體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)

九、體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)InVitroMammalianCellsChromosomeAberrationTest1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變實(shí)驗(yàn)的大體原那么、要求和方式。本標(biāo)準(zhǔn)適用于檢測(cè)化妝品原料及其產(chǎn)品的致突變性。2標(biāo)準(zhǔn)性引用文件OECDGuidelinesforTestingofChemicals(,July1997)3實(shí)驗(yàn)?zāi)康谋緦?shí)驗(yàn)是用于檢測(cè)培育的哺乳動(dòng)物細(xì)胞染色體畸變，以評(píng)判受試物致突變的可能性。4概念染色體型畸變(Chromosome-typeaberration):染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為在兩個(gè)染色單體相同位點(diǎn)均顯現(xiàn)斷裂或斷裂重組的改變。染色單體型畸變(Chromatid-typeaberration):染色體結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為染色單體斷裂或染色單體斷裂重組的損傷。染色體數(shù)量改變(Numericalaberration):所用細(xì)胞株的正常染色體數(shù)量的轉(zhuǎn)變。結(jié)構(gòu)畸變(Structuralaberration):在細(xì)胞割裂的中期相時(shí)期，用顯微鏡檢出的染色體結(jié)構(gòu)改變，表現(xiàn)為缺失、斷片、互換等。有絲割裂指數(shù)(Mitoticindex):中期相細(xì)胞數(shù)與所觀看的細(xì)胞總數(shù)之比值；是一項(xiàng)反映細(xì)胞增殖程度的指標(biāo)。5實(shí)驗(yàn)大體原那么在加入和不加入代謝活化系統(tǒng)的條件下，使培育的哺乳動(dòng)物細(xì)胞暴露于受試物中。用中期割裂相阻斷劑(如秋水仙素或秋水仙胺)處置，使細(xì)胞停止在中期割裂相，隨后收成細(xì)胞，制片，染色，分析染色體畸變。6實(shí)驗(yàn)方式試劑和受試物制備陽性對(duì)照物：可依照受試物的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)選擇適宜的陽性對(duì)照物，陽性對(duì)照物應(yīng)是已知的斷裂劑，能引發(fā)可檢出的、并可重復(fù)的陽性結(jié)果。當(dāng)外源性活化系統(tǒng)不存在時(shí)，可利用甲磺酸甲酯(methylmethanesulphonate(MMS))、甲磺酸乙酯(ethylmethanesulphonate(EMS))、乙基亞硝基脲(ethylnitrosourea)、絲裂霉素C(mitomycinC)、4-硝基喹啉-N-氧化物(4-nitroquinoline-N-oxide)。當(dāng)外源性活化系統(tǒng)存在時(shí)，可利用苯并(a)芘[benzo(a)pyrene]、環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide)。陰性對(duì)照物：應(yīng)設(shè)陰性對(duì)照，即僅含和受試物組相同的溶劑，不含受試物，其它處置和受試物組完全相同。另外，如未能證明所選溶劑不具有致突變性，溶劑對(duì)照與本實(shí)驗(yàn)室空白對(duì)照背景資料有明顯不同，還應(yīng)設(shè)空白對(duì)照。受試物受試物的配制：固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中，用前稀釋至適合濃度；液體受試物能夠直接加入實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)和/或用前稀釋至適合濃度。受試物應(yīng)在利用前新鮮配制，不然就必需證明貯存不阻礙其穩(wěn)固性。溶劑的選擇：溶劑必需是非致突變物，不與受試物發(fā)生化學(xué)反映，不阻礙細(xì)胞存活和S9活性。首選溶劑是培育液（不含血清）或水。二甲基亞砜（DMSO）也是經(jīng)常使用溶劑，利歷時(shí)濃度不該大于％。受試物濃度設(shè)置（1） 最高濃度的選擇：決定最高濃度的因素是細(xì)胞毒性、受試物在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解度和pH或滲克分子濃度（osmolality）的改變。（2） 細(xì)胞毒性的確信：應(yīng)利用指示細(xì)胞完整性和生長(zhǎng)情形的指標(biāo)，在活化系統(tǒng)存在或不存在的兩種條件下確信細(xì)胞毒性，例如細(xì)胞覆蓋程度（degreeofconfluency）、存活細(xì)胞計(jì)數(shù)（viablecellcounts）或有絲割裂指數(shù)（mitoticindex）。應(yīng)在預(yù)實(shí)驗(yàn)中確信細(xì)胞毒性和溶解度。（3） 劑量設(shè)置：①至少應(yīng)設(shè)置3個(gè)可供分析的濃度。當(dāng)有細(xì)胞毒性時(shí)，其濃度范圍應(yīng)包括從最大毒性至幾乎無毒性；通常濃度距離系數(shù)不大于2~血。在收成細(xì)胞時(shí)，最高濃度應(yīng)能明顯降低細(xì)胞覆蓋程度、細(xì)胞計(jì)數(shù)或有絲割裂指數(shù)（均應(yīng)大于50%）。關(guān)于那些相對(duì)無細(xì)胞毒性的化合物，最高濃度應(yīng)是5ul/mL，5mg/mL或L。關(guān)于相對(duì)不溶解的物質(zhì)，當(dāng)濃度低于不溶解濃度時(shí)仍無毒性，那么最高劑量應(yīng)是，當(dāng)處置期終止時(shí)，在最終培育液中溶解度限值以上的一個(gè)濃度。在某些情形下（即僅當(dāng)高于最低不溶解濃度時(shí)才發(fā)生細(xì)胞毒性），應(yīng)利用一個(gè)以上可看見沉淀的濃度。最好在實(shí)驗(yàn)處置開始和終止時(shí)均評(píng)判溶解度，因?yàn)橛捎诩?xì)胞、S9等的存在，在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)內(nèi)在暴露進(jìn)程中溶解度可能轉(zhuǎn)變。不溶解性可用肉眼辨別，但沉淀不能阻礙觀看。培育液：采納MEM（Eagle），并加入非必需氨基酸和抗菌素（青、鏈霉素，按100IU/mL），胎牛血清或小牛血清按10%加入。也可選用其它適合的培育液?；罨到y(tǒng)通常利用的是S9混合物（S9mix）。、9是從經(jīng)酶誘導(dǎo)劑（Aroclor1254或苯巴比妥鈉和B-萘黃酮聯(lián)合利用）處置的嚙齒動(dòng)物肝臟取得的oS9的制備同Ames實(shí)驗(yàn)。S9的利用濃度為1%~10%（終濃度）。S9mix中所加輔助因子的量由各實(shí)驗(yàn)室自行決定，但需對(duì)S9mix的活性進(jìn)行鑒定，必需能明顯活化陽性對(duì)照物。也可利用下述S9MgC12（mol/L） mlKC1（L） ml葡萄糖-6-磷酸輔酶11（氧化型，NADP）用無血清MEM培育液補(bǔ)足至1mL.實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞：利用中國地鼠卵巢（CHO）細(xì)胞株或中國地鼠肺（CHL）細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照物，陰性對(duì)照物和至少3個(gè)可供分析的受試物濃度組。實(shí)驗(yàn)前一天，將必然數(shù)量的細(xì)胞接種于培育皿（瓶）中，放CO2培育箱內(nèi)培育。實(shí)驗(yàn)需在加入和不加入S9mix的條件下進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)時(shí)，吸去培育皿（瓶）中的培育液，加入必然濃度的受試物、S9mix（不加S9mix時(shí)，需用培育液補(bǔ)足）和必然量不含血清的培育液，放培育箱中處置2h~6h。終止后，吸去含受試物的培育液，用Hanks液洗細(xì)胞3次，加入含10%胎牛血清的培育液，放回培育箱，于24h內(nèi)收成細(xì)胞。于收成前2h~4h，加入細(xì)胞割裂中期阻斷劑（如用秋水仙素，作歷時(shí)刻為4h，終濃度為1^g/mL）。當(dāng)受試物為原料時(shí)，若是在上述加入和不加入S9mix的條件下均取得陰性結(jié)果，那么尚需補(bǔ)加另外的實(shí)驗(yàn)，即在不加S9mix的條件下，使受試物與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的接觸時(shí)刻延長(zhǎng)至24h。當(dāng)難以得出明確結(jié)論時(shí)，應(yīng)改換實(shí)驗(yàn)條件，如改變代謝活化條件、受試物與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)接觸時(shí)刻等重復(fù)實(shí)驗(yàn)。收成細(xì)胞時(shí)，用%胰蛋白酶溶液消化細(xì)胞，待細(xì)胞脫掉隊(duì)，加入含10%胎?；蛐∨Ｑ宓呐嘤航K止胰蛋白酶的作用，混勻，放入離心管以1000r/min~1200r/min的速度離心5min~7min，棄去上清液，加入LKC1溶液低滲處置，繼而以新配制的甲醇和冰醋酸液（容積比為3:1）進(jìn)行固定。按常規(guī)制片，用姬姆薩染液染色。作染色體分析時(shí)，對(duì)每一處置組選200個(gè)（陽性對(duì)照可選100個(gè)）分散良好的中期割裂相（染色體數(shù)為2n±2）進(jìn)行染色體畸變分析。在分析時(shí)應(yīng)記錄每一觀看細(xì)胞的染色體數(shù)量，關(guān)于畸變細(xì)胞還應(yīng)記錄顯微鏡視野的坐標(biāo)位置及畸變類型。統(tǒng)計(jì)處置：對(duì)染色體畸變細(xì)胞率用X2查驗(yàn)，以評(píng)判受試物的致突變性。結(jié)果評(píng)判：在以下兩種情形下可判定受試物在本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中具有致突變性：（1） 受試物引發(fā)染色體結(jié)構(gòu)畸變數(shù)的增加具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有與劑量相關(guān)的增加。（2） 受試物在任何一個(gè)劑量條件下，引發(fā)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并有可重復(fù)性的陽性反映。在評(píng)判時(shí)應(yīng)把生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義結(jié)合考慮。7實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括以下內(nèi)容：（1）受試物名稱、有關(guān)的理化性狀、所用溶劑及其配制、劑量選擇（應(yīng)說明受試物對(duì)細(xì)胞毒性的測(cè)定方式、溶解情形等）（2） 細(xì)胞株名稱；（3） 實(shí)驗(yàn)條件和方式代謝活化系統(tǒng)：制備禹時(shí)所用酶的誘導(dǎo)劑、選用的動(dòng)物品種和來源、S9mix的配方；對(duì)照物：陽性對(duì)照物名稱和選用濃度；陰性（溶劑）對(duì)照物名稱及利用濃度。培育液：所用培育液名稱、血清類別和利用濃度；接種時(shí)的細(xì)胞密度和所用培育皿（瓶）的規(guī)格；中期割裂阻斷劑：名稱、所用濃度、作歷時(shí)刻；處置時(shí)刻：受試物與實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的接觸時(shí)刻；簡(jiǎn)述制片方式、分析的中期割裂相數(shù)量、結(jié)果評(píng)判方式。（4） 結(jié)果受試物最高劑量的確信及實(shí)驗(yàn)結(jié)果：細(xì)胞毒性的測(cè)定（建議的表格見表1）；溶解情形（建議的表格見表2）；對(duì)pH和滲克分子（osmolality）濃度的阻礙（若是有阻礙）。遍地理組和對(duì)照組染色體畸變率（建議的表格見表3）。本實(shí)驗(yàn)室的陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組（經(jīng)常使用溶劑，如DMSO）在本實(shí)驗(yàn)室歷史上的染色體畸變率范圍、均值和標(biāo)準(zhǔn)差（說明樣品數(shù)）。（5） 結(jié)論。表1受試物對(duì)細(xì)胞的毒性受試物濃度Ug/mL活細(xì)胞計(jì)數(shù)法分裂指數(shù)法細(xì)胞覆蓋程度接種細(xì)胞數(shù)/mL活細(xì)胞數(shù)/mL存活率%計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)中期分裂相數(shù)分裂指數(shù)表2受試