免疫組化常用方法

免疫組化常用方法二步法：EnVisionSystemEnVision顯色系統(tǒng)是將二抗和酶通過一個多聚葡聚糖骨架聯(lián)接成一個多聚體（即EnVision）直接放大信號40-50倍，把傳統(tǒng)的二抗、三抗分別孵育合為一次孵育。特點：敏感、省時、方便、背景低（避免了內(nèi)源性生物素干擾）。EnVision工作程序：1） 脫蠟、水化組織切片。2） 預(yù)處理組織切片（據(jù)一抗具體說明而定）3） 蒸餾水漂洗，置于TBS中。4） 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶（僅用于EnVisionTM/HRP）5） 蒸餾水漂洗，置于TBS，10分鐘6） 一抗孵育10-30分鐘7） TBS漂洗10分鐘8） EnVisionTM孵育10-30分鐘9） TBS漂洗10分鐘10） 色源底物溶液孵育10分鐘11） 蒸餾水漂洗12） 復(fù)染及封片免疫染色方法ThebasicprinciplesofICC?抗原抗體反應(yīng)-標(biāo)記化學(xué)反應(yīng)?呈色化學(xué)反應(yīng)要求待檢標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)和抗原性保存良好，抗原不從原位擴散或丟失Specimenpreparation取材新鮮，固定及時，形態(tài)保存完好，抗原物質(zhì)的抗原性不丟失、不擴散和被破壞FixationSampleTypeCryostat(frozen)sectionsParaffinSectionsAntigenRetrievalTechniquesIntention:Tofacilitatetheimmunologicalreactionofantibodieswithantigens(increasereactivityofthemajorityofantigens).AntibodyStainingPrimaryantibodymaybedirectlylabeledlabeledsecondaryantibodyormorecomplexdetectionsystem.secondaryantibodyagainsttheimmunoglobulinsoftheprimaryantibodysource減少或消除非特異性染色的方法?最常見原因蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上?最有效方法在用第一抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清(1:5-20)10-20min，加入2-5%牛血清白蛋白可進一步減少非特異性染色，用除制備第一抗體以外的其它動物血清(非免疫的)對照實驗主要是針對第一抗體對照，常用方法：?陽性對照：已知陽性?陰性對照：已知陰性空白對照BS代替特異性抗體替代對照:用同種屬正常血清代替特異性抗體吸收實驗:先用抗原吸收一抗抑制實驗:先用未標(biāo)記抗體,再用標(biāo)記抗體置換實驗:用無關(guān)的特異性抗體代替一抗AntibodyDetection?Thereareseveraldifferentmethodsthatcanbeemployedtodetectantibodiesboundtotissue,dependinguponwhetherthelabelusedisenzymaticorfluorescent.FluorescenceEnzyme-MediatedDetection親和組織化學(xué)(Affinityhistochemistry)FluorescenceDirectlyIndirectly直接法間接法補體法雙標(biāo)法使用熒光顯微鏡的注意事項?暗室?點燃汞燈5-15min,穩(wěn)定后再開始觀察?光源壽命有限，應(yīng)集中觀察，防止反復(fù)點燃，燈熄后應(yīng)充分冷卻才能再次點燃，一次觀察時間不能太長，以2-3h內(nèi)為宜?標(biāo)本染色后應(yīng)盡快觀察,存放在4C能延緩熒光衰減，標(biāo)本不能長時間暴露于紫外線熒光顯微鏡標(biāo)本制作要求載玻片:厚度均勻,0.8-1.2mm之間，光潔，無自發(fā)熒光蓋玻片:厚度0.17mm,光潔標(biāo)本:不能太厚封裱劑:無自發(fā)熒光，無色透明,pH8.5-9.5,常用甘油和0.5mol/LpH9.0-9.5碳酸鹽緩沖液等量混合鏡油:無熒光鏡油，或甘油或液體石蠟Enzyme-MediatedDetection直接法(Direct)間接法(Indirect)基本原理-以間接法法為例-一抗是對組織細(xì)胞內(nèi)某種抗原的特異性抗體(80-90%多抗由家兔制得，單抗由小鼠制備)-二抗為一抗(IgG)的抗體。-優(yōu)點：只要一抗來自同一種屬，同一標(biāo)記的二抗就能用來顯示不同的抗原，避免了直接法標(biāo)記每一種一抗，提高了敏感度。酶標(biāo)抗體法的特點-用于標(biāo)記的酶應(yīng)具備以下幾點：酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，易于光、電鏡觀察所形成的終產(chǎn)物必須穩(wěn)定，不能彌散較易獲得，價廉，最好已商品化組織中不應(yīng)存在內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)酶應(yīng)穩(wěn)定,標(biāo)記后保持酶和抗體的活性缺點酶與抗體共價結(jié)合損害部分抗體和酶的活性三步法(HRPlabelled)多層反應(yīng)法AlkalinePhosphatase-Anti-AlkalinePhosphatase(APAAP)Technique過氧化物酶抗過氧化物酶法(PeroxidaseAntiperoxidase,PAP法)-原理與酶橋法相似-制備PAP復(fù)合物：使抗HRP抗體與HRP形成可溶性復(fù)合物PAP復(fù)合物的特征-在抗原稍過量時,所有抗HRP抗體均參與形成可溶性PAP復(fù)合物-PAP復(fù)合物的形狀相當(dāng)穩(wěn)定，不受抗原量的影響-PAP復(fù)合物中HRP/抗HRP抗體的比例為3:2,即由3個HRP分子與2個抗HRP抗體組成，呈五角形結(jié)構(gòu)PAP法的評價?抗體活性高:非標(biāo)記抗體酶法最大限度地保存了抗體活性-靈敏度高：3個酶分子對應(yīng)1個抗原?不適合免疫電鏡AP復(fù)合物分子量大?背景染色低假陰性及其處理假陽性及其處理組織細(xì)胞內(nèi)色素：如神經(jīng)黑色素，可用AKP代替HRP假過氧化物酶活性：如RBC內(nèi)的血紅素輔基,用甲醇-0.3%H2O2預(yù)處理15-20min(室溫)內(nèi)源性過氧化物酶活性：如粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，用AKP代替HRP游離醛基：與蛋白質(zhì)(含IgG)非特異性結(jié)合，用白蛋白預(yù)孵育封閉之疏水鍵和離子鍵：Ig可通過疏水鍵和離子鍵與組織中的堿性蛋白或Fc受體非特異性結(jié)合，用正常血清(首選制備二抗的種屬)于一抗前孵育封閉之天然抗體及不純抗體：增加一抗稀釋度載體蛋白抗體：制備半抗原的抗體時，使用了載體蛋白，用固相吸收技術(shù)將載體蛋白抗體除去增加染色強度方法重復(fù)顯色重復(fù)一抗雙橋PAP法親和組織化學(xué)(Affinityhistochemistry)?新技術(shù)的出現(xiàn)----新進展?特點一些具有雙價或多價結(jié)合力的物質(zhì)如植物凝集素(Lectin)、生物素(Biotin)和葡萄球菌A蛋白(Staphylococcalprotein,SPA)等被應(yīng)用于ICC，其共同特點是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高親和力為基礎(chǔ)。它們既有別于古老的組織化學(xué)的分解、置換、氧化和還原，本質(zhì)上又非抗原抗體反應(yīng)。稱為親和組織化學(xué)(Affinityhistochemistry)。廣義的親和組織化學(xué)包括：抗原與抗體、植物凝集素與糖類、生物素與抗生物素、SPA與IgG、陽離子與陰離子、配體與受體等。Avidin-Biotininteractionsorothercommercially-availableamplifiers生物素-抗生物素基本原理Avidin卵白素，統(tǒng)稱為抗生物素或親和素abasicglycoprotein，MW68Kdbiotin生物素，smallwatersolublevitamin(vitaminH),MW24Kd,-Avidin(卵白素)具有4個同biotin(生物素)親和力極高(較抗原抗體高100萬倍)的結(jié)合點。能夠彼此牢固結(jié)合而不影響彼此的生物學(xué)活性。同時它們都具有與其它示蹤劑結(jié)合的能力?？股锼?生物素-過氧化酶復(fù)合物技術(shù)(AvidinBiotin-PeroxidaseComplextechnique,ABC技術(shù))ABC法的評價advantages敏感性強:親和力強特異性強:一抗和二抗工作濃度低時間縮短多重標(biāo)記注意事項內(nèi)源性生物素活性:如肝、腎、白細(xì)胞、脂肪組織和乳腺，預(yù)先用0.01%的抗生物素和0.01%生物素分別作用20min，每次作用后PBS5minX3次差異大，注意廠家、批號3.4C保存DisadvantagesofABCABC的IP約為10,中性pH時帶正電荷,容易與nucleus等帶負(fù)電荷結(jié)構(gòu)非特異結(jié)合.Avidin是glycoprotein,與lectins等分子通過碳水化合物連接?通過用streptavidin(抗生蛋白鏈霉素)代替avidin克服上述缺陷.Streptavidin:aprotein(MW60Kd)isolatedfromthebacteriumStreptomycesavidinii(鏈霉親生物素蛋白)，andlikeavidin,hasfourhighaffinitybindingsitesf