建立糖尿病腎病大鼠模型方案的探討

建立糖尿病腎病大鼠模型方案的探討

隨著生活水平的提高和工作任務(wù)的加快，糖尿病的發(fā)病率呈上升趨勢。世界上年齡組糖尿病的發(fā)病率預(yù)計為2000年2.8%，到2030年4.4%?；继悄虿∪藬?shù)將從2000年的1.71億增加到2030年3.33億。中國每年糖尿病的發(fā)病率在不斷上升,患病人數(shù)僅次于印度,居世界第2位。在l9世紀(jì)初期,糖尿病腎病(diabeticnephropathy,DN)被看作是一種以尿量增多和消瘦為特征的腎病,而現(xiàn)在在世界范圍內(nèi)腎衰患者中20%~50%是由DN發(fā)展而來的。世界衛(wèi)生組織預(yù)測到2025年,大約有3億人將患上糖尿病,其中30%~40%的人將會發(fā)展成糖尿病腎病,目前DN的防治已成為國內(nèi)外研究的熱點,而建立較好的DN模型是研究DN發(fā)病機(jī)制及防治的重要方面。目前有關(guān)DN的實驗研究,模型建立方法各異,單純利用鏈脲佐菌素(streptomycin,STZ)注射進(jìn)行誘導(dǎo)建立DN模型,是國內(nèi)外學(xué)者們運(yùn)用最多的,因為此法操作相對比較簡單。近年來在研究DN的造模方法中有人對此進(jìn)行了改良,采用單側(cè)腎臟切除術(shù)后再進(jìn)行STZ注射誘導(dǎo)建立DN。單側(cè)腎臟切除導(dǎo)致保留的腎臟代償性肥大,高過濾,腎小球毛細(xì)血管壓力增大,促進(jìn)糖尿病腎小球損傷。同時也有文獻(xiàn)報道采用單側(cè)腎臟結(jié)扎后再進(jìn)行STZ注射誘導(dǎo)建立DN。單側(cè)腎臟結(jié)扎,可出現(xiàn)與手術(shù)摘除結(jié)果相同的對側(cè)腎臟代償性肥大,血糖(glucose,Glu)及腎臟功能改變能夠證實DN模型的成立。但不同造模方法都各有其優(yōu)缺點,本實驗通過手術(shù)切除和手術(shù)結(jié)扎單側(cè)腎臟后再腹腔注射STZ建立糖尿病腎模型的方法進(jìn)行比較,從而尋求一種相對理想的造模方案。1材料和方法1.1材料表面1.1.1實驗動物g選用SD大鼠雌性30只,體重(250±20)g,購自上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(滬)2002-0001。適應(yīng)性平衡飼養(yǎng)1周后,用于試驗。1.1.2表面活性劑及定量試劑盒STZ購自美國Sigma公司,-20℃保存,臨用前用pH4.5的檸檬酸緩沖液配制為1%的應(yīng)用液;尿蛋白(urineprotein,Upro)定量試劑盒購自南京建成生物工程研究所;戊巴比妥鈉購自中國醫(yī)藥(集團(tuán))上?；瘜W(xué)試劑公司(進(jìn)口分裝),臨用前用生理鹽水配成3%的濃度待用;1.1.3儀器、檢測方法羅康全優(yōu)越型血糖儀及羅康全試紙(德國羅氏診斷有限公司);Hitachi7020生化自動分析儀(日本日立公司);721E型可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司);臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠);T1000電子天平(常熟雙杰測試儀器廠);OLYMPUS顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。1.2方法1.2.1各組患者10只只自組織將30只實驗動物按體重隨機(jī)分成3組,每組10只。分別為A組:單側(cè)腎臟切除后STZ腹腔注射,B組:單側(cè)腎臟結(jié)扎后STZ腹腔注射,C組:假手術(shù)對照組。1.2.2腎移植的聯(lián)合注射實驗大鼠禁食12h后,A、B、C3組均腹腔注射3%的戊巴比妥鈉溶液進(jìn)行麻醉,注射容量為每100g體重0.15ml,相當(dāng)于劑量為45mg/kg。確認(rèn)麻醉后,A組行左側(cè)腎臟切除術(shù):從左側(cè)脊柱與肋骨之角處切開皮膚及肌層,于腎門處結(jié)扎,摘除左腎,縫合肌層和皮膚。B組行左側(cè)腎臟結(jié)扎術(shù):沿腎蒂同時結(jié)扎腎臟動靜脈及輸尿管。C組大鼠切開皮膚及肌層后再行縫合。手術(shù)后2周,各組大鼠禁食18h,A、B2組大鼠一次性腹腔注射1%STZ溶液55mg/kg,具體給藥量為每100g體重0.55ml,C組大鼠一次性注射同等劑量的檸檬酸緩沖液。注射后大鼠自由攝食水。STZ腹腔注射后,從第1周開始監(jiān)測血糖,收集尿液計算尿量,測尿蛋白,并以非空腹血糖>16.6mmol/L,尿量>原尿量150%,尿蛋白排泄>20mg/24h為成模標(biāo)準(zhǔn)。本實驗中盡量避免測空腹血糖,因為空腹會造成一些血糖太高的大鼠出現(xiàn)酮體增多而增加死亡率。1.2.3腎損害量vd大鼠注射STZ后,從第1周開始每2周稱1次體重(weight,BW),測Glu,血清總膽固醇(cholesterol,Chol),甘油三酯(triglyceride,TG),血清肌酐(serumcreatinine,Scr),記錄尿量(volume,V),測尿肌酐(urinecrea,Ucr)、24h尿蛋白(24-urineprotein,24-Upro)。血清由大鼠眼眶內(nèi)眥取血離心收集,尿液由代謝籠收集24h尿。24h尿蛋白(mg)=測定管吸光度/標(biāo)準(zhǔn)管吸光度×750(mg/L)×尿量(ml)/1000。內(nèi)生肌酐清除率Ccr(ml×min-1×100gBW)=Ucr(mmol/L)×V(ml)×1/Scr(mmol/L)×1/1440(min)×1/BW(g)×100。實驗結(jié)束時取右腎,生理鹽水沖洗,去除包膜,稱重,計算腎臟肥大指數(shù)(右腎重/體重×100%)。并將右腎10%中性福爾馬林、乙醇逐級脫水,石蠟包埋切片,常規(guī)HE染色,樹膠固封,光鏡下觀察,放大400倍。1.2.4測量尿蛋白測定,依試劑盒操作要求用721分光光度計進(jìn)行測定。Glu用血糖儀測定。Ucr,血清Chol,TG及Scr用生化自動分析儀檢測。1.3指標(biāo)統(tǒng)計分析實驗數(shù)據(jù)采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析,各項指標(biāo)多組間比較采用單因素方差分析,再行兩兩比較用Dunnett-t檢驗,百分率比較采用確切概率法。P﹤0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1一般情況下2.1.1成模情況分析腹腔注射STZ后,根據(jù)Glu、尿量及24h尿蛋白成模標(biāo)準(zhǔn),各組動物的每周成模情況見表1,3周時A、B兩組的大鼠于3周時均100%成模。實驗期間各組大鼠存活率情況見表2,11周時A、B兩組的存活率分別為60%、80%,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。2.1.2大鼠一般情況對照組大鼠反應(yīng)靈敏,活動正常,體毛有光澤,飲食正常,大便顆粒狀,尿淡黃色;A、B兩個模型組大鼠精神萎靡,倦怠蜷臥,反應(yīng)遲鈍或易怒,體毛稀疏,活動量減少,飲食量增多,常有腹瀉,個別動物出現(xiàn)腹部漲氣。體重增長情況見表3,A、B兩組大鼠1~11周的體重均小于C組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01),但A、B兩組體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)。2.1.3兩組24h尿量的比較表1A、B兩組大鼠在1~11周的24h尿量均多于C組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01),但A、B兩組的24h尿量在整個實驗期間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05,表4)。2.2實驗室研究結(jié)果表明2.2.1各組大鼠24h尿蛋白的比較A、B兩組大鼠在1~11周的24h尿蛋白均高于C組大鼠,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01),但A、B兩組各周的24h尿蛋白相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05,表5)。2.2.2各組大鼠血糖的比較A、B兩組大鼠血糖在1~11周時均高于C組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01),A、B兩組各周的血糖相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05,表6)。2.2.3兩組各周的高效機(jī)械宣傳統(tǒng)表a、b兩組各周的高效比較A、B兩組大鼠1~11周的Chol均高于C組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05,P﹤0.01),A、B兩組各周的Chol相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05,表7)。A、B組大鼠1~11周的TG均高于C組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01),A,B兩組各周的TG相比,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05,表8)。2.2.4兩組各周ccr對比A、B組大鼠在1~11周間Ccr均高于C組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01,﹤0.05),A、B兩組各周的Ccr相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05,表9)。2.3腎臟2.3.1各組腎體比,a與b組的腎體比對比A、B兩個模型組的腎體比均高于C組,且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01),A與B組的腎體比相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05,表10)。2.3.2小鼠肝腎組織病理學(xué)表現(xiàn)對照C組大鼠腎小球、腎小管及間質(zhì)未見病變。A、B組大鼠腎小球細(xì)胞明顯增多,腎小球體積明顯增大、腫脹,大小不均;腎小球毛細(xì)血管叢呈分葉狀,細(xì)胞外基質(zhì)增多;腎小球毛細(xì)血管狹窄,部分閉塞,部分毛細(xì)血管襻塌陷;系膜區(qū)擴(kuò)大,系膜細(xì)胞增生,基底膜不均一性增厚。多數(shù)腎小管出現(xiàn)上皮細(xì)胞腫脹,空泡變性,管腔變窄;偶可見腎間質(zhì)纖維化,腎小管周圍明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。3糖尿病腎病大鼠尿蛋白和腎功能變化實驗過程中動物檢測血糖時不禁食不禁水,因為空腹血糖值升高,易導(dǎo)致血酮體升高而死亡。STZ的結(jié)構(gòu)分析有一個高度活性的葡萄糖側(cè)鏈,使胰島β細(xì)胞對其進(jìn)行錯誤性識別,并進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),其余部分則是STZ的毒性基團(tuán),對胰島β細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,這種毒性可能通過給予某種物質(zhì)或改變某些條件使之減弱或消失,如葡萄糖或其類似物,這便是實驗前給動物充分禁食的依據(jù)。在飼養(yǎng)過程中動物密度不宜過大,通風(fēng)要好,防止相互撕咬及各種感染。此外,勤換敷料、避免足尾受壓、防感染也是降低死亡率的措施。DN的發(fā)病機(jī)制未完全闡明,認(rèn)為是多因素共同作用的結(jié)果,其中高血糖是最關(guān)鍵的因素。血糖升高可激活酶C,產(chǎn)生糖基化終產(chǎn)物,促進(jìn)甘油二酯的合成,使腎小球濾過率升高,引起微量白蛋白尿,最后腎臟局部產(chǎn)生大量的TGF-β1,該因子可增加細(xì)胞外Ⅰ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ型膠原及纖維素等基質(zhì)的沉積,導(dǎo)致系膜擴(kuò)張,腎小球基底膜增厚等腎臟損害。高血糖是DN的始動因素,也是導(dǎo)致DN的根本原因。高血糖增加腎血流量,參與DN早期腎臟的高灌注、高濾過、腎小球囊內(nèi)高壓、進(jìn)而刺激腎小球系膜細(xì)胞肥大和系膜基質(zhì)增加,腎臟增大,腎功能逐漸受損,降低血糖可以減少DN的發(fā)病率。尿蛋白是糖尿病腎病診斷的金標(biāo)準(zhǔn),延緩或減少尿清蛋白排泄可以延緩糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展。不論是DN還是其他類型的腎病,蛋白尿與腎病的進(jìn)展密切相關(guān)。Rademacher等提出尿蛋白排泄率與冠脈病變的發(fā)病率和死亡率相關(guān)。微量蛋白尿絕不僅是早期腎損傷的信號,出現(xiàn)微量蛋白尿時腎小球已出現(xiàn)了廣泛損傷,其出現(xiàn)可增加患者的死亡率。本次實驗中測定了DN動物模型尿蛋白的24h排出量,結(jié)果表明,A、B兩組模型動物的這項指標(biāo)在1周時就明顯升高,預(yù)示著腎臟功能損害在此時就已開始出現(xiàn),至實驗結(jié)束時這兩組模型動物的24h尿蛋白排出量均顯著高于對照C組大鼠。糖尿病患者常伴有高脂血癥及血脂組成異常。有研究顯示,高脂血癥是糖尿病腎損害的重要因素。動物實驗和臨床研究都表明,高膽固醇和高甘油三酯血癥都可以促進(jìn)炎性細(xì)胞的浸潤,增加細(xì)胞外基質(zhì)分泌,促進(jìn)腎小球硬化和間質(zhì)纖維化。在本實驗中,A、B兩組大鼠于實驗1周時膽固醇和甘油三酯水平均顯著高于對照C組大鼠,提示此時A、B兩組大鼠已出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂情況。血漿肌酐為內(nèi)源性物質(zhì),在Scr無異常增高時不為腎小管排泄。所以可以用Ccr來表示腎小球濾過率,作為判斷DN出現(xiàn)腎臟肥大、高濾過的指標(biāo)。腎小球高灌注、高濾過使腎小球毛細(xì)血管切流壓增加,機(jī)械力和剪切力可能引起內(nèi)皮和上皮細(xì)胞損害,從而破壞正常的濾過屏障,蛋白質(zhì)濾過增加,最終形成腎小球硬化、腎功能進(jìn)行性喪失。實驗中A、B兩組的Ccr在1周開始明顯升高,在整個實驗期間均顯著高于對照C組。大鼠Ccr明顯增高,提示糖尿病腎病大鼠存在腎小球高灌注、高濾過。DN的主要臨床特點是尿蛋白增加和腎功能改變,特征性的病理改變是腎小球系膜區(qū)無細(xì)胞性增寬和腎小球基底膜彌漫性增厚,漸至腎小球硬化。目前認(rèn)為,系膜外基質(zhì)沉積是腎小球硬化的病理基礎(chǔ)。本實驗中在模型成立11周時A、B兩組大鼠腎臟已出現(xiàn)典型病理改變,系膜區(qū)明顯擴(kuò)張,甚至彌漫性系膜硬化。系膜細(xì)胞增生及細(xì)胞外基質(zhì)顯著增多,腎小球、小管基底膜增厚。STZ在建立糖尿病腎病模型中應(yīng)用廣泛,該模型是研究糖尿病腎損害機(jī)制和治療干預(yù)措施時重要的、廣為接受的模型。然而,由于很難區(qū)分STZ誘導(dǎo)的高血糖和單側(cè)腎切除在腎損傷腎小球血液動力學(xué)改變中的作用,該模型結(jié)果的闡釋很復(fù)雜。至今還沒有一種動物模型與人類疾病特征完全吻合,無論在腎臟