油菜灰潮土菌核盤菌生防制劑的制備及盆栽試驗

油菜灰潮土菌核盤菌生防制劑的制備及盆栽試驗

黃瓜核菌病是由富含油的真菌性疾病引起的真菌性疾病之一。核盤菌的初侵染源主要是混有菌絲的土壤、殘秸和種子。在溫、濕度適宜條件下,菌核萌發(fā)長出子囊盤和子囊孢子,成熟后子囊孢子從子囊內噴出,隨氣流傳播,侵染花瓣和老葉。帶病的花瓣和老葉與健莖、健葉接觸后侵染,隨即引發(fā)水腐,以后又通過莖葉接觸而拓展蔓延,最終在油菜莖稈中形成菌核。近年來,由于氣候影響、品種繁雜、栽培管理粗放、施肥水平提高等原因,油菜菌核病危害更加嚴重。菌核病主要危害油菜莖稈,引起植株早枯,角果減少,種子皺癟,千粒重和含油量降低,產量下降。據典型田塊調查和大田普查,常年株發(fā)病率高達10%～30%,嚴重的達70%以上,極大地影響油菜產量和品質。長期以來,油菜菌核病防治主要采用農業(yè)防治、化學防治等綜合防治的方法,雖然對生物防治的研究報道較多,但大部分研究結果仍然停留在實驗室階段,對于利用生防細菌防治的研究主要為篩選試驗,對其防病機理缺乏深入研究,研究結果很少有廣泛應用于田間大面積防治的報道;從保護農業(yè)環(huán)境和提高食品安全的內在需要出發(fā),生物防治前景廣闊。目前國內外在生物防治油菜菌核病方面,對盾殼霉和綠色木霉進行了較廣泛的研究并得到一定程度的應用,經盾殼霉處理后的菌核埋在土壤中,可以致腐和被分解。本研究分別從灰潮土中分離到3株生防真菌,能夠抑制油菜菌核的萌發(fā)。它們分別是短帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)Sco-1、哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)Tri-1和棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)Asp-1。除短帚霉為條件性致病菌外,其它2個菌株能在盆栽試驗和生防制劑中使用。它們能促使菌核失活,從而達到生防的目的。1材料和方法1.1作物品種的采集油菜菌核的采集:油菜收獲后,從武漢(E113°41′,N29°58′)田間被油菜菌核病侵害的油菜莖稈中采集菌核,風干、室溫貯藏備用。盆栽試驗用作物品種:油菜品種為“中雙11”,芝麻品種為“中芝426”,水稻品種為“T優(yōu)180”。土壤的采集:在武漢種植油菜的田塊(E113°41′,N29°58′)采集2～10cm的耕作層土壤,土壤類型為灰潮土。共采5個點,每點2～3kg,風干后混合均勻,用于分離生防真菌。1.2菌落、菌核消毒及回接菌核復合培養(yǎng)設4個處理:(1)土壤未滅菌、菌核表面未消毒;(2)土壤未滅菌、菌核表面消毒(0.1%升汞消毒3min,再在無菌水中連續(xù)漂洗7次);(3)土壤滅菌(121℃,30min)、菌核表面未消毒;(4)土壤滅菌、菌核表面消毒。每處理所用培養(yǎng)皿直徑為18cm,加入一定量的無菌水,土壤最終含水達到65%～70%,每皿放入油菜菌核30粒,蓋上培養(yǎng)皿;在培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)2周,誘捕抑制油菜菌核的真菌。2周后,無菌條件下將菌核上生長出的真菌挑入PDA培養(yǎng)基上,25℃下培養(yǎng)1周,然后再用PDA重復純化一次。用無菌的生理鹽水將純化的菌株配成1×103個/mL孢子懸浮液,每個菌核滴加0.01mL,采用滅菌土壤和表面消毒的菌核進行回接。將仍具有分解菌核和抑制萌發(fā)能力的菌株送往中國農業(yè)科學院菌種保藏中心鑒定。1.3菌種培養(yǎng)與實驗用無菌生理鹽水將鑒定后的菌株孢子配成1×103個/mL孢子懸浮液,在每個表面消毒的菌核上滴加0.01mL,放入盛有無菌土壤的培養(yǎng)皿(直徑為18cm)中。加入無菌水使土壤含水達到65%～70%。每皿放入滴加孢子懸浮液的菌核30粒,蓋上培養(yǎng)皿。每菌株實驗重復3次。在培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)2周后,菌核用0.1%升汞消毒3min,無菌水連續(xù)漂洗7次,接種到PDA培養(yǎng)基22℃下培養(yǎng)4d后觀察菌核的萌發(fā)率,計算生防菌株的致死率(即1-萌發(fā)率%)。1.4生防制劑的制備豆餅40%、粉碎的油菜秸稈60%,混合均勻,加自來水,最終含水量為40%,裝入2000mL燒杯中,每杯裝1.5kg,封口滅菌(121℃,30min)。冷卻后,在無菌條件下分別接種哈茨木霉菌和棘孢曲霉,接種量為1×103個/mL孢子懸浮液10mL,25℃培養(yǎng)1周,每隔2d翻動1次。培養(yǎng)結束后,在潔凈的環(huán)境條件下自然風干,最終生防制劑的孢子含量為≥1×106個/g。然后將兩個菌株的固體發(fā)酵物按1∶1混合均勻,在室溫下貯藏備用。0.2g生防制劑加入0.5kg無菌土壤中混勻,放入培養(yǎng)皿(直徑為18cm),加入無菌水使土壤最終含水達到65%～70%,放入表面消毒的菌核30粒。重復3次。在培養(yǎng)箱中25℃培養(yǎng)2周后,菌核用0.1%升汞消毒3min,無菌水連續(xù)漂洗7次,接種到PDA培養(yǎng)基22℃培養(yǎng)4d后觀察菌核的萌發(fā)率,計算生防制劑的致死率(即1-萌發(fā)率%)。1.5試驗設備和方法模擬武漢地區(qū)油菜前作芝麻(旱地)或水稻(水田)制度,在盆栽土中試驗生物制劑的生防效果。盆土為灰潮土(pH7.2,有機質11.3g/kg,堿解氮143.2mg/kg,速效磷24.2mg/kg,速效鉀102.5mg/kg),盆缽(直徑21cm,高20cm)。裝土之前,將尿素0.9g、KH2PO41.4g和KNO31.1g溶解在200mL自來水中,倒入5kg土壤中,混合均勻后裝入盆缽中。種植水稻的盆缽在使用前封閉底部。用尼龍網袋5×5cm裝入20顆油菜菌核病菌核,將尼龍小網袋埋入盆缽中,每個盆缽2袋,網袋之間的距離8cm,埋入深度約1～2cm左右,做好位置標記。施生防制劑的處理在每個盆缽表面均勻地施入2.0g生防制劑。然后分別種植芝麻和水稻。試驗從2009年5月22日到7月21日在本所露天盆栽場進行,日平均溫度約29℃。水稻盆栽保持表面水深0.5～1.0cm,每隔15d讓盆栽表面無水1d,每盆種植5株;芝麻盆栽每隔2d澆水1次,每盆種植2株,種植60d。試驗設4個處理,芝麻加生防制劑、芝麻不加生防制劑(旱作對照)、水稻加生防制劑和水稻不加生防制劑(水田對照),每個處理種植5盆。60d后,取出所有尼龍網袋的菌核,用0.1%升汞消毒3min,無菌水連續(xù)漂洗7次,放入PDA上22℃培養(yǎng)4d后觀察菌核的萌發(fā)率。1.6試驗方法和設計水稻和芝麻盆栽收獲后,自然風干盆缽中的土壤,取出土壤破碎(以類同大田翻耕)。盆缽再次裝土之前,將尿素2.0g、K2HPO41.0g、KCl0.25g和硼酸0.05g溶解在200mL自來水中,倒入破碎的土壤中,混合均勻后裝回盆缽中,同時將尼龍小網袋埋入盆缽,每袋20顆菌核,每盆2袋,網袋之間的距離為8cm,埋入深度1～2cm,做好位置標記。施用生防制劑的處理為每個盆缽表面均勻施入2.0g生防制劑(加強接種)。試驗從2009年9月8日到11月7日在本所露天盆栽場進行,日平均溫度約27℃。每隔1d澆水1次,每盆種植3株,種植60d。試驗設4個處理:加生防制劑種植芝麻后的土壤再加生防制劑種植油菜、未加生防制劑種植芝麻后的土壤仍不加生防制劑種植油菜(對照)、加生防制劑種植水稻后的土壤再加生防制劑種植油菜、未加生防制劑種植水稻后的土壤仍不加生防制劑種植油菜(對照),每個處理種植5盆。播種油菜60d后,取出所有尼龍小網袋的菌核,用0.1%升汞消毒3min,無菌水連續(xù)漂洗7次后接種到PDA上,22℃培養(yǎng)4d后觀察菌核的萌發(fā)率。2結果與分析2.1面消毒菌核的生長誘捕2周后,未滅菌土壤與表面消毒菌核、未滅菌土壤與表面未消毒菌核這兩個處理中從油菜菌核表面分別分離到4株和3株不同種類的真菌;其它兩處理未能誘捕到任何真菌,表明以上真菌來自土壤而非菌核。7株菌株純化后回接到表面消毒的菌核上,僅有Sco-1(圖1,20d,從土壤中取出被分解的菌核)、Tri-1和Asp-1能在菌核生長(圖2,14d,為土壤中的狀況)。20d時從土壤中取出菌核,少數菌核破碎,大多數菌核變軟,表面長有大量孢子,顯示已經被分解(圖3)。經鑒定,這三個菌株分別屬于短帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)、哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)和棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)。與油菜菌核25℃共培養(yǎng)2周后,Sco-1、Tri-1和Asp-1的致死率分別為95.6%、78.9%和83.3%。用Tri-1和Asp-1制作成的生防制劑則有78.5%的致死率。2.2不同類型農田盆土生防制劑對菌核萌發(fā)的影響芝麻(旱作)和水稻(水田)生長60d后菌核的萌發(fā)率發(fā)生了變化(表1)。施入生防真菌哈茨木霉菌Tri-1和棘孢曲霉Asp-1的生防制劑,旱作和水田盆土中的菌核萌發(fā)率平均分別為50.0±9.1%和30.7±6.4%,分別比不施生防制劑的對照(萌發(fā)率分別為旱作77.3±9.5%,水田68.7±6.9%)下降27.3%和38.0%。表明種植水稻的水田盆土中生防制劑的處理效果明顯好于種植芝麻的旱作處理,初步說明水田中施用生防制劑后,生防菌分解核盤菌菌核的效果好于旱地。初步說明水田中施用生物肥料更好。2.3生防制劑對盆土菌核萌發(fā)的影響經過芝麻(旱地)種植和水稻(水田)種植后的土壤,繼續(xù)種植油菜60d后,所埋菌核的萌發(fā)率降低程度不同。在土壤加生防制劑分別種植芝麻和水田后的土壤上再種植油菜,施加生防制劑后的盆土中菌核萌發(fā)率平均分別為42.5%±9.2%和29.9%±6.0%,分別比不施生防制劑的對照(芝麻盆土中的58.6%±13.4%,水稻盆土中48.2%±7.1%)下降16.1%和18.3%。說明芝麻和水稻盆栽的土壤中添加生防制劑,菌核的萌發(fā)率有區(qū)別。前作水稻的抑制效果略好于前作芝麻。3對作物生長的影響本試驗研究表明,短帚霉(Scopulariopsisbrevicaulis)Sco-1、哈茨木霉菌(Trichodermaharzianum)Tri-1、棘孢曲霉(Aspergillusaculeatus)Asp-1及生防制劑(用Tri-1和Asp-1制備)對油菜菌核萌發(fā)有較強的抑制作用,致死率均在78%以上。上述3菌株分別可以從“土壤未滅菌、菌核表面未消毒”和“未滅菌土壤、菌核表面消毒”這2種處理中獲得,而從“滅菌土壤、菌核表面未消毒”的處理中沒有分離到任何菌株,這表明這些生防菌來自于土壤,而非菌核表面。木霉菌作為生防菌已有很多的報道,木霉菌生防作用的生化機制主要包括:代謝幾丁質酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等多種胞外酶,強烈水解植物病原真菌的細胞壁,抑制病原菌生長與繁殖。但曲霉作為生防菌尚未見報道。生防制劑起到了降低菌核萌發(fā)的良好效果。哈茨木霉菌和棘孢曲霉兩者在同一PDA培養(yǎng)皿上培養(yǎng),它們之間互相不抑制,但存在營養(yǎng)競爭關系。因此,生防制劑中采用1∶1的比例配制。施用此生防制劑使其孢子與油菜菌核充分接觸,在條件合適時孢子萌芽并侵襲菌核,并達到分解菌核的目的。盆栽試驗表明,施用生防制劑種植芝麻和水稻后,油菜菌核的萌發(fā)率分別比不施生防制劑對照下降27.3%和38.0%。菌核在水中浸泡60d仍有68.7%的萌發(fā)率,這可能與埋菌核方式、盆栽的時間和環(huán)境條件有關,有待進一步探查。兩種盆土(種植芝麻的旱作土和種植水稻后的水田土)后作油菜60d后,施用生防制劑處理,其油菜菌核的萌發(fā)率分別比不施生防制劑對照下降16.1%和18.3%。前作水稻的抑制效果略好于前作芝麻。種植芝麻的旱作土,無論是施生防制劑和對照,菌核萌發(fā)率的標準差都要大于種植水稻的水田土,特別是芝麻盆土的對照標準差較大。究其原因,可能是由于旱地土壤不利于盆栽的土著微生物或者生防制劑不能均勻擴散、每袋裝菌核數較多等原因,使得菌核未能充分接觸土著微生物和生防制劑。哈茨木