Tan第三章 基因工程的載體

本課程內(nèi)容第一章緒論第二章基因克隆的工具酶第三章基因工程的載體第四章目的基因的制備第五章目的基因?qū)牒椭亟M子的篩選第六章外源基因的表達第七章基因操作的基本技術第八章植物基因工程及應用第九章動物基因工程及應用第十章醫(yī)學基因工程及應用10/7/20231歡迎同學們聽課！第三章基因工程的載體3.1載體的功能及其特征3.2質(zhì)?？寺≥d體3.3病毒（噬菌體）克隆載體3.4酵母載體3.5人工染色體克隆載體10/7/20232歡迎同學們聽課！3.1載體的功能及其特征載體：攜帶外源DNA進入宿主細胞的工具。載體：指能夠運載外源DNA片段（目的基因）進入受體細胞，具有自我復制能力，使外源DNA片段在受體細胞中得到擴增和表達，不被受體細胞的酶系統(tǒng)所破壞的一類DNA分子。載體的功能:1.運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞

2.為外源基因提供復制能力或整合能力

3.為外源基因的擴增或表達提供條件

10/7/20233歡迎同學們聽課！作為工程載體必備的條件具有多個單一的限制性內(nèi)切酶酶切位點有復制起點，在受體細胞中能自我復制，或整合到染色體DNA上隨染色體DNA的復制而同步復制。具有篩選轉(zhuǎn)化子的選擇性標記基因安全，不含對受體細胞有害的基因，不會任意轉(zhuǎn)入受體細胞以外的其它生物細胞中。分子量小，拷貝數(shù)多。攜帶外源基因的幅度寬10/7/2023Slide

410/7/20234歡迎同學們聽課！自主復制型載體和附加載體的擴增方式10/7/20235歡迎同學們聽課！載體的類型應用范圍：克隆載體、表達載體。應用對象：原核載體、真核載體（酵母、植物和動物）、穿梭載體。構建來源：質(zhì)粒載體、病毒或噬菌體載體、質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的載體、質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的載體。10/7/2023Slide

610/7/20236歡迎同學們聽課！克隆載體(cloningvector)

用于在受體細胞中進行目的基因擴增的載體。一般具有較低的分子量、較高的拷貝數(shù)和松弛型復制子。主要由細菌質(zhì)粒或與其它質(zhì)粒、噬菌體及真核生物病毒的DNA重組構建。10/7/2023Slide

710/7/20237歡迎同學們聽課！表達載體(expressionvector)

使目的基因在宿主細胞中得以表達的載體?？蓪⒅亟M體DNA導入適合的受體細胞，使所載的目的基因能夠復制、轉(zhuǎn)錄和翻譯。10/7/2023Slide

810/7/20238歡迎同學們聽課！穿梭載體(shuttlevector)

又稱雙功能載體(bifunctionalvector)。能在兩種不同的生物體內(nèi)復制的載體。同時具有細菌質(zhì)粒的復制原點和真核生物可識別的病毒復制原點或酵母菌的自主復制序列(ARS)，它即能在原核細胞中擴增又能在真核細胞中復制和表達。主要用于原核細胞與真核細胞之間進行基因轉(zhuǎn)移，通常是將載體和待克隆的真核生物DNA片段先在細菌中克隆，再轉(zhuǎn)移到真核細胞中表達，并可提高外源基因的表達效率。10/7/2023Slide

910/7/20239歡迎同學們聽課！病毒載體(virusvector)常用的動物病毒表達載體可分為兩大類：整合型（integrated）載體:即外源基因通過這種病毒載體與宿主細胞的染色體整合，外源基因隨宿主細胞基因組的復制而擴增。這類載體的代表是SV40－PSV系列和逆轉(zhuǎn)錄病毒－逆轉(zhuǎn)錄病毒表達載體pLPGHL、pMSV

等。游離型(transient)或稱病毒顆粒型載體:這類載體攜帶外源基因后，本質(zhì)上仍然是一種完整或缺損的病毒，能夠以病毒顆粒的形式在宿主內(nèi)自行復制或在輔助病毒存在下進行復制。這類載體有痘苗病毒、腺病毒、桿狀病毒10/7/202310歡迎同學們聽課！載體從構建來源分質(zhì)粒載體病毒或噬菌體載體質(zhì)粒DNA與病毒或噬菌體DNA組成的載體質(zhì)粒DNA與染色體DNA片段組成的載體10/7/2023Slide

1110/7/202311歡迎同學們聽課！3.2質(zhì)?？寺≥d體3.2.1質(zhì)粒的生物學特性3.2.1.1質(zhì)粒DNA的復制3.2.1.2質(zhì)粒DNA的不親和性或互不相容性3.2.1.3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移和遷移性3.2.1.4質(zhì)粒的重組性3.2.1.5顯性質(zhì)粒和隱性質(zhì)粒3.2.2質(zhì)粒載體的構建3.2.2.1理想的質(zhì)粒載體應具備的條件3.2.2.2構建質(zhì)粒載體應遵循的原則3.2.2.3常見質(zhì)粒載體及其構建3.2.2.4質(zhì)粒載體的評價10/7/2023Slide

1210/7/202312歡迎同學們聽課！質(zhì)粒（plasmid）指獨立存在于宿主細胞染色體外、能夠自我復制的DNA分子。廣泛存在于細菌細胞中，在某些藍藻、真菌和綠藻細胞中也發(fā)現(xiàn)；在酵母、眼蟲、衣藻等真核生物中也存在。絕大多數(shù)為環(huán)狀雙鏈DNA分子；極少數(shù)為線性質(zhì)粒和RNA質(zhì)粒。環(huán)狀雙鏈質(zhì)粒DNA的三種構型：超螺旋(SC)/共價閉合環(huán)形(cccDNA,covalentlyclosedcircularDNA)；開環(huán)(oc-DNA,opencircularDNA)；線性(L-DNA,linearDNA)10/7/2023Slide

1310/7/202313歡迎同學們聽課！10/7/202314歡迎同學們聽課！3.2.1質(zhì)粒的生物學特性（一）自主復制性

質(zhì)粒DNA攜帶有自己的復制起始區(qū)（ori）以及一個控制質(zhì)?？截悢?shù)的基因，因此它能獨立于宿主細胞的染色體DNA而自主復制。不同的質(zhì)粒在宿主細胞內(nèi)的拷貝數(shù)也不同，少則幾個多則幾百個不等，當然由于質(zhì)粒上并沒有復制酶的基因，所以其復制需要使用宿主細胞復制染色體DNA的多種酶群。

（二）不相容性

利用同一復制系統(tǒng)的不同質(zhì)粒（RNAIRNAIIRop因子）如果被導入同一細胞中，它們在復制及隨后分配到子細胞的過程中，就會彼此競爭，它們在單細胞中的拷貝數(shù)也會有差異，拷貝多的復制更快，結果在細菌繁殖幾代之后，細菌的子細胞中絕大多數(shù)都含有占優(yōu)勢的質(zhì)粒，因而這兩種質(zhì)粒中只能有一種長期穩(wěn)定地留在細胞中，這就是所謂的質(zhì)粒不相容性。10/7/202315歡迎同學們聽課！（三）可擴增性

質(zhì)粒就其復制方式而言分為兩類：松弛型復制及嚴謹型復制。pMB1或ColEI類質(zhì)粒復制子的復制完全依靠宿主細胞提供的半衰期較長的復制酶及蛋白因子（DNA聚合酶I，III，RNA聚合酶以及dnaB、dnaC、dnaD、dnaZ的產(chǎn)物），因此在蛋白質(zhì)合成中斷時，質(zhì)粒復制能持續(xù)合成，這樣當用氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成并阻斷細菌染色體復制時，帶有pMB1或ColEI復制子的質(zhì)粒將利用豐富的原料大量復制，最后每個細胞可以積聚2000-3000個拷貝，這叫做氯霉素擴增。

但另外兩種質(zhì)粒（psc101和p15A）的復制子的復制受質(zhì)粒上編碼的蛋白因子的正調(diào)節(jié)。氯霉素抑制蛋白質(zhì)合成后，這類質(zhì)粒便不能持續(xù)復制。10/7/202316歡迎同學們聽課！（四）可轉(zhuǎn)移性

在天然條件下，很多天然質(zhì)粒都可以通過細菌接合作用從一種宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)移到另外一種宿主內(nèi)，這種轉(zhuǎn)移依賴于質(zhì)粒上的tra基因產(chǎn)物。10/7/202317歡迎同學們聽課！3.2.1.1質(zhì)粒DNA的復制受質(zhì)粒和宿主細胞雙重遺傳系統(tǒng)的控制質(zhì)粒：（1）復制起點（2）控制質(zhì)粒DNA復制強度的有關基因：cop:指令宿主細胞合成阻遏物，阻遏物的累積阻止質(zhì)粒的繼續(xù)復制。

rep:指令宿主細胞合成一種調(diào)節(jié)蛋白，促進質(zhì)粒的復制。

par序列:該序列附著在細胞膜上，使質(zhì)粒分子在細胞分裂時正確地分配到子細胞中，維持相對穩(wěn)定的拷貝數(shù)。10/7/2023Slide

1810/7/202318歡迎同學們聽課！松弛型和嚴謹型質(zhì)粒拷貝數(shù)（copies）：指一個宿主細胞內(nèi)某種質(zhì)粒的數(shù)量與宿主染色體數(shù)量（通常為一條染色體）之比。嚴謹型質(zhì)粒(stringentplasmid):拷貝數(shù)為1至幾個的質(zhì)粒。松弛型質(zhì)粒(relaxedplasmid):拷貝數(shù)多于10個的質(zhì)粒。嚴謹或松弛與質(zhì)粒的大小及宿主類型有關。含松弛型質(zhì)粒的細菌在含氯霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，可使質(zhì)粒大量擴增。10/7/2023Slide

1910/7/202319歡迎同學們聽課！3.2.1.2質(zhì)粒DNA的不親和性或互不相容性（incompatibility）指在無選擇壓力的情況下，兩種親緣關系密切的不同質(zhì)粒不能在同一個寄主細胞中穩(wěn)定共存的現(xiàn)象。親和性質(zhì)粒：指能同寓于一細胞中的不同質(zhì)粒。不親和性質(zhì)粒：指不能同寓于一細胞中的不同質(zhì)粒。一般為親緣關系密切的質(zhì)粒；野生型質(zhì)粒與其衍生的重組質(zhì)粒。10/7/2023Slide

2010/7/202320歡迎同學們聽課！質(zhì)粒不親和性的機制受相同阻遏物的制約在細胞膜上有相同的結合位點10/7/202321歡迎同學們聽課！3.2.1.3質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移和遷移接合質(zhì)粒(conjugativeplasmid)：指質(zhì)粒所攜帶的基因的功能是使細胞彼此有效地接觸，以便將質(zhì)粒DNA從供體細胞轉(zhuǎn)移至受體細胞。如：質(zhì)粒上的tra基因使宿主細胞（大腸桿菌）產(chǎn)生菌毛，合成細胞表面物質(zhì)，促使宿主細胞與受體細胞接合。分子較大、拷貝數(shù)少、宿主廣、自行接合轉(zhuǎn)移、較不安全。如：F質(zhì)粒、Ti質(zhì)粒等。非接合質(zhì)粒(non-conjugativeplasmid)：分子小、拷貝數(shù)多、不會自行接合轉(zhuǎn)移，安全。如：ColE1質(zhì)粒等?；蚬こ讨羞x用10/7/2023Slide

2210/7/202322歡迎同學們聽課！遷移作用(mobilization)指在接合質(zhì)粒的共存下引發(fā)的非接合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移特性。由mob和bom兩個基因控制基因工程常利用mob和bom基因缺陷型（mob–,bom–）的質(zhì)粒和菌株10/7/2023Slide

2310/7/202323歡迎同學們聽課！3.2.1.4質(zhì)粒的重組性由rec基因控制，使質(zhì)粒整合到染色體基因組上。在基因工程應用的是重組缺陷型（rec–）的質(zhì)粒和菌株。10/7/2023Slide

2410/7/202324歡迎同學們聽課！3.2.1.5顯性質(zhì)粒和隱性質(zhì)粒顯性質(zhì)粒（表達型質(zhì)粒）：指攜帶除與自身復制和轉(zhuǎn)移相關的基因，還攜帶一些使宿主細胞呈現(xiàn)新性狀基因的質(zhì)粒。如：抗抗菌素的抗性質(zhì)粒（R質(zhì)粒）；產(chǎn)大腸桿菌素（colicins）的Col質(zhì)粒；引起細胞接合的育性質(zhì)粒（F質(zhì)粒）；降解金屬有機物、芳香烴和農(nóng)藥等毒物降解的降解質(zhì)粒；及致植物形成冠癭瘤的Ti質(zhì)粒。隱性質(zhì)粒：宿主含有某種質(zhì)粒，但無異樣的性狀表現(xiàn)出來，這樣的質(zhì)粒稱隱性質(zhì)粒。10/7/2023Slide

2510/7/202325歡迎同學們聽課！根據(jù)質(zhì)粒基因編碼的特性將質(zhì)粒分為五大類Fertility/F質(zhì)粒：只含有tra基因，除了促進接合轉(zhuǎn)移外沒有其他功能。

Resistance/R質(zhì)粒：含有氯霉素、青霉素等抗性基因。如RP4，發(fā)現(xiàn)于假單胞桿菌。

Col質(zhì)粒：編碼大腸菌素，可以殺死其他細菌，如存在于E.coli中的CoE1。降解質(zhì)粒（Degradativeplasmids）:可以降解特殊的分子如：甲苯，水楊酸。

致瘤質(zhì)粒（Virulenceplasmids）：農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒。10/7/202326歡迎同學們聽課！利用抗性基因進行重組子的篩選10/7/202327歡迎同學們聽課！3.2.2質(zhì)粒載體的構建3.2.2.1理想的質(zhì)粒載體應具備的條件3.2.2.2構建質(zhì)粒載體應遵循的原則3.2.2.3常見質(zhì)粒載體及其構建3.2.2.4質(zhì)粒載體的評價10/7/202328歡迎同學們聽課！引序（一）天然存在的兩種質(zhì)粒（1）colE1宿主細菌大腸桿菌6.5kb松弛型復制20-30/cell

（2）pSC101宿主細菌沙門氏菌8.8kb嚴謹型復制5copy/cell標記基因為Tcr質(zhì)粒的命名

p小寫代表質(zhì)粒；后面有兩至三個大寫字母代表發(fā)現(xiàn)者或構建者的姓名。10/7/202329歡迎同學們聽課?。ǘ?/p>

質(zhì)粒人工構建的目的

天然質(zhì)粒往往存在著這樣或那樣的缺陷，因而不適合用作基因工程的載體必須對之進行改造構建：

（1）加入合適的選擇標記基因，如兩個以上，易于用作選擇

（2）增加或減少合適的酶切位點，便于重組

（3）縮短長度，切去不必要的片段，提高導入效率，增加裝載量

（4）改變復制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝

（5）根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件

方法就是重組，拼拼接接，挖肉補瘡。10/7/202330歡迎同學們聽課！3.2.2.1理想的質(zhì)粒載體應具備的條件分子量較小。松馳型，在受體細胞中有較多的拷貝數(shù)。具有一個以上的選擇標記基因，形成重組質(zhì)粒后，至少還要有一個強的選擇標記。具有允許外源DNA片段克隆的位點，并且位于選擇標記基因區(qū)內(nèi)，插入外源片段不影響質(zhì)粒的復制功能。能夠?qū)爰闹骷毎?，具備轉(zhuǎn)化的功能。操作簡單方便，可根據(jù)需要加裝其它元件，構建不同用途的質(zhì)粒載體。天然質(zhì)粒載體的局限性：天然的質(zhì)粒不能具備以上所有條件，所以實際應用的都是人工構建的質(zhì)粒。10/7/2023Slide

3110/7/202331歡迎同學們聽課！3.2.2.2構建質(zhì)粒載體應遵循的原則選用合適的出發(fā)質(zhì)粒正確獲得構建質(zhì)粒克隆載體的元件根據(jù)要轉(zhuǎn)化的受體細胞的特性，組裝合適的選擇標記基因。構建質(zhì)粒表達載體，選用合適的啟動子。力求構建過程簡單化10/7/2023Slide

3210/7/202332歡迎同學們聽課！3.2.2.3常見質(zhì)粒載體及其構建人工構建的質(zhì)粒根據(jù)其功能及用途分為:

1.多拷貝質(zhì)粒復制子經(jīng)過人工突變，除去控制拷貝數(shù)負調(diào)節(jié)基因，使質(zhì)?？截悢?shù)達到每個細胞數(shù)千，用于擴增外源基因。

2.測序質(zhì)粒

3.整合質(zhì)粒裝有整合促進基因及整合特異序列，便于外源基因準確重組整合入受體細胞的染色體上

4.穿梭質(zhì)粒含有兩個不同的復制子，能在兩種不同的受體細胞中復制10/7/2023Slide

3310/7/202333歡迎同學們聽課！

5.表達質(zhì)粒裝有強的啟動基因，合適的順序以及有效的終止子，以便任何外源基因在受體細胞內(nèi)的高效表達

6.探針質(zhì)粒篩選克隆或?qū)ふ一蛟?，通常裝有一個可以定量測定其表達的標記基因，如抗性基因。篩選啟動基因、終止子等(下圖)。10/7/202334歡迎同學們聽課！10/7/202335歡迎同學們聽課！實驗室常用質(zhì)粒：1.pBR322質(zhì)粒載體的構建：出發(fā)質(zhì)粒：pMB1:類似松弛型ColE1質(zhì)粒pSF2124:含Ampr基因pSC101:含Tcr基因10/7/2023Slide

3610/7/202336歡迎同學們聽課！pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)缺點優(yōu)點：分子量?。?363bp,容易純化。含有2個抗生素抗性基因Ampr和Terr，可以作為選擇標記。而且每一個標記基因都含有單一的酶切位點，可以插入DNA，amp基因內(nèi)可被PstI,PvuI,SacI切開，而四環(huán)素抗性基因可被BamHI,HindIII切開，通過插入失活篩選重組子。受體細胞內(nèi)，pBR322以多拷貝存在，一般一個細胞內(nèi)可達到15個，而在蛋白質(zhì)合成抑制劑存在條件下，如氯霉素，可達到1000-3000拷貝，cpoies。10/7/202337歡迎同學們聽課！缺點：有被動遷移的可能，不夠安全。抗生素標記插入失活篩選為負篩選法，比較麻煩。10/7/202338歡迎同學們聽課！pBR322質(zhì)粒載體10/7/202339歡迎同學們聽課！2.pBR327：一個多拷貝質(zhì)粒pBR327是在pBR322的基礎上去掉了1089bp的片段，留下了ampR和tetR的完整片段，但改變了質(zhì)粒的復制和接合能力。他與pBR322這要有兩點不同：

1）pBR327比pBR322有更高的拷貝，每個細胞中含有30-45個拷貝。但正常細胞中較高的拷貝數(shù)，使它適合于應用于基因功能研究。

2）剪切破壞了pBR322的接合能力，pBR327不具有接合能力，不能直接轉(zhuǎn)入其他細胞。這對生物biologicalcontainment是非常重要的（生物防范）。10/7/202340歡迎同學們聽課！pBR327：一個多拷貝質(zhì)粒10/7/202341歡迎同學們聽課！3.pUC8－Lac選擇質(zhì)粒pUC8也來自于pBR322，但只保留了復制起點和ampR位點，ampR基因的序列已改變限制性位點不再存在，所有的克隆位點集中在lacZ基因內(nèi)的一個小片段上。

pUC8的優(yōu)點：

1）突變位點位于復制起點，復制前可以使細胞中質(zhì)粒的拷貝數(shù)達到500-700個，可以提高載體的產(chǎn)量。

2)重組子的鑒定可一步完成，固體培養(yǎng)基中添加amp和X-gal,IPTG，節(jié)約了一半的時間。

3）pUC8的多克隆位點，可以使具有不同粘端的DNA片段插入載體，而不必連接linker。

4）載體中的多克隆位點與M13mp系列的載體是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接轉(zhuǎn)入M13mp載體，可以進行DNA測序和體外定點突變。10/7/202342歡迎同學們聽課！10/7/202343歡迎同學們聽課！4.pGEM3Z-DNA的體外轉(zhuǎn)錄pGEM3Z與pUC載體非常相似，不同的是pGEM3Z含有兩段額外的短的DNA片段，每一段可以作為RNA聚合酶的識別位點。這兩段啟動子存在于限制性內(nèi)切酶的兩端，這意味著如果在重組的pGEM3Z載體中加入RNA聚合酶，可以發(fā)生轉(zhuǎn)錄，合成的RNA可以作為探針使用，或者研究RNA的加工過程或者蛋白質(zhì)的合成。10/7/202344歡迎同學們聽課！10/7/202345歡迎同學們聽課！實驗一質(zhì)粒的制備實驗課上具體講解10/7/202346歡迎同學們聽課！3.2.2.4質(zhì)粒載體的評價操作簡便克隆容量有限（<10kb）10/7/2023Slide

4710/7/202347歡迎同學們聽課！3.3病毒（噬菌體）克隆載體3.3.1噬菌體的生物學特性3.3.2噬菌體載體3.3.3柯斯載體3.3.4M13單鏈絲狀噬菌體載體10/7/2023Slide

4810/7/202348歡迎同學們聽課！噬菌體(phage)感染細菌的病毒10/7/2023Slide

4910/7/202349歡迎同學們聽課！3.3.1噬菌體的生物學特性具有對寄主的依賴性。利用寄主的蛋白合成和復制系統(tǒng)進行生長和繁殖。具有高感染性感染途徑：溶菌生長；溶原生長10/7/2023Slide

5010/7/202350歡迎同學們聽課！噬菌體溶菌生長溶菌生長:噬菌體感染宿主細胞后，大量增殖子代噬菌體顆粒，使宿主細胞裂解，釋放出來的病毒顆粒又再感染其它細胞，這種周而復始的生命過程（生活周期）稱溶菌生長。烈性噬菌體：噬菌體感染宿主細胞后，DNA不整合到宿主染色體，只進行溶菌生長，這樣的噬菌體稱烈性噬菌體。10/7/2023Slide

5110/7/202351歡迎同學們聽課！噬菌體溶原生長溶原生長：噬菌體感染細菌，DNA整合到寄主染色體中，隨寄主細胞染色體的復制而復制，寄主細胞仍然正常分裂，并不死亡，這種生命過程叫作溶原生長。溫和噬菌體（temperatephage）：病毒感染宿主細胞后DNA整合到寄主染色體中，無感染其它細胞的能力，這樣的病毒，稱溫和噬菌體。溶原性細菌（lysogen）：細菌染色體中整合有噬菌體基因組的細菌。對同種噬菌體具有免疫性。溶原化（lysogenization）：用溫和噬菌體感染細菌使之成為溶原性細菌的過程。原噬菌體（prophage）：在溶原性細菌內(nèi)存在的整合噬菌體DNA，稱原噬菌體。10/7/2023Slide

5210/7/202352歡迎同學們聽課！3.3.2噬菌體載體3.3.2.1噬菌體的性質(zhì)3.3.2.2噬菌體載體構建的原理3.3.2.3重組DNA分子的體外包裝3.3.2.4噬菌體載體的評價10/7/2023Slide

5310/7/202353歡迎同學們聽課！3.3.2.1

噬菌體的性質(zhì)野生型入噬菌體DNA為雙鏈線性分子黏性末端(cohesiveend)：線性分子左右兩端各有12bp組成的5端突出的粘性末端，DNA進入宿主細胞后黏性末端連接形成環(huán)DNA分子。cos位點(cohesiveendsite)：指在連接酶的作用下，連接上述黏性末端結合形成的雙鏈DNA區(qū)段。又稱黏性末端位點。全長48,502bp，約有20kb的區(qū)域為為噬菌體生長非必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。入噬菌體DNA分子上有56種限制性核酸內(nèi)切酶識別位點。溫和噬菌體，易于在溶源生長保存，在溶菌生長增殖。10/7/2023Slide

5410/7/202354歡迎同學們聽課！λ噬菌體的侵染循環(huán)10/7/202355歡迎同學們聽課！3.3.2.2噬菌體載體構建的原理建立λ克隆載體前需要解決2個問題

1）λDNA分子只能增加5%的大小，意味著只能插入3kb的DNA分子。

2）λ基因組非常大，對于每一種酶來講都含有超過1個的識別序列，酶切后產(chǎn)生多個片段，連接不能形成λ基因組。

Ⅰ.縮短長度

野生型λ－DNA包裝的上限為50.5kb，本身長度為48.5kb，那么外源DNA片段允許插入的大小至多為2.4kb，這樣才能被包裝成有感染能力的噬菌體顆粒，如果將縮短便提高裝載量。其實λ－DNA上約有40-50%的DNA片段是復制，裂解所不必需的，將之切除便可提高載量。10/7/202356歡迎同學們聽課！λ－DNA的結構

10/7/202357歡迎同學們聽課！10/7/202358歡迎同學們聽課！策略：利用限制性內(nèi)切酶切去入DNA上非必需區(qū)。采用點突變或甲基化酶處理，使入DNA上必需。區(qū)內(nèi)多余的限制性內(nèi)切酶識別位點失效在入DNA的非必需區(qū)內(nèi)組入選擇性標記基因建立重組入DNA分子體外包裝體系10/7/202359歡迎同學們聽課?、?縮短長度:入噬菌體載體的類型

插入型載體(insertionvector)該類載體經(jīng)改造后的長度為37kb，為包裝的下限，它本身也能被包裝，其允許的插入片段最大為13.9kb（54.9-37kb）。由于該類載體重組與否均可包裝，因而為區(qū)分重組子與非重組子必須攜帶標記基因。（0-13.9kb）

λgt10，可以攜帶8kb的DNA分子，插入位于阻遏基因cI內(nèi)的單一的酶切位點EcoRI。插入失活導致裂解循環(huán)，從而很容易識別重組子。

λZAPII，含有多聚接頭，可以使用六種不同的限制性內(nèi)切酶插入約10kb的新的DNA分子，通過lacZ’基因的插入失活鑒定重組子，不能形成藍色的噬菌斑。10/7/202360歡迎同學們聽課！插入型載體10/7/202361歡迎同學們聽課！Ⅰ.縮短長度:入噬菌體載體的類型

替換型載體(replacementvector)該類載體經(jīng)改造后的長度約為40kb，但在非必需區(qū)域內(nèi)含有兩個相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或saλI），兩者間的距離為14kb長，使用時用酶切開，分離去除這個14kb長的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。顯而易見，這類載體的容量不僅比插入型載體大，而且有一個下限：40-14kb=26kb包裝下限為36.4kb，因此其載裝下限為10.4而上限為25.5kb。這類載體實際上已經(jīng)不再需要標記基因，因為空載的載體DNA只有26kb，不可能被包裝，因而無法進入受體細胞中去，當然這類載體的使用較為繁瑣，現(xiàn)在商品化了的取代型載體已去除了中間片段（14kb）解決了這一問題。10/7/202362歡迎同學們聽課！

λWES.λB’，兩個EcoRI位點跨越替換區(qū)域，根據(jù)分子大小篩選重組子。

λEMBL4，可以插入20kb的DNA分子，可利用EcoRI、BamHI、SalI替換填充片段，因此可以插入不同粘端的DNA片斷。重組子的篩選可以根據(jù)片段的大小也可以利用Spi表現(xiàn)型。(課外資料)EMBL3和EMBL4是常用的基因組克隆載體，克隆外源片段的大小為9-23kb。兩載體均在填充片段內(nèi)含有red及gam基因。red及gam基因使噬菌體無法在一些宿主菌中生長，這些宿主菌是非類似噬菌體P2的溶源菌株（比如，這些菌株在基因組內(nèi)有P2基因組的一個拷貝。當填充片段被外源片段取代時，重組菌株成為red-及gam-，能在P2的溶源菌株中生長。這一現(xiàn)象稱為spi-篩選（對P2介入敏感）；spi-篩選不利于親代載體，可降低非重組子的數(shù)目。10/7/202363歡迎同學們聽課！取代型載體10/7/202364歡迎同學們聽課?、?修飾酶切識別位點天然的λ-DNA上有多個酶切位點，如：EcoRI5個，HindIII7個，這些多余的酶切位點必須被修飾。一般利用自然選擇法獲得限制性位點缺失的λ品系。自然選擇法可以利用一個產(chǎn)生EcoRI的大腸桿菌，大部分侵入細胞的λDNA分子會被限制性酶破壞，少部分能夠成活，這些就是突變型的噬菌體，其EcoRI位點缺失了。10/7/202365歡迎同學們聽課！通過自然選擇法篩選無EcoRI識別位點10/7/202366歡迎同學們聽課！λ-DNA的抽提1)大腸桿菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（在含有乳糖的培養(yǎng)基中）

2)加入λ-噬菌體或重組λ－噬菌體懸浮液，37℃培養(yǎng)1小時

3)用新鮮培養(yǎng)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4-12小時

4)高速離心，沉淀噬菌體

5)苯酚抽提，釋放λ-DNA

6)乙醇或異丙醇沉淀DNA10/7/202367歡迎同學們聽課！3.3.2.3重組DNA分子的體外包裝入噬菌體DNA必須進行體外包裝，才能成為有活性的病毒顆粒。入噬菌體的包裝容量為野生型入噬菌體DNA（48kb）的75％～105％，即約36.4~51kb.從入噬菌體突變株感染的溶原菌株，提取噬菌體包裝所需的全部蛋白質(zhì)。2005年8月11日6時44分Slide

6810/7/202368歡迎同學們聽課！3.3.2.4噬菌體載體的評價λ-DNA作為載體的優(yōu)點1)λ-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效感染大腸桿菌2)λ-DNA作為載體，其裝載外源DNA的能力為25kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量3)重組λ-DNA的篩選較為方便,可進行正向篩選和雜交篩選。4)重組λ-DNA分子的提取比質(zhì)粒容易操作較復雜10/7/2023Slide

6910/7/202369歡迎同學們聽課！3.3.3柯斯質(zhì)粒載體或稱粘粒(cosmid)cosmid:cossite-carryingplasmid雜種質(zhì)粒是一類人工構建的含有入DNAcos位點、噬菌體包裝有關的DNA短序列（具有噬菌體的高感染性）、質(zhì)粒DNA復制子、抗生素標記基因等元件的特殊質(zhì)粒載體。在宿主細胞中可以作為正常噬菌體進行復制，但不表達噬菌體的任何功能。10/7/2023Slide

7010/7/202370歡迎同學們聽課！（一）考斯質(zhì)粒的構建λ-DNA載體的最大裝載量為25kb,有的往往需要構建克隆更大的外源DNA片段，考斯質(zhì)粒就是應這種需要而人工組建的。考斯質(zhì)粒顧名思義就是含有λ-DNA兩端cos區(qū)的質(zhì)粒。由于λ-DNA包裝時，其包裝蛋白只識別粘性末端附近的一小段順序，約1.5kb長。如果將這一小段DNA與質(zhì)粒連在一起，則這個重組質(zhì)粒就可裝載更大的外源DNA片段，同時它仍可象λ-DNA一樣，被包裝成有感染活性的噬菌體顆粒，并高效感染大腸桿菌，與噬菌體DNA所不同的是，考斯質(zhì)粒不能在體內(nèi)被包裝，更不能裂解細胞，它的制備與質(zhì)粒相同。進入細胞后，質(zhì)粒上的復制子進行復制。

10/7/202371歡迎同學們聽課！Cos質(zhì)粒pJB810/7/202372歡迎同學們聽課?。ǘ〤osmid載體的特點為雙鏈環(huán)狀DNA分子。分子小，約4—6kb，可容納大～40kb的外源DNA片段。適用于構建真核細胞的基因組文庫。具有質(zhì)粒的特性，可以轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并按質(zhì)粒的復制方式進行復制和增殖。具有噬菌體的特性，在體外進行包裝后，可高效轉(zhuǎn)導大腸桿菌，但不能進入溶菌和溶原生長，不能產(chǎn)生子代噬菌體。含有抗藥性基因，可進行插入失活篩選。由于非重組體很小，不能在體外包裝,因此非重組體的本底很低，利于重組克隆的篩選。由于質(zhì)粒上的多種單一酶切位點，便于克隆。10/7/202373歡迎同學們聽課！3.3.4M13單鏈絲狀噬菌體載體（一）M13單鏈噬菌體的分子生物學：M13是一種線狀、單鏈DNA噬菌體，總長6407bp。M13的侵染周期也很短，不需要插入寄主的基因。噬菌體首先吸附大腸桿菌的雄性鞭毛上，然后穿過鞭毛內(nèi)孔將DNA注入細菌體內(nèi)。單鏈DNA利用宿主細胞復制另一條鏈（負鏈），形成雙鏈DNA（RFDNA），然后以負鏈為模板，滾筒式復制串聯(lián)式上鏈分子，當拷貝數(shù)達到100-200時，負鏈上的基于產(chǎn)物干擾復制，使其停止，同時，由兩條鏈上編碼的蛋白基因表達，包裝正鏈，并分泌至體外，宿主細胞不會發(fā)生裂解。細菌細胞每分裂一次，大約可以釋放1000個新的病毒顆粒。10/7/202374歡迎同學們聽課！M13噬菌體的侵染循環(huán)10/7/202375歡迎同學們聽課?。ǘ㎝13-DNA載體家族

1.M13mp載體家族

M13-DNA上幾乎沒有非必需區(qū)域，因而載體的構建主要是插入標記基因如，lacZ'、多克隆位點，消除多余的酶切位點。在M13上引入lacZ’基因，產(chǎn)生了M13mp1，這樣就可以通過插入失活鑒定重組噬菌斑。

M13mp1載體不含有任何的單一切點的的識別序列，在基因的起始端，含有6堿基的序列GCATTC，是一個EcoRI位點，這是通過體外定點突變獲得的，產(chǎn)生了M13mp2。M13mp210/7/202376歡迎同學們聽課！是最簡單的M13克隆載體，具有EcoRI粘端的DNA片段可以插入克隆位點，在X-gal培養(yǎng)基上可以很容易的區(qū)別出來。

M13載體的構建的第二步是將限制性內(nèi)切酶位點引入lacZ’基因，這一步是通過合成短的多聚核苷酸稱為polylinker，含有一系列的限制性位點和EcoRI粘端，完成的。多聚接頭插入到M13mp2的EcoRI位點上，就產(chǎn)生了M13mp7。10/7/202377歡迎同學們聽課！外源基因由M13mp8向M13mp9載體的轉(zhuǎn)10/7/202378歡迎同學們聽課！2.噬菌粒（Phagemid）質(zhì)粒與M13-DNA的重組體，它帶有質(zhì)粒上的酶切位點及標記基因，這樣便于篩選及克隆，同時由于不含包裝蛋白基因，載體本身長度減少，裝載量增大，比質(zhì)粒大，但不及λ-DNA。10/7/202379歡迎同學們聽課！pEMBL8的結構10/7/202380歡迎同學們聽課！將pEMBL8轉(zhuǎn)化為單鏈形式10/7/202381歡迎同學們聽課?。ㄈ㎝13-DNA作為載體的優(yōu)點及用途最為顯著的優(yōu)點是它能使插入的外源DNA片段變成單鏈，用途：

（1）用于雙脫氧末端終止測定DNA順序

（2）用于單鏈DNA的定點誘變

（3）用于合成探針10/7/202382歡迎同學們聽課！3.4酵母載體酵母是生物技術中最重要的生物體之一，除了釀酒和生產(chǎn)面包外，也被用來作為基因克隆的受體生產(chǎn)藥物。在酵母S.cerevisiae的大部分品系中都發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒的存在，它是一個2um環(huán)狀的分子。10/7/202383歡迎同學們聽課！(一)2um質(zhì)粒的選擇標記2um質(zhì)粒是非常好的克隆載體，它有6kb大小，在酵母細胞中的拷貝數(shù)在70-200之間，利用質(zhì)粒的復制起始位點進行復制，許多酶由寄主細胞提供，質(zhì)粒中含有編碼蛋白質(zhì)的基因REP1,REP2。2um質(zhì)粒的問題：選擇標記的問題。在實踐中，利用酵母的正常的基因，一般是編碼氨基酸合成的酶，如LEU2基因編碼β-異丙基蘋果酸脫氫酶，參與丙酮酸向亮氨酸的轉(zhuǎn)化。為了利用LEU氨酸作為選擇標記，需要用到一種特殊的寄主，寄主必須是LEU-2營養(yǎng)缺陷體這樣的寄主只有在添加亮氨酸的條件下才能生長。質(zhì)粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培養(yǎng)基上生長。

10/7/202384歡迎同學們聽課！leu-作為酵母載體的選擇標記基因10/7/202385歡迎同學們聽課！(二)以2um質(zhì)粒為基礎的載體—酵母附加質(zhì)粒來自于2um質(zhì)粒的載體稱為酵母附加載體或者YEps。YEps可以含有完整的2um質(zhì)粒，也可以只含有2um質(zhì)粒的復制起點，如YEp13以后的類型。YEp13是一個穿梭質(zhì)粒，含有2um質(zhì)粒的復制起點和選擇基因LEU2,YEp13還包含pBR322的完整序列，因此可以在大腸桿菌也可以在酵母中進行選擇。操作步驟：首先要在大腸桿菌中進行克隆試驗，選擇重組子，重組質(zhì)粒純化后轉(zhuǎn)化酵母。

10/7/202386歡迎同學們聽課！YEp的結構10/7/202387歡迎同學們聽課?。ㄈ℡Ep可以插入酵母的染色體DNA附加體意味著YEp可以獨立的復制也可以整合到酵母的染色體內(nèi)，因為在載體中作為選擇標記的基因與突變體主染色體DNA同源性很高，比如YEp13質(zhì)粒中LEU2基因可以與染色體上突變的LEU2基因進行重組，將整個質(zhì)粒插入到酵母染色體內(nèi)，可以一直保持整合狀態(tài)，隨后的重組事件也可以切下來。10/7/202388歡迎同學們聽課！YEp整合到酵母染色體上10/7/202389歡迎同學們聽課！(四)其他類型的克隆載體除了YEps，還有其他類型的載體，下面介紹主要的兩種：酵母整合質(zhì)粒(YIps)：主要是細菌質(zhì)粒含有一個酵母基因。如YIp5，是在pBR322的基礎上插入了一個URA3基因，這個基因編碼乳清酸核苷-5’-磷酸脫羧酶，是嘧啶合成中的一個酶，可以作為選擇標記，選擇的方法與LEU2標記相同，YIp不能像質(zhì)粒一樣復制，其復制依賴于整合到酵母的染色體上，整合的機制與YEp相同

10/7/202390歡迎同學們聽課！酵母復制質(zhì)粒(YRps)：由于含有一段包括起始位點在內(nèi)的染色體DNA,可以作為獨立質(zhì)粒進行復制。復制起始位點與多個酵母基因距離很近，包括作為選擇標記的基因。YRp7是其中的一種，他由pBR322與酵母基因TRP1組成，TRP1參與色氨酸的合成，他與起始位點的距離非常近，插入YRp7的酵母DNA片段包括TRP1和復制起始位點。10/7/202391歡迎同學們聽課！整合型載體10/7/202392歡迎同學們聽課！在一個特定的克隆實驗中選用哪一種類型的質(zhì)粒需要考慮三個因素轉(zhuǎn)化頻率，也就是每ug的質(zhì)粒DNA可以獲得轉(zhuǎn)化子的數(shù)目。YEps的轉(zhuǎn)化頻率最高，每ugDNA可以獲得10000-100000個轉(zhuǎn)化細胞，YRps次之，可以產(chǎn)生1000-10000個轉(zhuǎn)化細胞，YIp產(chǎn)量較低，一般少于1000個，如果不是用特殊的程序，只能產(chǎn)生1-10個重組子，較低的轉(zhuǎn)化效率意味著與染色體之間的重組是非常少的?？截悢?shù)：YEps和YRps含有的拷貝數(shù)也最多，每個細胞中含有20-50和5-100個，而YIps一般只以單個拷貝10/7/202393歡迎同學們聽課！存在于細胞中。如果要從克隆的基因中獲得蛋白，這些特性就非常重要，因為拷貝數(shù)越多，蛋白質(zhì)的產(chǎn)量就越高。穩(wěn)定性：因為YIps能產(chǎn)生穩(wěn)定的重組子。另一方面YRp重組子是非常不穩(wěn)定的，母細胞中聚集大量的重組分子，但在子代中就可能丟失，YEp也有同樣的問題。

10/7/2023