酶免及膠體金檢測試劑介紹

酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)簡介

萬泰各項(xiàng)產(chǎn)品簡介李一然2008年4月一、酶聯(lián)免疫技術(shù)的基礎(chǔ)及特點(diǎn)什么是ELISA?免疫測定（immunoassay，IA）是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測定標(biāo)本的方法。在臨床檢驗(yàn)中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。ELISA是一種免疫測定?；A(chǔ)定義抗原（Antigen）：能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì)?？贵w（Antibody）：能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類，即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE。與免疫測定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM。機(jī)體被微生物感染后，先產(chǎn)生IgM抗體，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時間，IgM抗體量逐漸減少而消失，而IgG抗體可長期存在，在疾病痊愈后可持續(xù)數(shù)年之久。重要指標(biāo)靈敏度：能檢測到的分析物的最小量，表示檢測下限的能力。特異性：鑒別陰性標(biāo)本的能力。精密度：指對同一個標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)分析，其結(jié)果間的符合率。重要指標(biāo)穩(wěn)定性：指在效期內(nèi)試劑質(zhì)量參數(shù)的變化。一般用非儲存條件下較高溫度進(jìn)行破壞性實(shí)驗(yàn)數(shù)天，參觀各質(zhì)量參數(shù)的變化，一般37℃1天相當(dāng)于4℃45天。質(zhì)控血清：指為了對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行控制而配制的血清。一般用無溶血無脂血的血清或血漿。本底：指底色，如HbsAgELISA試劑盒，陽性顯色、陰性不顯色，本底就是陰性顯色的情況；

ELISA檢測方法

1.夾心法.2.間接法.3.競爭法.4.捕獲法.夾心法雙抗原夾心：固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)抗原Ag*→Ag-Ab-Ag*+底物(TMB)→顯色雙抗體夾心：固相(包被)抗體Ab+樣品(抗原Ag)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ab-Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色夾心法圖解TMB+H2O2TMB+H2O2顯色樣品酶標(biāo)抗原加樣洗滌加酶包被底物包被抗原21114233360’30’30’45554洗滌一步法二步法間接法固相(包被)抗原Ag+樣品(抗體Ab)+酶標(biāo)二抗Ab*→Ag-Ab-抗Ab*+底物(TMB)→顯色競爭法固相(包被)抗原Ag+樣品(無抗體Ab)+酶標(biāo)抗體Ab*→Ag-Ab*+底物(TMB)→顯色捕獲法固相-抗IgM抗體(抗μ)+樣品(IgM)→抗μ-IgM+酶標(biāo)抗原Ag*→抗μ-IgM-Ag*+底物(TMB)→顯色檢測方法優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)酶聯(lián)免疫EIA高靈敏度及特異性，結(jié)果準(zhǔn)確性高，成本底。操作時間長。膠體金特異性高，操作簡便。靈敏度低?；瘜W(xué)發(fā)光（包括電化學(xué)發(fā)光）、時間分辨靈敏度高。需要較高的設(shè)備條件和操作技術(shù)，特異性一般。PCR可檢測標(biāo)本中極低濃度的病毒，窗口期短。價格昂貴。與其他檢測方法比較二、萬泰各項(xiàng)產(chǎn)品簡介1、HIVHIVELSIA試劑的發(fā)展簡介全稱：人類免疫缺陷病毒HIV（1+2型）抗體診斷試劑盒方法：雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法（第三代）檢測對象：血液標(biāo)本中的HIV總抗體原料：基因重組（萬泰和廈大合作研制），包被GP41、GP120、GP36，片段齊全。檢測窗口期：20天左右優(yōu)異的自產(chǎn)原料1.大腸桿菌表達(dá)高活性、高特異性水溶性抗原；2.多表位表達(dá)蛋白抗原；3.相同表位的包被、標(biāo)記抗原采用不同菌體表達(dá)，不同方法純化；基因重組多表位嵌合抗原向其他試劑生產(chǎn)廠家提供原料對HIV-2型陽性出色的檢測能力試劑盒內(nèi)設(shè)置有HIVⅠ型和Ⅱ型陽性對照，為國產(chǎn)試劑首創(chuàng)，我們使用美國BBI

血清盤Panel202對萬泰試劑進(jìn)行考核。

對HIVO亞型的檢測O亞型血來源于美國BBI靈活、穩(wěn)定的操作模式實(shí)驗(yàn)溫度可以設(shè)置在37±1℃。兩步孵育時間均為30±2分鐘。操作更靈活，試驗(yàn)更穩(wěn)定，結(jié)果更可靠。超強(qiáng)的抗干擾能力臨床研究顯示，多種其他疾病潛在干擾因素血清標(biāo)本均不會影響萬泰兩步法HIV診斷試劑盒的靈敏度和特異性，適合臨床使用潛在干擾因素血清標(biāo)本數(shù)陽性數(shù)陰性數(shù)甲型肝炎（HAV）78078乙型肝炎（HBV）4450445巨細(xì)胞病毒（CMV）30030T淋巴白血病病病毒（HTLV）10010風(fēng)疹（RUV）30030腮腺炎10010EBV病毒10010孕婦40040眾多的榮譽(yù)第一個國產(chǎn)第三代HIV檢測試劑正在申報CE認(rèn)證單位名稱標(biāo)本總量假陽性數(shù)量假陽性率海南血液中心50600541‰北京血液中心2570002060.8‰安徽血液中心29500301‰江西血液中心21733130.5‰河南血液中心827251241.5‰湖北血液中心1200001080.9‰其他中心血站4108864281‰總計31家9724449630.9‰2007年全年部分客戶使用情況29首家推出第四代HIV試劑HIV-Ab與HIV-Ag雙系統(tǒng)檢測

——HIV-Ag和HIVP24抗體共同包被

——雙抗原夾心法檢測HIV-Ab——雙抗體夾心法檢測HIV-Ag生物素-親和素反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)用

——包被抗體＋生物素標(biāo)記抗體＋HRP標(biāo)記親和素30臨床考核31臨床考核匯總研究考核匯總：進(jìn)一步縮短窗口期，有效降低HIV傳播風(fēng)險

——考核超過700份陽性標(biāo)本（不同亞型和毒株），靈敏度100％保證高靈敏度的同時，具備優(yōu)越的特異性

——考核超過15000份陰性標(biāo)本（包括特殊標(biāo)本），特異性99.8％32結(jié)論

萬泰HIVAg/Ab診斷試劑全新第四代HIV篩查試劑為使用者提供:增強(qiáng)檢驗(yàn)安全性更可信賴的實(shí)驗(yàn)結(jié)果33我們在HIV方面的研發(fā)新進(jìn)展1、HIV確證試劑（RIBA試劑）

與艾控中心，地壇醫(yī)院等單位合作的十五攻關(guān)課題目前已進(jìn)行部分臨床考核2、HIV唾液尿液檢測試劑（DOT-ELISA）

與艾控中心，地壇醫(yī)院等單位合作的十五攻關(guān)課題目前已進(jìn)行部分臨床考核2、乙肝兩對半系列試劑簡介1全稱：1、乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）診斷試劑盒2、乙型肝炎病毒表面抗體（HBsAb）診斷試劑盒3、乙型肝炎病毒E抗原（HBeAg）診斷試劑盒4、乙型肝炎病毒E抗體（HBeAb）診斷試劑盒5、乙型肝炎病毒核心抗體（HBcAb）診斷試劑盒乙肝兩對半檢測原理夾心法：陽性顯色、陰性不顯色（右）

HBsAg、HBsAb、HBeAg競爭抑制法：陰性顯色、陽性不顯色（左）

HBeAb、HBcAb

簡介3潛伏期: 平均60-90天 范圍：45-180天黃疸發(fā)生率:<5歲,<10%

5歲,30%-50%急性病死率:0.5%-1%慢性感染: <5歲,30%-90%

5歲,2%-10%慢性肝病患者病死率: 15%-25% 簡介4高

中低/未發(fā)現(xiàn)

血液血清傷口分泌物

精液陰道分泌物唾液尿液糞便汗液淚液乳汁乙肝標(biāo)志物及臨床意義1乙型肝炎病毒（HBV）具有明顯的種屬及嗜肝特性，可致持續(xù)性病毒感染。我國屬乙肝感染的高發(fā)區(qū)，乙肝表面抗原（HBsAg）的攜帶者超過10%。通常判斷HBV感染及其狀況的指標(biāo)為HBV血清血標(biāo)志物—乙肝兩對半、HBc-IgM、HBVDNA等。乙肝病毒（HBV）又稱Dane顆粒（丹顆粒），由外至內(nèi)可分為包膜蛋白、核殼蛋白、HBVDNA等主要組成。包膜蛋白構(gòu)成乙肝病毒表面抗原（HBsAg）核殼蛋白構(gòu)成乙肝病毒核心抗原（HBcAg）和乙肝病毒e抗原（HBeAg）乙肝標(biāo)志物及臨床意義2乙肝表面抗原（HBsAg）HBsAg于1963年在澳大利亞土著人血中發(fā)現(xiàn)，故也稱為澳大利亞抗原（簡稱“澳抗”），具有免疫原性，可刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，是機(jī)體感染HBV后最早出現(xiàn)的血清血指標(biāo)。HBsAg分為4個亞型：adw、adr、ayw和ayr。不同亞型的HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的HBsAb不同。乙肝標(biāo)志物及臨床意義3乙肝表面抗體（HBsAb）HBsAg刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體，能中和體液中的HBV，感染乙肝病毒后6-23周出現(xiàn)。見于乙肝恢復(fù)期、HBV既往感染和乙肝疫苗免疫后。HBsAb滴度≥10mIU表示有保護(hù)性，可抵御同一亞型的再感染。乙肝標(biāo)志物及臨床意義4乙肝病毒核心抗原（HBcAg）HBV核心顆粒外表面具有HBcAg活性，但外周血中沒有游離的HBcAg。HBcAg陽性表示有Dane顆粒存在，有傳染性。目前臨床較少檢測該項(xiàng)指標(biāo)。乙肝標(biāo)志物及臨床意義5乙肝核心抗體（HBcAb）HBcAb是乙肝核心抗原的總抗體。感染HBV后最早出現(xiàn)的抗體是HBc-IgM抗體，它是乙肝病毒急性感染的重要指標(biāo)，慢性肝炎的炎癥活動期也呈陽性。核心抗體不是中和抗體，HBc-IgG抗體可持續(xù)多年不消退，是既往感染的指標(biāo)。乙肝標(biāo)志物及臨床意義6乙肝e抗原（HBeAg）HBV核心顆粒內(nèi)表面具有HBeAg活性，也可以由HBcAg經(jīng)蛋白酶降解后產(chǎn)生，在乙肝潛伏期后期出現(xiàn)，略晚于HBsAg。HBeAg陽性表示HBV在體內(nèi)復(fù)制，有很強(qiáng)的傳染性。進(jìn)入恢復(fù)期后，HBeAg隨著HBsAg的消失而消失，其消失前后出現(xiàn)HBeAb。乙肝標(biāo)志物及臨床意義7乙肝e抗體（HBeAb）HBeAb的出現(xiàn)預(yù)示HBV復(fù)制減弱或中止，疾病可能向好的方向轉(zhuǎn)化。HBeAg逐漸消失HBeAb逐漸產(chǎn)生的時期稱為血清轉(zhuǎn)換期，即由復(fù)制期轉(zhuǎn)為非復(fù)制期。在這一時期可能出現(xiàn)eAg、eAb同陽的現(xiàn)象。HBeAb也不是保護(hù)性抗體。乙肝標(biāo)志物產(chǎn)生的先后順序HBsAg→(HBcAg)→HBcAb→HBeAg→HBeAb乙肝兩對半模式見資料萬泰HBsAgEIA試劑特點(diǎn)1.最低檢出量達(dá)到1IU，質(zhì)量達(dá)到國際先進(jìn)水平。2.特異性好，檢測準(zhǔn)確性高。3.中國藥品生物制品檢定所標(biāo)準(zhǔn)血清檢驗(yàn)結(jié)果全部合格。4.衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心歷年評比全部成績優(yōu)秀。3、HCV簡介全稱：丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒方法：間接酶聯(lián)免疫法（第三代）檢測對象：血液標(biāo)本中的HCVIgG抗體原料：基因重組，包被NS3、NS4、NS5、CORE，片段齊全。抗-HCV檢測中HCV的抗原5’UTRCE1E2NS2NS3NS4NS53’UTR結(jié)構(gòu)區(qū)非結(jié)構(gòu)區(qū)第一代c100第二代C22C33cc100第三代C22C33cc100NS5窗口期檢測針對HCV四種抗原的抗體第二代試劑在感染后平均10周左右可以檢出第三代試劑感染后平均7-8周為陽性在極少數(shù)病例中，如免疫抑制、腎功能衰竭等，抗-HCV可以保持陰性2007年武漢血液中心HCV考評試劑廠家檢定項(xiàng)目S/CO孔間變異試劑本底新創(chuàng)2NCU3.27.44%好科華2NCU4.989.25%好萬泰2NCU3.246.9%好金豪2NCU2.8110.5%一般金偉凱2NCU1.938.14%一般檢定所考評市場流通的HCV

抗體檢測試劑參加臨床考核和質(zhì)量評價的廠家中，萬泰HCV試劑盒的靈敏度、特異性等綜合水平名列國產(chǎn)試劑最佳水平。試劑盒陰性假陽性陽性特異性%ABBOTT290424299.93%ORTHO2908040100.00%國產(chǎn)試劑12898113999.62%國產(chǎn)試劑22896143899.52%國產(chǎn)試劑32895153899.48%萬泰公司2897133899.85%總體評價易于操作，便于推廣，實(shí)驗(yàn)條件要求較低，不存在污染問題。篩查獻(xiàn)血員，顯著降低輸血后HCV感染廣泛應(yīng)用于臨床，起到輔助診斷的作用，有效減少醫(yī)療糾紛。4、TP簡介全稱：梅毒螺旋體抗體診斷試劑盒方法：雙抗原夾心酶聯(lián)免疫法檢測對象：血液標(biāo)本中的梅毒總抗體原料：基因重組（萬泰和廈大合作研制），包被P15、P17、P47，片段最齊全。常用梅毒檢測方法的比較萬泰TPEIA與TPPA的比較標(biāo)本：類風(fēng)濕病人血清10份，乙肝病人血清20份，紅斑狼瘡病人血清6份。來源于解放軍301醫(yī)院。病人血清數(shù)量梅毒檢測陽性梅毒檢測陰性類風(fēng)濕10010乙肝20020紅斑狼瘡606

結(jié)論：在被檢測的36份血清中，未發(fā)現(xiàn)假陽性反應(yīng)。萬泰TP試劑對特殊標(biāo)本的檢測

檢測單位：北醫(yī)第一醫(yī)院皮膚科、新疆HIV檢測中心結(jié)論：萬泰梅毒EIA靈敏度較TPHA好部分臨床考核數(shù)據(jù)萬泰TP-ELISA雙抗原夾心多片段試劑原料自產(chǎn)，根本上保證質(zhì)量穩(wěn)定！包被抗原片段多：P15、P17、P47，目前廠家中實(shí)際片段最多的生產(chǎn)家，混合包被保證梅毒靈敏度。衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心血清標(biāo)準(zhǔn)盤合格率100%2001年上市，質(zhì)量優(yōu)秀，銷量增長最快。5、HEV系列試劑HEV簡介及危害戊型肝炎（HepatitisE）由戊型肝炎病毒(HEV)引起、腸道傳播為主的急性傳染性肝炎?？缮l(fā)和流行,水源和食源暴發(fā)(>50次)發(fā)展中國家為主,占急性非甲非乙型肝炎的30~70%左右;臨床表現(xiàn)類似甲肝，但不同的是：潛伏期更長,40天(15~60天)；年齡較大；膽汁郁積更明顯；病死率較高(1~5%)，孕婦(20%以上)；乙肝患者發(fā)生戊肝容易導(dǎo)致重癥肝炎；二代病例罕見；無有效疫苗和治療方法。戊肝是一種人獸共患病?!基因分型---四型9群

亞/非

墨西哥歐美中國/日本戊型肝炎世界流行狀況戊肝廣泛流行于世界各地，尤其是發(fā)展中國家。Non-ABC中>25%是HEV引起的。⊕⊕⊕⊕⊕⊕存在本土HEVRT-PCR(+)的人間病例。⊕⊕⊕⊕⊕●●●●●●●●HEVRT-PCR(+)的豬●萬例以上HEV暴發(fā)區(qū)與人類密切接觸的動物如豬、牛、羊、鼠、雞、狗和野猴等體內(nèi)陸續(xù)檢出HEV抗體，以豬的感染率最高；豬、鼠體內(nèi)分離的HEV與人HEV有很高的同源性；豬HEV和人HEV可成功感染豬、恒河猴和黑猩猩；以豬HEV感染過的豬肝、心、胰(靜脈接種)和骨骼肌勻漿物、糞便(口服接種)再感染SPF豬，發(fā)現(xiàn)只有接種肝勻漿物的豬在3-7和14-20DPI出現(xiàn)抗體轉(zhuǎn)陽和病毒血癥。外環(huán)境中HEVRNA污染嚴(yán)重，如印度垃圾（11%）、西班牙垃圾（43.5%）、美國、法國。現(xiàn)有垃圾處理方法只對HAV有效，但對HEV效果不大。2003年Lancet：3例食用被HEVRNA污染的鹿肉均發(fā)生急性戊型肝炎；2003年

JGenVirol:日本在超市的豬肝中查到HEVRNA;印度（2003年8月）、江蘇連云港（2003年5月）發(fā)生戊肝暴發(fā)。戊肝是一種人獸共患病!萬例以上的戊肝暴發(fā)年份國家.城市病例(萬)孕婦病死率(%)1955~56印度.新德里2.910.51955~56前蘇聯(lián).吉爾吉斯共和國1.118.01973~74尼泊爾.加德滿都山峽1.020~251976~77緬甸.曼德勒市2.018.01978~82印度.克什米爾5.2NA1981~82尼泊爾.加德滿都山峽1.220~251986~88中國.新疆12.0NA1988~89索馬里.謝貝利河下游1.1417.01991印度.坎普爾7.9NA戊型肝炎肆虐日本感染者可能已達(dá)到650萬人新華網(wǎng)東京2002年7月23日電(記者何德功)

一向被認(rèn)為只在衛(wèi)生條件惡劣的發(fā)展中國家流行的戊型肝炎如今在日本已經(jīng)開始肆虐。日本國立感染研究所的全國調(diào)查表明，日本國民每20個人中可能就有1人感染戊型肝炎病毒，而全國戊型肝炎病毒感染者可能達(dá)到650萬人。

日本國立感染研究所利用高精度抗體檢查藥物，抽樣檢查了1993年以后血庫中保存的血清，其中日本北部、中部和南部各300人。分析結(jié)果表明，共有49人的血清存在戊型肝炎抗體，而且來自三個地區(qū)的人血清中都有感染者，這說明戊型肝炎感染范圍涉及全國各地。其中，日本中部地區(qū)感染率最高，感染率占14.1%。另據(jù)由全國21所國立醫(yī)院、國立療養(yǎng)所組成的肝病共同研究組調(diào)查表明，從1990年以后各醫(yī)院診斷為原因不明的242位急性肝炎患者血清中，發(fā)現(xiàn)45人有戊型肝炎病毒，占18.6%。日本戊型肝炎感染途徑也已初步查明。櫪木縣自治大學(xué)岡本宏明教授等人在本縣20個養(yǎng)豬場抽樣檢查了86頭豬的血液，其中在3個養(yǎng)豬場發(fā)現(xiàn)3頭小豬有戊型肝炎病毒，因此初步斷定日本戊型肝炎為“人畜共同感染癥”。至于豬通過什么樣的方式把病毒傳染給人，現(xiàn)在還在