基質(zhì)色譜柱相比

pH范圍1-12極佳的穩(wěn)定性即使在高溫或極端pH條件下仍可維持長壽命峰形比較：XTerra?MSC18與普通C184.AcenaphthenePeakID:1.Propranolol2.Butylparaben3.Naphthalene5.AmitriptylineUsingSymmetryQCconditions:3.9x150mm,1.0mL/min,MeOH/20mMK2HPO4/KH2PO4,pH7.0,(65/35),23.4°CTime(min)0102030C18-Silica1234512345XTerra?MSC18USPT=2.28USPT=1.35Alden,Iraneta寬pH范圍在pH1-12范圍內(nèi)保持穩(wěn)定使pH成為改變選擇性的有力工具使可在非離子狀態(tài)下進(jìn)行分析堿性物質(zhì)的穩(wěn)定保留加速色譜柱壽命試驗(yàn)：

(pH10，50°C)壽命(小時(shí))Xterra:快梯度分析AU0.000.100.20Minutes0.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.40Waters特殊應(yīng)用的色譜柱(1)糖及其它碳水化合物的分析離子交換柱(鈣基/Ca)用于單糖、雙糖及糖醇等低分子量的糖、及乙醇等的分析。主要用于藥廠維生素C的原料分析(sorbitol/mannitol-山梨醇/甘露醇)，酒廠(葡萄酒、啤酒等)的糖及乙醇含量的分析。柱溫~90℃，要求有柱溫箱。對流動相(水)的要求較高，要求用戶另置超純水系統(tǒng)。氨基類型柱分析單糖、雙糖及三糖等多糖的分析，最大到DP10。用途較為廣泛，主要用于食品中糖的分析。反相類型柱硅膠類型柱體積排除(凝膠/GPC)類型柱Waters特殊應(yīng)用的色譜柱(2)食品中常見有機(jī)物的分析游離脂肪酸(FreeFattyAcid)分析甘油三酯及膽甾醇(俗稱膽固醇)的分析NovaPakC18膽甾醇及未皂化的油中的抗氧劑的分析StyragelHR100A及500A柱有效地分離。離子排斥類型色譜柱，用于有機(jī)酸，醇和碳水化合物類的分析，適合于分析單糖類、有機(jī)酸或糖酸離子排斥及反相混合類型的色譜柱，可測定葡萄酒、啤酒或其他飲料中的乙醇及有機(jī)酸的種類及含量，以確定其香型Waters特殊應(yīng)用的色譜柱(3)Waters生命科學(xué)專用柱(1)蛋白，多肽的分析和提純Protein-Pak系列凝膠柱Protein-Pak系列離子交換柱弱陰離子/DEAE 弱陽離子/CM強(qiáng)陰離子/Q 強(qiáng)陽離子/SP疏水回受柱親合色譜柱反相柱DNA分析，同蛋白分析相近，但有些專用柱Waters特殊應(yīng)用的色譜柱(4)Waters生命科學(xué)專用柱(2)糖蛋白的寡聚糖分析及純化離子交換柱(酸性)，Glyco-PakDEAE分配柱(中性)，Glyco-PakN(7.8×300mm)CarbohydrateAnalysis兒茶酚胺分析柱ResolveC18(傳統(tǒng)方法)、SymmetryC8氨基酸分析柱離子交換柱反相柱：Pico-Tag方法，AccQ-Tag方法液相色譜實(shí)用技術(shù)（二）色譜柱的使用及保養(yǎng)色譜柱與儀器的聯(lián)接不同公司的色譜柱接頭不同。處理不當(dāng)時(shí),會造成：色譜峰展寬(死體積)致使柱效下降或滲漏解決辦法∶自制相應(yīng)的轉(zhuǎn)換接頭使用“通用”型接頭（錐箍及螺母）這種錐箍在不銹鋼管上是活動的，即stop-depth的長度可調(diào)。因此可以換接不同的色譜系統(tǒng)及色譜柱。從WatersPhaseSeparations公司能得到一些PEEK工程塑料的接頭,可用在各種類型的色譜柱上。色譜柱的聯(lián)接各種錐箍和管路接頭長度示意圖:色譜柱的聯(lián)接Stop_depth長度不合適造成柱前死體積色譜柱的聯(lián)接錐箍錐度不合適造成滲漏:Waters色譜柱的聯(lián)接Waters及PhaseSeparations錐箍及螺母相同，但錐箍前露出的不銹鋼管長度不同其長度被稱為：“stop-depth”Waters除Spherisorb以外的各種品牌的色譜柱用的是“Waters”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth的長度為0.130英寸Spherisorb品牌的色譜柱及PhaseSeparations公司的其他品牌色譜柱用的是“Parker-style”標(biāo)準(zhǔn)，其stop-depth為0.090英寸測柱效-良好的色譜實(shí)驗(yàn)習(xí)慣拿到一根新色譜柱時(shí)，先測柱效保留在新色譜柱上測得的色譜圖，并記錄色譜測試條件定期檢測柱效定期檢測儀器的譜帶展寬測柱效的方法色譜柱種類繁多,性能各異,測定方法亦各不相同Waters的色譜柱均附有UseandCare說明書,可按說明書所述方法測定以下是Waters反相C18柱的測定方法:流動相:乙腈/水=60:40;流速:1ml/min樣品:50mgAcenaphthene(二氫苊)溶于100ml乙腈,加入600μl丙酮進(jìn)樣量5μl檢測波長:254nm計(jì)算色譜柱的柱效N理論塔板數(shù)計(jì)算公式：W s

方法Wtan 16 切線法Wh 5.54 半峰高W3s 9 3sW4s 16 4sW5s 25 5sInjectInject用“切線”法計(jì)算柱效不好的色譜柱的柱效反而比好色譜柱的要高，因?yàn)槠渫衔膊糠譁y不出來GoodColumnInjectInject用“5”法計(jì)算柱效色譜柱的正確使用及操作流動相的轉(zhuǎn)換特別是GPC柱流速(壓力)的變化幅度溫度的變化幅度專用色譜柱∶樣品及溶劑的要求正確使用色譜柱（一）樣品方面除去微粒及雜質(zhì)了解樣品在流動相中的溶解度如樣品的溶劑不是流動相，一定要用流動相試溶解度，防止其在流動相中析出

了解樣品與色譜柱的基質(zhì)/填料是否相互作用正確使用色譜柱（二）流動相方面除去微粒純度的要求超純水，梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)水中有機(jī)雜質(zhì)含量要低緩沖液的pH值，在填料的允許范圍內(nèi)緩沖液（鹽）的濃度溶劑：色譜純，并與填料相匹配溶劑中的雜質(zhì)含量流動相對樣品的溶解度有機(jī)溶劑或水的比例色譜柱的在線保護(hù)裝置給色譜柱提供物理的保護(hù)除去樣品及流動相中的顆粒給色譜柱提供化學(xué)的保護(hù)防止分析柱被化學(xué)污染裝置在線過濾器自裝填料保護(hù)柱預(yù)裝保護(hù)柱在線過濾器In-LineFilter，部件號WAT084560防止顆粒在色譜柱頭累積優(yōu)點(diǎn)：基本不影響柱效在需要高柱效的分析時(shí)中常用（如：氨基酸分析）可更換的消耗品更換濾芯，部件號WAT005139(5/pkgs)更換墊圈，部件號WAT084567(10/pkgs)保護(hù)柱可避免化學(xué)污染。多數(shù)保護(hù)柱影響到整個(gè)色譜柱的柱效，特別是在用微柱時(shí)保護(hù)柱的種類普通自裝填料的保護(hù)柱Waters的部件號，WAT084550，用戶自裝填料影響柱效同裝填技術(shù)有關(guān)，柱效降低較大Guard-Pak預(yù)裝保護(hù)柱Waters的部件號，WAT088141有各種填料的預(yù)裝柱供選擇，使用方便。填料容積較小，會引起柱效降低色譜柱的清洗對所做的樣品要有充分的了解用對該樣品洗脫能力最強(qiáng)的流動相清洗硅膠柱的一般方法先用甲醇洗去極性雜質(zhì)用干燥的二氯甲烷、正庚烷100~200ml依次活化鍵合相柱(烷基)的一般方法20倍柱體積的：甲醇-氯仿-甲醇-水依次沖洗色譜柱的存放存放前的處理除去雜質(zhì)、緩沖鹽合適的存放溶劑避免色譜柱床的干涸避免機(jī)械震動防止細(xì)菌生長注意存放的溫度色譜柱的故障與異常柱壓過高多少才算高?不同色譜柱有差異不同系統(tǒng)有差異不同溶劑有差異柱效低重復(fù)性差不出峰，回收率低柱壓過高為什么柱壓會過高微粒堵塞樣品流動相密封墊柱床膨脹不可逆吸附細(xì)菌生長柱效低為什么柱效低色譜柱被污染過濾片部分堵塞樣品、流動相或密封墊的細(xì)小顆粒造成的堵塞色譜柱內(nèi)的死體積流動相pH值及組成不合適造成固定相流失流速急劇變化造成固定相物理損壞機(jī)械震動造成柱床產(chǎn)生裂縫柱床收縮或干涸重復(fù)性差、回收率低實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差色譜柱被污染流動相pH值及組成不合適造成鍵合相流失樣品溶劑不同或樣品本身不穩(wěn)定回收率低，不出峰“不可逆”吸附固定相過強(qiáng)或流動相過弱非特異性吸附色譜柱以外的因素（一）“柱效”問題，不一定是色譜柱問題！系統(tǒng)連接問題：連接不好造成死體積進(jìn)樣器檢測器管路，連接口保護(hù)柱在線過濾器堵塞流動相問題：色譜柱未平衡好進(jìn)樣量太大色譜柱以外的因素（二）柱壓過高，不一定是色譜柱問題！系統(tǒng)反壓問題阻尼器堵塞進(jìn)樣器堵塞管路或連接口堵塞在線過濾器不干凈保護(hù)柱壓力傳感器不準(zhǔn)確流速是否錯(cuò)誤?色譜柱以外的因素（三）實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性差梯度實(shí)驗(yàn)時(shí)平衡時(shí)間不足溫度波動流動相組成改變樣品溶劑不同樣品穩(wěn)定性不好方法開發(fā)不好緩沖液的pH值不合適緩沖液的緩沖能力不足簡單的判別方法高的柱反壓是否伴隨著保留時(shí)間變化?峰形變壞?分辨率變壞?測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬典型的分析系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)小于100微升如大于此數(shù)應(yīng)檢查儀器系統(tǒng)測量色譜系統(tǒng)的譜帶展寬卸下色譜柱，用UNION(兩通)代替之按測柱效方法，以1/10的樣品濃度進(jìn)樣，大約2~5微升用5sigma方法測4.4%峰高處的峰寬：W儀器參數(shù)∶流速∶1.0ml/min紙速∶20cm/min(用記錄儀時(shí)，接檢測器10mV檔)檢測器靈敏度∶0.5-1.0AUFS(用記錄儀時(shí))檢測器時(shí)間常數(shù)∶小于0.2譜帶展寬（ml） =1000×W（cm）/20 （記錄儀）

=1000×W（min） （工作站）流動相及樣品的預(yù)處理液相色譜實(shí)用技術(shù)（三）液相色譜對流動相的要求除色譜柱對流動相對的要求外，還有∶與檢測器匹配脫氣避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度防止細(xì)菌的生長流動相的脫氣流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化流動相脫氣的方法加熱簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波簡單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度在線脫氣機(jī)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的除去微粒減少干擾雜質(zhì)濃縮微量的組份提高檢測的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于保護(hù)色譜柱及儀器樣品預(yù)處理的重要性占樣品分析時(shí)間的比例最大樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析消耗總成本的比重最大消耗大量的溶劑及其它化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素

是決定性的步驟樣品預(yù)處理的過程理想的樣品處理方法選擇性吸附去除干擾物在廣泛極性范圍內(nèi)，對酸性、堿性及中性物質(zhì)皆可獲得高而重現(xiàn)性的回收率容易實(shí)現(xiàn)自動化以獲得高樣品吞吐量簡單方法容易使用，耐受性好快速、經(jīng)濟(jì)樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取/液-液萃取Oasis

和Sep-Pak固相提取小柱其他去除微粒過濾過濾膜/過濾裝置有機(jī)(0.5μm)/無機(jī)(0.45μm)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000rpm超濾機(jī)理超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白有機(jī)溶劑乙腈，甲醇強(qiáng)酸三氯乙酸，過氯酸鹽50%硫酸銨10%TCA樣品衍生提高檢測的靈敏度增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測的靈敏度增加熒光基團(tuán)以便使用高靈敏度熒光檢測器改變分離的選擇性改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子氨基酸分析AccQ-Tag衍生法6-氨基喹啉濃縮樣品濃縮樣品的方法萃取/吹干沉淀/再溶解色譜法液固抽提

Oasis

小柱

Sep-Pak小柱固相萃取（SPE）技術(shù)固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技術(shù)開發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性實(shí)驗(yàn)室中60~80%的成本及工作量在樣品制備上縮短樣品的制備時(shí)間降低樣品前處理的成本提高分析的準(zhǔn)確性及回收率更容易自動化減少樣品處理步驟降低對不穩(wěn)定樣品的影響提高安全性全新的固相提取小柱Oasis

HLB親水-親脂平衡共聚物“親水”使填料具有水可浸潤性質(zhì)降低與水的接觸角“親脂”提供對被分析物質(zhì)的反相保留能力NO親水性單體∶

N-乙烯基吡咯烷酮親脂性單體∶

二乙烯基苯特征一，水濕性優(yōu)勢∶即使小柱在固相提取過程中干枯，也能吸附被分析物質(zhì)益處∶ 即使小柱在固相提取過程中干枯，也能獲得高回收率(>85%)提取板及小柱可獲得一致的回收率(RSD‘s<5%)容易使用Oasis

HLB固相提取小柱C18與Oasis

HLB吸附劑浸潤能力的比較HLHLHLHLHLHLLLLLLLLLLLLL

HLBH=親水單元L=親脂單元C18特征二，通用型吸附劑優(yōu)勢:

在很寬極性范圍內(nèi)保留酸性、堿性及中性化合物樣品不會穿透小柱益處:

對極性化合物可獲得較高回收率使用同一方法，提取藥物及其極性代謝產(chǎn)物可獲得高而重現(xiàn)性好的回收率一種吸附劑適用于大多數(shù)SPE提取過程