溶菌酶的制備原理和操作方法

溶菌酶的制備原理和操作方法實(shí)驗(yàn)概要

本實(shí)驗(yàn)介紹了溶菌酶（lysozyme）的制備及其性質(zhì)測(cè)定的原理和操作方法。

實(shí)驗(yàn)原理

溶菌酶（lysozyme）是由弗萊明在1922年發(fā)現(xiàn)的，它是一種有效的抗菌劑，全稱為

1，4-β-N-溶菌酶，又稱作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁質(zhì)酶。活性中心為天冬氨酸52和谷氨酸35，是一種糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-

乙酰氨基葡萄糖（NAG）與N-乙酰胞壁酸（NAM）間的β-1，4糖苷鍵，相對(duì)分子質(zhì)量14700Da，由129氨基酸殘基構(gòu)成，由于其中含有較多堿性氨基酸殘基，所以其等電點(diǎn)高達(dá)10.8左右，最適溫度為50度，最適PH為6～7左右。在280nm的消光系數(shù)為

13.0。該酶活性可被一些金屬離子Cu2，F(xiàn)e2，Zn2（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2,Ca2（10-5～10-3M）、NaCl所激活。

溶菌酶廣泛存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)，雞蛋(含量約為2%～4%)和哺乳動(dòng)物的乳汁是溶菌酶的主要來(lái)源，目前，溶菌酶仍屬于緊銷(xiāo)的生化物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床，具有抗感染、消炎、消腫、增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)等多種藥理作用。

溶菌酶常溫下在中性鹽溶液中具有較高天然活性，在中性條件下溶菌酶帶正電荷，因此在分離制備時(shí)，先后采用等電點(diǎn)法，D152型樹(shù)脂柱層析法除雜蛋白，再經(jīng)Sephadex

G-50層析柱進(jìn)一步純化。最后用SDS鑒定為一條帶。采用福林酚法測(cè)蛋白含量，分光光度法測(cè)定酶活性。

主要試劑

1.雞蛋清（鮮雞蛋）

2.底物微球菌粉

3.D152大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂

4.固體氯化鈉（NaCl）

5.固體硫酸銨(NH4)2SO4

6.固體磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）

7.固體磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）

8.固體磷酸鈉（Na3PO4）

9.乙醇；蒸餾水；甲醇；考馬斯亮藍(lán)；三氯/醋酸；丙酮

10.溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品；SephadexG50

11.N-乙酰葡萄糖胺；硫酸銅；硫酸亞鐵；硫酸鋅；氯化鎂；氯化鈣；氫氧/化鈉；鹽酸

12.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑;蛋白含量測(cè)定（福林法）試劑

13.聚乙二醇-20000、兩性電解質(zhì)

主要設(shè)備

1.循環(huán)水式真空泵HSB-IⅡ

2.蛋白紫外檢測(cè)儀

3.記錄儀

4.紫外分光光度計(jì)

5.梯度混合器(500mL);

6.721型光分光光度計(jì)

7.冰凍離心機(jī)

8.冰箱

9.透析袋

10.酸度計(jì)

11.部分收集器

12.恒流泵

13.圓盤(pán)電泳裝置

14.恒溫水浴鍋

15.層析柱(2.6×1250px)(1.6×750px)

16.布氏漏斗(500mL)

17.吸濾瓶(1000mL)

18.G-3砂芯漏斗(500mL)

實(shí)驗(yàn)步驟

1.蛋清的制備

將4～5個(gè)新鮮的雞蛋兩端各敲一個(gè)小洞，使蛋清流出（雞蛋清pH值不得小于8），輕輕攪拌5分鐘，使雞蛋清的稠度均勻，用兩層紗布過(guò)濾除去臍帶塊，量體積約為100ml.

2.雞蛋清粗分離

按過(guò)濾好的蛋清量邊緩慢攪拌邊加入等體積的去離子水，均勻后在不斷攪拌下用1mol/LHCl調(diào)pH值至7左右，用脫脂棉過(guò)濾收濾液。

3.D152大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂層析

1)D152樹(shù)脂處理：將D152樹(shù)脂先用蒸餾水洗去雜物，濾出，用1mol/LNaOH攪拌浸泡并攪拌4～8小時(shí)，抽濾干NaOH,

用蒸餾水洗至近pH7.5,抽濾干,再用1mol/LHCl按上述方法處理樹(shù)脂，直到全部轉(zhuǎn)變成氫型，抽濾干HCl,

用蒸餾水洗致近pH5.5，保持過(guò)夜，如果pH之不低于5.0，抽濾干HCl,用2mol/LNaOH處理樹(shù)脂使之轉(zhuǎn)變?yōu)殁c型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.5

0.02mol/L的磷酸鹽緩沖液平衡樹(shù)脂。

2)

裝柱：取直徑40px，長(zhǎng)度為750px的層析柱，自頂部注入經(jīng)處理的上述樹(shù)脂懸浮液，關(guān)閉層柱出口，待樹(shù)脂沉降后，放出過(guò)量的溶液，再加入一些樹(shù)脂，至樹(shù)脂沉積至15～500px高度即可。于柱子頂部繼續(xù)加入

pH6.5,0.02mol/L磷酸鹽緩沖液平衡樹(shù)脂，使流出液pH為6.5為止，關(guān)閉柱子出口，保持液面高出樹(shù)脂表面25px左右。

3)上柱吸附：將上述蛋清溶液仔細(xì)直接加到樹(shù)脂頂部，打開(kāi)出口使其緩慢流入柱內(nèi)，流速為1ml/min。

4)洗脫：用柱平衡液洗脫雜蛋白，在收集洗脫液的過(guò)程中，逐管用紫外分光光度計(jì)檢驗(yàn)雜蛋白的洗脫情況，當(dāng)基線開(kāi)始走平后，改用含1.0mol/LNaCl的pH值6.5，濃度為0.02mol/L磷酸鈉緩沖液洗脫，收集洗脫液。

5)聚乙二醇濃縮：將上述洗脫液合并裝入透析袋內(nèi)，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加蓋，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。當(dāng)濃縮到5mL左右時(shí)，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出濃縮液。

6)透析除鹽：蒸餾水透析除鹽24小時(shí)。

4.SephadexG50分子篩柱層析

1)裝柱：先將用20%乙醇保存的SephadexG50抽濾除去乙醇，用6g/LNaCl溶液攪拌Sephadex

G50數(shù)分鐘，再抽濾，反復(fù)多次直至無(wú)醇味為此。(如果SephadexG50是新的，則按實(shí)驗(yàn)五中的方法處理凝膠)。加入膠體積1/4的6g/L

NaCl溶液，充分?jǐn)嚢?，超聲除去氣泡，裝入玻璃層析柱（1.6×1250px），柱床1125px。

2)上樣。

3)洗脫:樣品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl洗脫液洗下柱壁上的樣品，連接恒流泵，使流速為0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分鐘一管。

4)聚乙二醇濃縮：合并活性峰溶液，用聚乙二醇濃縮到5mL左右時(shí)，用蒸餾水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出濃縮液。

5)透析除鹽:蒸餾水透析除鹽24小時(shí)。收集透析液，量取體積。

5.溶菌酶活力測(cè)定

1)酶液配制：準(zhǔn)確稱取溶菌酶樣品5mg,用0.1mol/L,pH6.2磷酸緩沖液配成1mg/ml的酶液，再將酶液稀釋成50?g/ml。

2)底物配制：取干菌粉5mg加上述緩沖液少許，在乳缽中（或勻漿器中）研磨2分鐘，傾出，稀釋到15～25ml，此時(shí)在光電比色上的吸光度最好在0.5～0.7范圍內(nèi)。

3)活力測(cè)定：先將酶和底物分別放入25度恒溫水浴預(yù)熱10分鐘，吸取底物懸浮液4mL放入比色杯中，在450nm波長(zhǎng)讀出吸光度，此為零時(shí)讀數(shù)。然后吸取樣品液0.2mL（相當(dāng)于10?g酶），每隔30s讀1次吸光度，到90s時(shí)共計(jì)下四個(gè)讀數(shù)。

活力單位的定義是：在25℃，pH6.2，波長(zhǎng)為450nm時(shí)，每分引起吸光度下降0.001為1個(gè)活力單位。

酶的活力單位數(shù)=△A450nm/t×0.001

比活力=酶的活力單位數(shù)/mg蛋白質(zhì)

6.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Folin-酚試劑法進(jìn)行測(cè)定。

7.純度檢測(cè)

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳方法。

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