生防細(xì)菌側(cè)孢短芽孢桿菌的分離鑒定及其對病原真菌的拮抗作用

生防細(xì)菌側(cè)孢短芽孢桿菌的分離鑒定及其對病原真菌的拮抗作用

植物原生植物是植物的一個重要源植物。這種大規(guī)模的襲擊給農(nóng)業(yè)和食品生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重危害。隨著人們對環(huán)境問題的日益重視,探索可持續(xù)發(fā)展的、有效的生物防治措施已成為植物病害綜合治理中的重要課題。土壤是微生物的天然培養(yǎng)基,生存著許多具有復(fù)雜相互作用的微生物,它們共同構(gòu)成了無比豐富的菌種資源庫。微生物的拮抗通常指微生物通過產(chǎn)生特定代謝產(chǎn)物,尤其是抗生素類物質(zhì)而抑制其他微生物的生長甚至殺死它們的一種相互關(guān)系。充分考慮到植物與微生物之間的相互作用關(guān)系,通過對根際土壤中的微生物進行篩選,有望獲得具有良好定殖能力的微生物菌株,接種后能在植物根系周圍長期發(fā)揮特定的生防作用。作物長期連作后,土壤微生物種群會發(fā)生明顯變化。關(guān)于連作障礙的調(diào)查研究表明,土傳病害是引起連作障礙的主要因子之一。經(jīng)驗證,微生物自身所產(chǎn)生的酶具有一定的生防效果,尤其是胞外蛋白酶對土壤病害和線蟲都具有顯著的抑制和殺滅效果。本研究從山東泰安各種類型土壤中,分離篩選出一株生防效果較好的細(xì)菌,對其進行形態(tài)學(xué)、生理生化特征和分子鑒定,并進一步探究其生物學(xué)特性和抗菌譜,為開發(fā)利用微生物資源,篩選與環(huán)境相容性好的微生物生防菌劑奠定基礎(chǔ)。1材料和方法1.1菌株來源藥物、微生物生防細(xì)菌AMCC100017由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境微生物研究室分離、鑒定并保藏。植物病原真菌:串珠鐮刀菌(Fusariummoniliforme)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)、腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)、層出鐮刀菌(Fusariumproliferatum)、水稻紋枯病菌(Rhizoctoniasoloni)、蘆筍莖枯病菌(Phomopsisasparagi)、小麥根腐病菌(Helminthosporiumsativum)、小麥曲根霉(Rhizopustriticisp.)、小麥紋枯病菌(Rhizoctoniacerealis)、黃瓜炭疽病菌(Colletotrichumlagenarium)、蘋果輪紋病菌(Physalosporapiricola)和桃根霉病菌(Rhizopussp.)均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境微生物研究室保藏。1.2培養(yǎng)基牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NA)、LB培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基配方見《微生物學(xué)實驗》。1.3土樣的制備從山東泰安林地、果園和農(nóng)田采集地表下5-10cm處土樣,采用平板稀釋分離法涂布,28°C培養(yǎng)1-2d。根據(jù)單菌落大小、表面結(jié)構(gòu)、質(zhì)地、光澤和顏色等特征,挑取菌落形態(tài)差異明顯的單菌落,純化后斜面保存。1.4平板對稱法以串珠鐮刀菌和尖孢鐮刀菌作為靶標(biāo)篩選拮抗菌,采用平板對峙法,每處理3次重復(fù)。30°C培養(yǎng)3-5d后,根據(jù)抑菌帶的大小,選擇拮抗效果好的菌株進入下一輪復(fù)篩,進一步確定抑菌效果最佳的分離菌株。1.5抗感染藥物的分類和評價1.5.1菌落形態(tài)特征參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的形態(tài)學(xué)指標(biāo),記錄菌落形態(tài)、光學(xué)顯微形態(tài)并拍攝透射電鏡照片(37°C平板培養(yǎng)24h,透射式電子顯微鏡型號:JEM-1200EX),以確定其形態(tài)特征。1.5.2菌株生理生化指標(biāo)測定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》中的生理生化鑒定指標(biāo),對待測菌株進行V-P試驗、M.R試驗、耐鹽性試驗、接觸酶試驗、糖醇發(fā)酵試驗、淀粉水解和明膠液化等生理生化指標(biāo)測定。1.5.3細(xì)菌基因組dna的提取將待測菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,37°C、180r/min搖床過夜培養(yǎng),12000r/min離心收集菌體,用試劑盒(北京天根生物科技有限公司)提取細(xì)菌基因組DNA。使用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′)和1492R(5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3′)對提取的基因組DNA進行PCR擴增1.6生長曲線測定37°C搖床培養(yǎng)不同時間后,通過比色法,在600nm波長下測定OD值,以時間為橫坐標(biāo),OD值為縱坐標(biāo)作圖,繪出待測菌株的生長曲線。1.7接種病原菌和分離病原菌的培養(yǎng)采用平板對峙法,分別用菌塊和菌懸液,在新鮮的PDA固體培養(yǎng)基上距中心3cm的兩個對稱點處接種病原菌和分離到的拮抗菌,用只接病原菌的平板做對照。30°C培養(yǎng),待對照組長滿整個培養(yǎng)基平板后,測量實驗組病原菌生長半徑r,對照組半徑為培養(yǎng)皿內(nèi)半徑r0,利用公式:抑菌率=(r0-r)/r0,通過比較抑菌率的大小來評價抗病菌的拮抗性能。1.8蛋白酶活測定37°C搖床培養(yǎng)待測菌株,取不同時間發(fā)酵液,采用福林酚法,按照國標(biāo)GB/T23527-2009測定蛋白酶活,酶活定義:1mL發(fā)酵液在40°C和pH10.5條件下,1min水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸,即為1個酶活力單位。L-酪氨酸溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。2結(jié)果與分析2.1抑菌圈檢測從山東泰安林地、果園和農(nóng)田土壤中共分離、篩選得到48株細(xì)菌,其中具有拮抗效果的12株,效果較明顯的5株,編號為B1-B5,其中菌株B2產(chǎn)生的抑菌圈最大。將B2按菌種保藏編號定為AMCC100017,進一步進行系列鑒定工作。2.2鑒定結(jié)果：植物鑒定1000172.2.1菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果菌株AMCC100017在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)不同,在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和LB上菌落都為黃褐色,扁平,邊緣光滑,中央突起,LB上形成的菌落略大;而在PDA上菌落為乳白色,邊緣鋸齒狀,中央突起,表面不光滑,菌落直徑明顯比在前兩個培養(yǎng)基上大,呈花狀。光學(xué)顯微鏡染色觀察,菌株AMCC100017細(xì)胞桿狀,大小(0.5-1.0)μm×(2.0-5.0)μm,芽孢側(cè)生。革蘭氏染色結(jié)果可變,對數(shù)期時染色結(jié)果為陽性,穩(wěn)定期時變?yōu)殛幮浴Ｍ干潆婄R結(jié)果如圖2所示,圖2A、B為菌體形態(tài),圖2C為形成中的芽孢。2.2.3srrna基因文庫建立經(jīng)DNA提取,PCR擴增和測序獲得的16SrRNA基因的片段長度為1447bp,在GenBank上進行BLAST比對,得出該菌株與側(cè)孢短芽孢桿菌序列相似性達(dá)到99%。從GenBank中調(diào)取側(cè)孢屬不同種的11株標(biāo)準(zhǔn)菌株的16SrRNA基因序列,構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹,結(jié)果顯示(圖3)菌株AMCC100017與側(cè)孢短芽孢桿菌的同源關(guān)系最近,提交序列后獲得的登錄號為KJ476903。結(jié)合形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果,確定菌株AMCC100017為Brevibacilluslaterosporus,中文名稱側(cè)孢短芽孢桿菌。2.3菌株amcc300017的生長特性測定細(xì)菌生長曲線,可為該菌株的進一步培養(yǎng)和發(fā)酵利用提供依據(jù)。由圖4可知,菌株AMCC100017在0-6h為延滯期,6-16h為指數(shù)期,18h以后進入穩(wěn)定期。指數(shù)期的生長速率常數(shù)最大,代時最短,組成均一,酶系活躍;穩(wěn)定期菌體生長速率常數(shù)為0,菌體產(chǎn)量達(dá)到最大,鏡檢開始出現(xiàn)芽孢。2.4種供試病原菌真菌的抑菌效果從表2中可以看出,AMCC100017對提供的幾種供試病原真菌均顯示出一定的抑制作用,其中對鐮刀菌屬、絲核菌等有明顯的抑菌圈,部分抑菌效果如圖5-7所示。說明該菌是一種廣譜的拮抗菌,具有潛在應(yīng)用價值。2.5表1:表4采用福林酚法測定蛋白酶活力,發(fā)酵液酶活力結(jié)果如表3所示。由表3可以看出,在營養(yǎng)充足的條件下,菌株AMCC100017的發(fā)酵液中蛋白酶活力隨發(fā)酵時間增加而升高,數(shù)據(jù)顯示其產(chǎn)蛋白酶能力較強。3菌株篩選及活性成分的確定1996年Shida等通過Bacilluslaterosporus的16SrRNA基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建研究,把其歸類為短芽孢桿菌屬(Brevibacillus),并命名為側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)。本實驗篩選出的細(xì)菌AMCC100017經(jīng)形態(tài)學(xué)、生理生化及16SrRNA基因序列分析,鑒定為側(cè)孢短芽孢桿菌,經(jīng)抗菌譜和酶活測定,初步驗證了該菌株是一種具有應(yīng)用潛力的生防菌。目前國內(nèi)外關(guān)于側(cè)孢短芽孢桿菌抑菌及殺線蟲作用的研究越來越活躍。如趙秀香等從煙草根際土壤中,分離到一株生防菌側(cè)孢短芽孢桿菌B8,其發(fā)酵液對煙草黑脛病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)顯示了較強的抑制作用;SONGZ.等從蘋果根際中分離到側(cè)孢短芽孢桿菌ZQ2,能產(chǎn)生廣譜抗性的抑真菌活性物質(zhì),并對其發(fā)酵條件進行了優(yōu)化;Saikia等從熱泉水中分離到側(cè)孢短芽孢桿菌BPM3,可強烈抑制植物致病真菌和革蘭氏陽性細(xì)菌的生長;Prasanna等在紅樹林沼澤土壤中分離出的側(cè)孢短芽孢桿菌所產(chǎn)生的胞外幾丁質(zhì)酶,具有殺真菌活性和殺線蟲活性。本實驗室分離的菌株AMCC100017對參試的幾種病原真菌都顯示了不同程度的拮抗效果,尤其對尖孢鐮刀菌、小麥紋枯病菌、黃瓜炭疽病菌以及腐皮鐮刀菌等效果明顯,經(jīng)進一步的優(yōu)化和開發(fā),有望對有效消除相應(yīng)作物、蔬菜等的真菌病害做出貢獻。蘋果是中國北方廣泛種植的果樹品種,再植障礙是目前蘋果減產(chǎn)的主要原因之一。對蘋果再植造成危害的真菌主要有絲核屬(Rhizoctonia)、鐮刀霉屬(Fusarium)、腐霉屬(Pythium)、疫霉屬(Phytophthora)、柱盤孢屬(Cylindrocarpon)等。本實驗室分離的菌株AMCC100017所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有廣譜拮抗性,尤其是對鐮刀菌屬和絲核病屬致病菌拮抗效果明顯。因此,側(cè)孢短芽孢桿菌AMCC100017可能對有效解除蘋果再植障礙具有潛在應(yīng)用價值。Singer等的研究發(fā)現(xiàn)側(cè)孢短芽孢桿菌對于某些甲蟲類昆蟲、線蟲和軟體動物都具有毒性作用;Huang等分離到一株不產(chǎn)伴孢晶體的側(cè)孢短芽孢桿菌G4,有很高的抗線蟲活性,病理學(xué)觀察結(jié)果說明,G4菌株純化的胞外蛋白酶直接導(dǎo)致了線蟲表皮的破壞。本研究對菌株AMCC100017蛋白酶活的測定結(jié)果,顯示其蛋白酶活性高,預(yù)測其可望對作物線蟲的生物防治發(fā)揮特定的作用。另外