冰凍切片及電鏡標(biāo)本的制備

冰凍切片的制備冰凍切片的制備一、 冰凍切片技術(shù)的概述（一） 優(yōu)點(diǎn)：?簡便，可以不需要對組織固定、脫水、透明、包埋等手續(xù)即可進(jìn)行切片，減少了一些中間環(huán)節(jié)。?快速，用時(shí)短。?組織變化不大。?能很好保存脂肪，類脂等成分。?能夠比較完好地保存各種抗原活性及酶類，特別是對于那些對有機(jī)溶劑或熱的溫度耐受能力較差的細(xì)胞膜表面抗原和水解酶保存較好。（二） 缺點(diǎn)：?不容易做連續(xù)切片。?切取的組織不能過大，組織過大不容易凍結(jié)或者組織凍結(jié)不均，影響切片及染色效果。?不容易制作較薄的切片。?組織塊在凍結(jié)過程中容易產(chǎn)生水的結(jié)晶而影響細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)及抗原物質(zhì)的定位，并且組織結(jié)構(gòu)也不如石蠟切片清晰。（三） 主要應(yīng)用于：?用于有些水解酶的定位的組織化學(xué)方法以及免疫組織化學(xué)方法等。?用于證明脂肪及類脂和神經(jīng)組織髓鞘的染色時(shí)的切片。3?用于臨床手術(shù)的快速病理診斷。二、 冰凍切片機(jī)的使用及注意事項(xiàng)（1）新鮮的組織制備組織盡可能新鮮、驟冷愈快愈好，才能避免冰晶，常用的驟冷劑有：① CO2氣（—78C） ②丙酮干冰冷卻的輕石油醚、 乙烷和庚烷（—80C）③液氮（—190C）④液氮冷卻的丙烷（—19C）。液氮適用于組織化學(xué)，較安全。缺點(diǎn)：組織塊易發(fā)生龜裂。 （2）固定組織的制備為防止水解酶和其他物質(zhì)的移位、彌散，常用 4C、24小時(shí)的甲醛固定能很好地保存酶類。 但對許多脫氫酶和轉(zhuǎn)移酶能滅活。故不宜使用，低溫，冷甲醛短時(shí)間固定（ 10分鐘左右）固定，可顯示琥珀酸脫氫酶。電鏡岀現(xiàn)后，需要保存細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)，以 4%緩沖戊二醛（25%戊二醛16ml;0.1M二甲胂酸（pH7?）84ml;蔗糖8g）固定較好。這些固定液主要用于水解酶，而不適于許多氧化還原酶和轉(zhuǎn)移酶。（3）恒冷箱溫度一般在冷凍后10分鐘，到接近冷室溫度時(shí)再切，一般組織在— 15?—20C切片最易成功。每種組織有其合適的切片溫度、刀的溫度和冷室溫度， Pearse及Bancroft的經(jīng)驗(yàn)如下：組織 刀溫度 組織溫度 恒冷箱溫度肝 -18 -10 -5腎-15-8-5皮膚-35-10-5腦-18-5-5固定組織一般高3-5度(4)抗卷板抗卷板的前緣與刀面須有足夠的距離， 使切片平滑通過?？咕戆迓愿哂诘睹娴淖罡唿c(diǎn)。 可憑經(jīng)驗(yàn)調(diào)整刀對組織的角度，一般新刀為 20°切片機(jī)操作程序：先接通電源，調(diào)定恒冷箱溫度，調(diào)整切片刀的角度，調(diào)定切片厚度，標(biāo)本置載臺(tái)致冷達(dá)所需溫度后，將其安放在切片機(jī)推進(jìn)器上。 即可切片。 恒冷箱視使用情況每周或每月清潔一次冰霜。切片刀新刀切片滿意，舊刀用自動(dòng)磨刀機(jī)磨刀較好。如果切片刀與抗卷板的位置，角度合乎要求，又有一把銳利的刀，就能獲得理想的切片。三、 冰凍干燥原理為冰凍組織保持高度真空，直到去除組織中的水分。過程小塊組織驟冷-立即在真空干燥脫水(- 30?-40C)冰升華，水氣去除，不會(huì)發(fā)生酶的彌散-材料干后，升到室溫浸于石蠟或碳蠟包埋。特點(diǎn)能岀色地保存組織的酶活性，還有助于保持組織的結(jié)構(gòu)。但儀器貴，需時(shí)長。四、 冰凍替代法原理低溫下用液體脫水劑取代組織中的水分。過程組織塊驟冷-組織內(nèi)的水，在低溫(— 40C?—70C)液體脫水劑中被替代(醇、丙酮)，同時(shí)起到固定作用-脫水組織漸恢復(fù)到室溫，用石蠟包埋。特點(diǎn)新鮮組織在24小時(shí)內(nèi)制成切片可保存較多的酶活性經(jīng)濟(jì)、簡單且有重復(fù)性，但對細(xì)胞器保存不佳，不能用于電鏡20世紀(jì)30年代(1935年)在德國發(fā)明并生產(chǎn)了第一批電子顯微鏡以來， 應(yīng)用日漸廣泛，使組織學(xué)的研究上了一個(gè)新的臺(tái)階，開避了新紀(jì)元，從一般顯微結(jié)構(gòu)領(lǐng)域邁入了亞顯微結(jié)構(gòu)水平。透射電鏡(transmissionelectronmicroscope，TEM):是最廣泛使用的一類電鏡。它的特點(diǎn)是電子束必須穿透樣品，因此觀察的樣品必須很薄，約為 50nm左右?？捎^察細(xì)胞和組織的超薄切片，復(fù)型膜，負(fù)染樣品等。掃描電鏡(scanningelectronmicroscope，SEM):主要特點(diǎn)是觀察物體表面的立體微細(xì)結(jié)構(gòu)。其在醫(yī)學(xué)上主要用于觀察組織或細(xì)胞的表面或斷面結(jié)構(gòu)， 掃描圖像具有立體感，樣品制備較簡單，因此在醫(yī)學(xué)上應(yīng)用日漸增多。二、標(biāo)本的制備取材.原則：快、準(zhǔn)、輕、小、冷； 1mm3?注意事項(xiàng)：防止組織擠壓和過度伸展；使用鋒利的刀，盡量減少對組織的機(jī)械性損傷；取材最好在冰塊上，或同時(shí)放在固定液內(nèi)操作；培養(yǎng)細(xì)胞的收集時(shí)，要將培養(yǎng)液離心后，取沉淀物漂洗固定。固定1?常用固定操作的方法戊二醛-鋨酸雙重固定法前固定：2%戊二醛后固定：1%鋨酸培養(yǎng)細(xì)胞固定法培養(yǎng)細(xì)胞需要固定時(shí)，先棄去培養(yǎng)液，加入戊二醛固定液，在冰溶或 4C的溫度下放置5~10分鐘，再用刮板將細(xì)胞刮下，倒入離心管中離心棄上清，沿管壁緩緩加入預(yù)冷的戊二醛固定液 15~30分鐘，再吸去上清，經(jīng)緩沖液清洗 15分鐘后，繼用1%鋨酸對樣品作后固定30分鐘。2.注意事項(xiàng)理想的固定劑應(yīng)能迅速而均勻地滲入組織細(xì)胞內(nèi)部，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)各種成分；能即刻將細(xì)胞殺死盡可能保持細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)， 減少死后變化；對細(xì)胞產(chǎn)生收縮及膨脹作用， 不產(chǎn)生人工假象及變形。固定液的酸堿度必須與被固定組織的酸堿度基本一致，大多數(shù)動(dòng)物組織酸堿度的平均值是7.4。緩沖液的選擇要根據(jù)實(shí)驗(yàn)不同要求加以選擇；磷酸鹽緩沖液可以有效地控制固定液的酸堿度，并能促進(jìn)樣與鉛鹽、鈾鹽之間的反應(yīng)，是動(dòng)物組織的有效緩沖系統(tǒng)， 但缺點(diǎn)是可抑制細(xì)胞內(nèi)某些酶(如6磷酸葡萄糖脫氫酶)的反應(yīng)。戊二醛固定后必須充分浸洗，才能轉(zhuǎn)入鋨酸固定。(5)戊二醛固定液一般用磷酸緩沖液或二甲砷酸鈉緩沖液配制，不能用醋酸 一巴比妥緩沖液,因此緩沖液可使戊二醛的醛基失效。脫水1.脫水過程脫水劑：乙醇或丙酮徹底清洗樣品50%乙醇或丙酮10~15分鐘70%乙醇或丙酮10~15分鐘80%乙醇或丙酮10~15分鐘90%乙醇或丙酮10~15分鐘100%乙醇或丙酮10~15分鐘100%乙醇或丙酮2?注意事項(xiàng)：30分鐘脫水要徹底；如果當(dāng)天完不成浸透、包埋操作時(shí)，應(yīng)將樣品停留在 4C70%乙醇或丙酮中過夜。(3)脫水操作動(dòng)作盡量要快，特別是 100%脫水劑，更要注意樣品塊不要在空氣中停留時(shí)間過長，否則會(huì)造成樣品干燥。浸透和包埋1?浸透包埋劑：Epon812環(huán)氧樹脂包埋劑TOC\o"1-5"\h\zA液：Epon812 10mlDDSA十二烷基琥珀酸酐16mlB液：Epon812 10mlMNA六甲酸酐 8.9mlA液和B液按比例混合，B液比例越大，包埋塊越硬(冬天1:4;夏天1:9)，待上述二液混勻后再按1.5?2%的體積比，在充分?jǐn)嚢柚械渭?DNP-30.過程脫水后的樣品入丙酮、環(huán)氧丙烷等量混合液 15min(2)環(huán)氧丙烷I15min(3)環(huán)氧丙烷H15min(4)環(huán)氧丙烷、包埋劑等量混合液數(shù)小時(shí)(5)純包埋劑數(shù)小時(shí).包埋(1)定向包埋烘干包埋板37oC?45oC恒溫箱中24小時(shí)60OC恒溫箱24小時(shí)72oC恒溫箱24小時(shí)?注意事項(xiàng)浸透、包埋用注射器、吸管、燒杯、膠囊、牙簽及其它器皿，均應(yīng)在用前烘干，有能有任何水分。所用的藥品均應(yīng)注意防潮，藥品應(yīng)在干燥器中存放或在冰箱里保存。包埋時(shí)動(dòng)作要輕巧，避免產(chǎn)生氣泡影響切片。操作時(shí)皮膚勿接觸包埋劑，以防引起皮炎。制好的包埋塊應(yīng)放于帶蓋的小瓶里，存放在干燥器中，以防止包埋塊吸潮變軟影響切片。半薄切片包埋塊的修整切片刀的制備：玻璃刀，鉆石刀定位超薄切片選擇與清洗載網(wǎng)制備支持膜切片撈片電子染色1?電子染色劑醋酸鈾：濃度為飽和液TOC\o"1-5"\h\z醋酸鈾 2g50?70%乙醇100mlPH4.2鉛鹽類硝酸鉛Pb(NO3)2 1.33g檸檬酸鈉Na(C6H5O7)2H2O 1.76g蒸餾水 30ml將