一般毒性作用試驗

一般毒性作用試驗10/7/202313R原則：ReplacementReductionRefinementRpentlecameRnifoitcudRtnemen填詞游戲10/7/20232一般毒性毒性

§1急性毒性作用

§2蓄積毒性

§3亞慢性和慢性毒性作用

§4局部毒性作用10/7/20233§1急性毒性作用一、急性毒性和急性毒性試驗的目的二、急性毒性試驗三、急性毒性分級10/7/20234一、急性毒性和急性毒性試驗的目的急性毒性(acutetoxicity)是指機體(人或試驗動物)一次接觸或24小時內(nèi)多次接觸化學物后在短期(最長到14天)內(nèi)所發(fā)生的毒性效應(yīng)，包括一般行為、外觀改變、大體形態(tài)變化以及死亡效應(yīng)。急性毒性作用10/7/20235一、急性毒性和急性毒性試驗的目的目的①測試和求出化學毒物對一種或幾種試驗動物的致死量(以LD50表示)以及其它的急性毒性參數(shù)，了解急性毒作用強度。②并通過觀察動物中毒表現(xiàn)和死亡的情況，了解急性毒作用性質(zhì)、可能的靶器官和致死原因，提供化學毒物的急性中毒資料、初步評價對人體產(chǎn)生損害的危險性。③探求化學毒物急性毒性的劑量—反應(yīng)關(guān)系與中毒特征。④為亞慢性、慢性毒性作用試驗的染毒劑量設(shè)計提供參考依據(jù)。⑤研究化學毒物急性中毒的預(yù)防和急救治療措施。⑥為毒理學機制研究提供線索

。10/7/20236一、急性毒性和急性毒性試驗的目的急性毒性試驗常用的毒性參數(shù)：LD50/LC50Zac（LD50/Limac）Zac為半數(shù)致死劑量與急性閾劑量的比值LD84/LD16(或LC84／LC16)

劑量—反應(yīng)曲線斜率

急性毒性作用10/7/20237二、急性毒性試驗的主要步驟健康動物的選擇性別辨認動物稱重、編號和分組劑量設(shè)置受試物的配制灌胃中毒體征和動物死亡情況觀察LD50的計算10/7/20238二、急性毒性試驗(一)試驗動物[原則]：①急性毒性試驗要求選擇對化學毒物的代謝和毒效應(yīng)表現(xiàn)與人的反應(yīng)盡可能一致的試驗動物。-相似性原則②動物易于獲得-可獲得性原則③品系純化-重復(fù)性和均一性原則④價格較低和易于飼養(yǎng)等條件。-相容或相匹配原則10/7/20239二、急性毒性試驗1．試驗動物的種屬和品系最好用兩種種屬的動物嚙齒類:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非嚙齒類：狗或猴。急性皮膚毒性試驗可選用成年大鼠、豚鼠或家兔，優(yōu)先考慮白色家兔。而急性吸入毒性試驗和經(jīng)口急性毒性試驗則優(yōu)先考慮大鼠。急性毒性作用10/7/202310二、急性毒性試驗⒉試驗動物的年齡和體重：急性試驗動物不宜過老或過幼，通常要求選擇剛成年動物進行試驗，而且須是未曾交配和受孕的動物。例如：大鼠180～240g、小鼠18～25g、家兔2～2.5kg、豚鼠200～250g、狗10～15kg。同一批試驗動物體重變異范圍不應(yīng)超過該批動物平均體重的20％。

急性毒性作用10/7/202311三、急性毒性試驗3.試驗動物的性別：急性毒性試驗的主要內(nèi)容是求LD50，除特殊要求外，一般急性毒性試驗對動物性別要求為雌雄各半。如果在預(yù)試驗時發(fā)現(xiàn)化學毒物(如農(nóng)藥)對雌、雄動物毒效應(yīng)的敏感性有明顯差異，則應(yīng)單獨分別求出雌性與雄性動物各自的LD50。如果試驗是為致畸試驗作準備，也可僅作雌性動物的LD50測試。

急性毒性作用10/7/202312二、急性毒性試驗4.動物數(shù)量與隨機分組：大、小鼠等小動物每組10只狗等大動物每組6只分組原則——隨機化原則5.禁食：經(jīng)消化道染毒時，要求試驗前對動物禁食大鼠、小鼠——隔夜進食；染毒后禁食4h大動物——每日上午喂食前染毒染毒后繼續(xù)禁食2~4h，但在禁食時要保障飲水。6.實驗動物的預(yù)檢：選擇健康動物1~2周的檢疫期急性毒性作用10/7/202313二、急性毒性試驗（二）試驗動物的飼養(yǎng)環(huán)境恒定的溫度：22±3℃濕度：30~70%照度：晝夜各半飼料合格、飲水合格、墊料合格急性毒性作用10/7/202314二、急性毒性試驗（三）染毒途徑的選擇:

染毒途徑（exposureroutes）的選擇需考慮：1、模擬人在生活和生產(chǎn)環(huán)境中實際接觸受試物的途徑和方式；2、有利于不同化學物之間急性毒性大小的比較；3、受試物的性質(zhì)和用途；4、各種受試物毒性評價程序的要求等。

最常用的染毒途徑為經(jīng)口、經(jīng)呼吸道、經(jīng)皮及注射途徑。

急性毒性作用10/7/202315二、急性毒性試驗經(jīng)口(胃腸道)接觸:

灌胃:小鼠0.2

1.0ml/只或0.1

0.5ml/10g大鼠一次灌胃體積不超過5ml/只家兔不超過10ml/2kg狗不超過50ml/10kg

吞咽膠囊:

經(jīng)呼吸道接觸:

靜式吸入動式吸入

經(jīng)皮膚接觸:注射途徑接觸:

急性毒性作用10/7/202316二、急性毒性試驗（四）染毒劑量與分組:

1．查閱文獻①了解化學毒物的結(jié)構(gòu)式、分子量、常溫常壓下的狀態(tài)、熔點、沸點、密度、閃點、揮發(fā)度、蒸氣壓、水溶性和脂溶性等理化特性，生產(chǎn)批號及純度，雜質(zhì)成分與含量等。②確定使用哪一種計算方法求LD50，然后再設(shè)計劑量分組。LD50的計算方法常用寇氏法、概率單位法、霍思法等。③找出與受試化學毒物結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)近似的化學物的毒性資料，并以文獻資料中相同的動物種系和相同接觸途徑所測得的LD50(LC50)值作為受試化學物的預(yù)期毒性中值。急性毒性作用10/7/202317二、急性毒性試驗（四）染毒劑量與分組:2．預(yù)試驗

①設(shè)定以此預(yù)期值作為待測化學物的中間劑量組，并在該劑量的上下各設(shè)計l一2個劑量組作為預(yù)試驗劑量。②根據(jù)確定的劑量組進行染毒。③根據(jù)預(yù)試驗的死亡資料確定組距。

10/7/202318二、急性毒性試驗（四）染毒劑量與分組:3．正式試驗;

一般來說、根據(jù)試驗設(shè)計所選用的LD50計算方法來確定組數(shù)。

急性毒性作用10/7/202319二、急性毒性試驗（五）試驗周期與毒效應(yīng)觀察1.中毒癥狀10/7/202320二、急性毒性試驗（五）試驗周期與毒效應(yīng)觀察:

2.體重在觀察試驗動物中毒癥狀的過程中，應(yīng)同時觀察體重的變化。體重可以反映動物中毒后的整體變化。體重改變的原因很多，若化學毒物刺激或損傷消化道可出現(xiàn)試驗動物飲食減少甚至拒食，表現(xiàn)為體重減輕。若化學毒物引起腹瀉，將影響食物吸收和利用，體重也會減輕。如果化學毒物影響水的攝取或腎功能急性損傷，也可能在體重上反映出來。所以，對存活動物尤其是對低于LD50劑量組的存活動物．應(yīng)在觀察期14天內(nèi)稱量其體重的變化．以便了解受試物引起毒效應(yīng)的持續(xù)時間。急性毒性作用10/7/202321二、急性毒性試驗（五）試驗周期與毒效應(yīng)觀察:3.病理檢查及其他指標:急性毒性試驗中，對死亡的動物均應(yīng)及時進行大體解剖和病理組織學檢查，肉眼觀察主要臟器的大體病理變化，如臟器大小、外觀、色澤的變化，有無充血、出血、水腫或其它改變，對有改變的臟器進行取材做組織病理學檢查。對存活動物在觀察期結(jié)束時進行大體病理檢查．必要時做組織病理學檢查。根據(jù)試驗需要可進一步擴大觀察項目．如體溫、心電圖、腦電圖或進行某些生化指標測定等。急性毒性作用10/7/202322二、急性毒性試驗（五）試驗周期與毒效應(yīng)觀察4.死亡和死亡時間重點觀察和記錄每只動物死亡的時間，特別是最早出現(xiàn)死亡的時間以及各個劑量組動物的死亡數(shù)。分析中毒死亡時間的規(guī)律具有一定意義，可為深人研究化學物的毒作用機制提供參考。

急性毒性作用10/7/202323LD50的計算方法改進寇氏法霍恩法序貫法Bliss法10/7/202324改進寇氏法是利用計量對數(shù)與死亡率呈S型曲線而設(shè)計的方法，又稱平均致死量法。本法要求每個染毒劑量組動物數(shù)要相同，各劑量組組距呈等比級數(shù)，死亡率呈正態(tài)分布，最低劑量組死亡率<20%，最高劑量組>80%。10/7/202325計算公式如下：M=Xk-i(∑p-0.5)Sm=i(∑pq/n)1/2M:lgLD50i：相鄰兩劑量組之對數(shù)差值Xk：最大劑量的對數(shù)值；q：存活率∑p：各組死亡率之和;n:每組動物數(shù)10/7/202326組別劑量對數(shù)動物數(shù)死亡數(shù)

1.17611001.25611021.33611051.41611071.496110910/7/202327M=Xk-i(∑p-0.5)=1.4961-0.08（2.3-0.5）Sm=i(∑pq/n)1/2=0.08（0.16/10+0.25/10+0.21/10+0.09/10）1/210/7/202328霍恩法利用劑量對數(shù)與死亡率的轉(zhuǎn)換數(shù)呈直線關(guān)系而設(shè)計的方法，又稱平均移動法或劑量遞增法。該法使用動物數(shù)少，可直接查表求出LD50。該法推薦使用4個染毒劑量，要求每組動物數(shù)相等，一般用4-5只動物，且劑量組按等比級數(shù)排列。10/7/202329序貫法又稱平均數(shù)法、階梯法或上-下法，先以一個劑量進行實驗，若動物死亡，則以下一個較小劑量試探；若動物存活，則以較大劑量試探，依次類推，最終求出LD50。10/7/202330LD50=(∑xf)/nn:使用的動物總數(shù)；X：每個劑量組的劑量f:每個劑量組使用動物數(shù)10/7/202331舉例：小鼠經(jīng)口給與某化學物染毒，10mg/kg劑量試探，預(yù)計使用4個劑量組，劑量組距對數(shù)值0.2，設(shè)計使用12只動物，結(jié)果如下劑量存活死亡12.590210.00237.94226.311010/7/202332∑xf=12.59×2+10×5+7.94×4+6.31×1該法優(yōu)點是節(jié)省動物，一般12-14只左右動物即可完成實驗。缺點？10/7/202333二、急性毒性試驗(六)經(jīng)典急性毒性試驗的局限性1.消耗的動物量大2.獲得的信息有限3.測得的LD50僅僅是一個近似值4.在安全性評價中僅評價動物死亡和簡單的癥狀觀察是不夠的，更需要的是生理學、血液學及其它化驗檢查所提供的深入細致的毒性信息。急性毒性作用10/7/202334三、急性毒性評價外源化學物急性毒性分級（WHO）毒性分級大鼠一次經(jīng)口LD50(mg/kg)6只大鼠吸入4小時，死亡2~4只的濃度(ppm)兔經(jīng)皮LD50(/mg/kg)對人可能致死的估計量g/kg總量(g/60kg)劇毒<1<10<5<0.050.1高毒1~10~5~0.05~3中等毒50~100~44~0.5~30低毒500~1000~350~5~250實際無毒5000~10000~2180~>15>1000急性毒性作用10/7/202335三、急性毒性評價我國食品毒理急性毒性分級法(1994)急性毒性分級大鼠經(jīng)口LD50(mg/kg)大致相當于70kg人的致死量6級(極毒)<1稍嘗,<7滴5級(劇毒)1~507滴~1茶匙4級(中等毒)51~5001茶匙~35克3級(低毒)501~500035~350克2級(實際無毒)5001~15000350~1050克1級(無毒)>15000>1050克急性毒性作用10/7/202336一、基本概念二、

蓄積毒性試驗方法及其評價蓄積作用及其評價§2蓄積毒性10/7/202337

化學毒物進入機體后，經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化以代謝產(chǎn)物或化學物原型排出體外。但是，當化學毒物反復(fù)多次給動物染毒，化學毒物進入機體的速度(或總量)超過代謝轉(zhuǎn)化的速度和排泄的速度(或總量)時，化學毒物或其代謝產(chǎn)物就有可能在機體內(nèi)逐漸增加并貯留，這種現(xiàn)象稱為化學毒物的蓄積作用(accumulation)。

一、基本概念10/7/202338某些毒物多次以小劑量反復(fù)進入體內(nèi)，可表現(xiàn)出機體對該毒物的反應(yīng)性增強，即一次染毒不引起反應(yīng)的劑量，如多次重復(fù)染毒，則可能引起明顯的反應(yīng)甚至死亡。毒物的蓄積與進入機體的毒物劑量、重復(fù)染毒的間隔時間、毒性及代謝特點和機體反應(yīng)特性條件有關(guān)。10/7/202339

蓄積作用實際上有二個含義：

物質(zhì)蓄積(materialaccumulation)

功能蓄積(functionalaccumulation)蓄積作用及其評價一、基本概念10/7/202340物質(zhì)蓄積：實驗動物反復(fù)多次接觸化學物后，用化學分析方法能夠檢測到機體內(nèi)存在該化學物或代謝產(chǎn)物功能（機能）蓄積：有的化學物在長期接觸后，機體內(nèi)雖不能檢測到機體內(nèi)存在該化學物或代謝產(chǎn)物，卻出現(xiàn)了慢性毒性作用。10/7/202341功能蓄積可能是由于機體內(nèi)的化學物或其代謝產(chǎn)物的數(shù)量極微，不能檢測出物質(zhì)的蓄積或者是由于每次機體接觸化學物后所引起的損害累積所致10/7/202342蓄積作用的檢測方法應(yīng)用化學分析或其他技術(shù)測定化學物進入機體后在體內(nèi)含量的變化過程。該方法可確定化學的半衰期生物學方法：即將一次染毒與多次染毒所產(chǎn)生的生物學效應(yīng)進行比較，故該法所檢測的蓄積性不能區(qū)分功能蓄積和物質(zhì)蓄積。10/7/202343二、蓄積毒性試驗方法及其評價化學毒物的蓄積作用是發(fā)生慢性中毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，因此研究化學毒物在機體內(nèi)的蓄積性是評價化學毒物能否引起潛在慢性毒性的依據(jù)之一，也是衛(wèi)生標準制訂過程選擇安全系數(shù)的主要依據(jù)。蓄積毒性試驗是研究化學毒物基礎(chǔ)毒性的重要內(nèi)容之一，目的是通過試驗求出蓄積系數(shù)K，了解化學毒物蓄積毒性的強弱，并為慢性毒性試驗及其他有關(guān)毒性試驗的劑量選擇提供參考。10/7/202344(一)蓄積系數(shù)法

蓄積系數(shù)(accumulationcoefficient)是多次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)效應(yīng)(或死亡)的累積劑量[ED50(n)]與一次染毒使半數(shù)動物出現(xiàn)相同效應(yīng)(或死亡)的劑量[ED50(1)]的比值，即：K＝ED50(n)/ED50(1)K＝LD50(n)/LD50(1)蓄積作用及其評價二、蓄積毒性試驗方法及其評價10/7/202345(2)蓄積系數(shù)法常用試驗方案

①固定劑量法②劑量遞增法③劑量固定的20天蓄積法10/7/202346①固定劑量法動物：常用大鼠或小鼠分2組：染毒組和對照組每組至少20只，雌雄各半。固定劑量：1/20～1/5LD50

每日固定劑量、定時和相同途徑染毒終止時間：試驗組累計發(fā)生一半動物死亡。如接觸劑量已累計達5個LD50，也可終止。實驗期限：最短為25天，最長100天。10/7/202347②劑量遞增法動物：常用大或小鼠40只（或更多）分組：染毒組和對照組每組至少20只，雌雄各半。終止時間：試驗組累計發(fā)生一半動物死亡。在第21天也可結(jié)束，因累計劑量已達5.26LD50。試驗最長為28天。10/7/2023480.400.600.901.362.003.004.48每日接觸劑量（LD50）接觸天數(shù)四日接觸總劑量（LD50）累積接觸總劑量（LD50）14589121316172021242528

0.100.150.220.340.500.751.12

劑量遞增法使用劑量表0.401.001.903.265.268.2612.74

10/7/202349分組劑量

1/20LD501/10LD501/5LD501/2LD50對照組染毒1次/d×20dn

10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）③劑量固定的20天蓄積法10/7/202350分組劑量1/20LD501/10LD501/5LD501/2LD50對照組n10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）10（♀♂）死亡╳╳╳╳╳蓄積性不明顯死