腎性高血壓大鼠模型的建立及改進(jìn)模型的建立

腎性高血壓大鼠模型的建立及改進(jìn)模型的建立

據(jù)報道，目前建立的高血壓模型主要是腎性高血壓大鼠模型。其中，兩腎i型大鼠血壓穩(wěn)定，手術(shù)成功率高，適合長期慢性實驗。因此，它是腎性高血壓大鼠模型的首選。但以往的2K1C型大鼠模型通常以腹部為開口途徑分離腎動脈,我們發(fā)現(xiàn),以腹部途徑開口制作的2K1C型大鼠模型易造成腎靜脈破裂,從而導(dǎo)致模型死亡率高。我們采用了背部作為開口途徑,此方法不僅容易找到腎臟,而且也很容易剝離腎動脈卻不致腎靜脈破裂,這在很大程度上降低了手術(shù)難度,保證了模型的成功率。1材料表面1.1動物健康SD雄性大鼠70只,SPF級,體重180~220g,購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心,合格證號0086880。1.2舒生物科技有限公司10%水合氯醛(天津科密歐化學(xué)試劑有限公司,批號20100920),注射用青霉素鈉(廣州瑞舒生物科技有限公司,批號20110421)。無菌針灸針,規(guī)格0.25mm×25mm(中國蘇州醫(yī)療用品公司),手術(shù)絲線,規(guī)格1/0和5/0(泰科醫(yī)療器材國際貿(mào)易有限公司),常規(guī)手術(shù)器械,BP-6大鼠無創(chuàng)血壓測量儀、BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。2方法2.1動物飼養(yǎng)及適應(yīng)性70只大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=15)和模型組(n=55)。各組大鼠均在廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心分籠飼養(yǎng),室溫20~26℃,日照12h,相對濕度40%~70%,通風(fēng)良好,飼喂普通顆粒飼料,自由飲水。手術(shù)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周,并在術(shù)前12h禁食不禁水。所有手術(shù)器械高壓蒸氣滅菌備用。2.2水合氯醛手術(shù)聯(lián)合麻醉10%水合氯醛(3.5mL·kg-1)ip麻醉大鼠,淺麻醉后大鼠俯臥位固定于手術(shù)臺上,于背部左腎處脫毛,暴露皮膚后用5%乙醇碘酒消毒,75%乙醇脫碘,然后于觸及浮肋即T13肋(大約為背部第3腰椎棘突水平)水平處開始,靠脊椎左側(cè)1cm處作平行于背部后正中線約1.5cm長的手術(shù)切口。開口后可立即看到左腎,用無齒手術(shù)鑷小心將其拉出,并用生理鹽水紗布包好推向左側(cè),此時在近腎門處可以明顯看到腎靜脈和腎動脈,腎動脈一般位于腎靜脈的上后方且極有韌性(辨別時可用無齒小彎鑷挑起來,此時呈透明色,放開后立即呈現(xiàn)紅色)。用無齒小彎鑷鈍性分離出左腎動脈(長度約0.5cm),然后穿入無菌絲線(規(guī)格為1/0),把直徑為0.25mm的針灸針與腎動脈血管長軸緊貼平行放置,然后用無菌絲線扎緊腎動脈和針灸針,以狹窄后左腎顏色變?yōu)椤皽\紅色”為宜,然后抽出針灸針,剪去多余的線頭,以青霉素鈉20萬單位沖洗預(yù)防感染,逐層縫合傷口,創(chuàng)口消毒處理并去除血跡,手術(shù)完成。假手術(shù)組除不放置針灸針和不用絲線緊扎外,其余手術(shù)操作均同上。術(shù)后連續(xù)3dim青霉素鈉10萬單位以防感染,并密切觀察皮膚切口、精神狀態(tài)及進(jìn)食進(jìn)水情況。注意事項:為保證麻醉效果,水合氯醛配制時間不超過4h;開口盡量小,便于縫合;以十字縫合,以免術(shù)后裂開感染。2.3血壓測定2.3.1造模前后血壓調(diào)查測量總體水壓造模前1周,觀察大鼠狀態(tài),測量血壓訓(xùn)練,以適應(yīng)環(huán)境。造模前3d連續(xù)測量血壓3次,取平均值。造模后3,7,14,21,28d測量血壓3次,取平均值。2.3.2大鼠血壓波的測量采用BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)測定大鼠清醒狀態(tài)下的尾動脈收縮壓。測量前打開電源預(yù)熱30min,然后將大鼠小心裝入專用鼠籠,直至大鼠不能隨意移動為宜,然后將鼠尾套袖放置于鼠尾的根部并固定,關(guān)閉箱門預(yù)熱。觀察脈搏信號,待波形均勻穩(wěn)定后,啟動自動充氣功能,顯示屏脈搏信號波形逐漸變小直至消失,當(dāng)尾部重新出現(xiàn)脈搏時,選第一個描記波峰讀取大鼠的收縮壓數(shù)值,重復(fù)以上操作3次,取平均值。注意事項:測壓過程動作要輕柔,不能激惹大鼠而引起血壓波動;尾套尺寸要合適并要固定緊,以免大鼠掙脫而影響血壓;室溫要恒定,避免對血壓造成影響。2.3.3大鼠正常血壓大鼠血壓pa選取收縮壓85~155mmHg(1mmHg=0.133kPa)的正常血壓大鼠。造模后,定時測量血壓,當(dāng)大鼠收縮壓比手術(shù)前高20mmHg(或>正常血壓3個標(biāo)準(zhǔn)差)以上且同時>140mmHg,確定為2K1C高血壓模型成功。2.4一般行為觀察每周1次觀察大鼠體重、活動、神情、毛發(fā)、大小便等狀況。觀察存活率和成模率。2.5統(tǒng)計處理3結(jié)果3.1急性腎功能衰感染本實驗研究觀測到4周末,有64只大鼠存活,其中4只麻醉過深導(dǎo)致死亡;1只術(shù)后1h內(nèi)死亡,考慮為結(jié)扎不當(dāng)造成急性腎功能衰竭;1只于術(shù)后1周內(nèi)感染死亡。術(shù)后4周有3只血壓上升<30mmHg,模型組存活率和成模率分別為94.5%,89.1%,假手術(shù)組分別為80.0%,80.0%。3.2延長血壓上升與假手術(shù)組比較,模型組在造模后3d收縮壓開始升高,以后隨時間延長血壓逐步上升,至21,28d達(dá)峰值并趨于穩(wěn)定。自造模3d起,各時點與假手術(shù)組具有顯著性差異(P<0.05)。見表1。3.3同籠大鼠的生長與假手術(shù)組大鼠相比,模型組大鼠精神較緊張,易激惹,同籠大鼠間時常有打斗現(xiàn)象,且大鼠毛色無光澤,局部脫落較多,小便色清量多,抓持時遺尿現(xiàn)象較普遍,大便質(zhì)軟甚至稀便,腐臭味明顯。4腎動脈狹窄模型高血壓動物模型是研究高血壓病發(fā)生發(fā)展機制的重要途徑。根據(jù)發(fā)病原因可將高血壓動物模型分為原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類,原發(fā)性動物模型以SHR為主,此類模型價格昂貴,運輸途徑中很容易死亡,而且在中醫(yī)證型上與繼發(fā)性動物模型有所不同;根據(jù)造模方法的不同,又可將繼發(fā)性動物模型分為藥物性和腎性高血壓模型。現(xiàn)代研究表明,腎性高血壓模型是應(yīng)用最為廣泛的高血壓動物模型,復(fù)制方法主要有幾種:1K1C(一側(cè)腎動脈狹窄,另一側(cè)腎切除),2K1C(一側(cè)腎動脈狹窄,另一側(cè)腎保留)和2K2C(雙腎動脈均狹窄)。狹窄腎動脈的方法眾多,有用套管、U型銀夾、有機玻璃夾或絲線結(jié)扎等方法。我們經(jīng)過反復(fù)實踐,最后采用從背部開口以手術(shù)絲線結(jié)扎左腎動脈來制作2K1C大鼠模型。實驗結(jié)果表明,模型組大鼠存活率達(dá)94.5%,成模率達(dá)89.1%,本實驗采用的經(jīng)改良2K1C高血壓大鼠的制作方法效果良好。傳統(tǒng)的2K1C型高血壓模型均采用腹部開口,并以一特定直徑的U型銀夾導(dǎo)致左腎動脈狹窄。我們發(fā)現(xiàn),以腹部為開口長度需5cm左右,而背部開口只需1.5cm左右,可減少縫合傷口時間;以腹部開口找腎動脈前,需翻轉(zhuǎn)胃腸等腹內(nèi)臟器顯露后腹膜,破壞腹膜后方能暴露腎動脈,創(chuàng)傷大且易造成腹腔感染,而背部開口后立即顯露出腎臟,輕輕拉出腎臟后很容易就可以找到腎動脈;最后,由于大鼠腎門處動、靜脈被同一血管鞘包被,腹部開口時腎動脈不易剝離,很容易造成腎靜脈或腎臟破裂而導(dǎo)致造模失敗,而選擇背部開口就避免了這一缺點。另外,由于銀夾很不易獲得,而血管個體差異大,其直徑難以控制,造模過程中很容易造成狹窄過度或狹窄過松而導(dǎo)致造模成功率下降;且造模5周后血壓開始下降,血壓不穩(wěn)定,而用絲線結(jié)扎,不僅材料容易獲得,而且絲線沒有伸縮性