中醫(yī)脾胃虛證代謝綜合征患者血漿代謝圖譜研究

中醫(yī)脾胃虛證代謝綜合征患者血漿代謝圖譜研究

脾臟是“先天之本，氣血之源”，在內(nèi)臟象圖論中發(fā)揮著重要作用。脾氣虛是中醫(yī)臨床較為常見的一種證型,是由于脾氣不足,運化失職所表現(xiàn)的虛弱證候,是許多疾病的病因病機(jī)。運用代謝組學(xué)進(jìn)行分析有助于全面地理解機(jī)體內(nèi)物質(zhì)的代謝途徑,闡明“脾氣虛證”的科學(xué)內(nèi)涵,并有助于生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn),達(dá)到輔助臨床診斷的目的。故本研究觀察脾氣虛證患者血漿的代謝物圖譜來進(jìn)一步揭示脾氣虛證的本質(zhì)。一、材料表面1.代謝綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)研究對象來自大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院的臨床體檢者,年齡在40~60歲之間,男女不限。通過2005年國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)頒布的代謝綜合征診斷標(biāo)準(zhǔn)及2002年的中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則中脾氣虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的對象分為正常對照組(Cont)37例、代謝綜合征組(MS)55例和脾氣虛代謝綜合征組(PiMS)32例。2.血樣的制備取血后,ED-TA抗凝,離心后收集血漿置于1.5mLEppendorf管中,放入-20℃冰箱保存,1w后轉(zhuǎn)至-80℃冰箱保存。血漿處理前,先在室溫下解凍,震蕩1min。取血樣100μL,加入乙腈400μL(含內(nèi)標(biāo):亮氨酸-腦啡肽,2ng·μL-1;C12:0.3ng·μL-1),震蕩2min,離心10min(10000g·min-1)。取上清液,凍干。加入水/乙腈(1∶4)150μL,震蕩2min。離心10min(10000g·min-1),取上清液進(jìn)行分析。3.極桿-飛行時間質(zhì)譜儀Acquity超高效液相色譜儀購自美國Waters公司,Micromassoa-Q-Tof串聯(lián)四極桿-飛行時間質(zhì)譜儀購自美國Waters公司。乙腈(HPLC級)購自Merck公司,甲酸(HPLC/SPECTRO級)購自Tedia公司,亮氨酸-腦啡肽購自Sigma-Aldrich公司,蒸餾水通過Milli-Q系統(tǒng)(Millipore,MA)過濾制備。二、方法1.色譜柱及色譜圖2色譜分離在ACQUITY超高效液相色譜(ACQUITYUPLC,Waters,Milford,USA)上進(jìn)行。色譜柱為ACQUITYC8柱(1.7μm,2.1mm×100mm)。色譜柱溫保持在35℃。梯度洗脫程序共30min,流速為0.35mL·min-1。流動相組成:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈。進(jìn)樣體積為3μL。質(zhì)譜分析在Waters四極桿-飛行時間質(zhì)譜上進(jìn)行,采用ESI正離子模式檢測。亮氨酸腦啡肽用作正到1000m/z。霧化氣流量為500L·h-1,溫度為300℃,錐孔氣流量為50L·h-1,離子源溫度為120℃;毛細(xì)管電壓和錐孔電壓分別為3100V和30V。MCP檢測器電壓為2500V。Q-TOFmicro質(zhì)譜采集速率為0.4s、掃描間隔為0.1s。2.數(shù)字化分析峰表譜圖利用MicromassMarkerLynxApplicationsManager(version4.0,WatersLtd,USA)提取峰表,進(jìn)行數(shù)字化分析;峰面積經(jīng)內(nèi)標(biāo)校正后導(dǎo)入到SIMCA-P11(U-metricsAB,Umea,Sweden)軟件中進(jìn)行多變量統(tǒng)計分析。采用偏最小二乘法辨別分析(PLS-DA)對正常對照組、代謝綜合征組和脾氣虛代謝綜合征組進(jìn)行模式識別。三、結(jié)果1.各組血漿代謝產(chǎn)物的識別經(jīng)OSC濾噪后可以將3組樣本得到良好的區(qū)分,由圖1可見積分值主要集中分布于橢圓形散點圖(95%置信區(qū)內(nèi))的區(qū)域。2.方法一:a方法擬合從得分散點圖2上可以看出:OSC-PLS-DA方法可以將兩組樣本較好的分開,經(jīng)驗證后,未過擬合。積分值主要集中分布于橢圓形散點圖(95%置信區(qū)內(nèi))的區(qū)域,各組之間無明顯交叉和重疊。3.生物標(biāo)志物的確定在OSC濾噪的PLS-DA模型中VIP值>1的變量被看作是可能的潛在標(biāo)記物,通過S-plot圖對它們的可靠性進(jìn)行驗證,將和分類相關(guān)性低的變量剔除,剩余的變量再進(jìn)行t檢驗,P<0.05的變量視為潛在的標(biāo)志物。經(jīng)過多種多變量分析手段的結(jié)合,最終確定生物標(biāo)志物。(1)代謝綜合征的潛在標(biāo)志物。經(jīng)t檢驗后P<0.05的化合物進(jìn)行二級質(zhì)譜定性,發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比,有3種化合物的峰高是明顯升高的,可以認(rèn)為lysoPCC16∶0,GPCho(32∶2),GPCho(32∶1)可能為代謝綜合征的潛在標(biāo)志物,見表1。(2)脾氣虛證代謝綜合征的潛在標(biāo)志物。經(jīng)二級質(zhì)譜定性后發(fā)現(xiàn)與代謝綜合征組相比,有3種化合物的峰高是明顯降低的,可以認(rèn)為carnitine,GPCho(38∶6)和分子量為341.282的未知化合物可能為脾氣虛代謝綜合征組的潛在標(biāo)志物,見表2。四、保鮮代謝綜合征組中醫(yī)所說的“脾”是一個結(jié)構(gòu)和功能的綜合性概念?！捌闅庋础?、“內(nèi)傷脾胃,百病由生”等說明脾在人體生理、病理上具有十分重要的地位。脾氣虛證本質(zhì)的研究是中西醫(yī)結(jié)合證本質(zhì)研究的重要內(nèi)容。近20多年來,學(xué)者們運用現(xiàn)代科學(xué)方法來研究脾氣虛證本質(zhì),目前認(rèn)為脾氣虛證主要表現(xiàn)為唾液淀粉酶活性比值降低,D-木糖排泄率下降,胃腸運動功能紊亂,胃腸道激素異常等。此外,還發(fā)現(xiàn)血清淀粉酶及胰淀粉酶活性降低,機(jī)體免疫功能低下等[4~5]。這些研究部分揭示了脾的本質(zhì),也推動了脾本質(zhì)研究的進(jìn)一步深入。代謝組(Metabonomics)是應(yīng)用現(xiàn)代分析方法對某一生物或細(xì)胞在特定生理時期內(nèi)所有相對分子質(zhì)量低的代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析,是從代謝網(wǎng)絡(luò)終端表象的整體角度來反映生物體的功能水平,與中醫(yī)“整體觀念”的思想吻合。有研究表明,脾氣虛證患者的唾液代謝成分與正常人是有差異的[8~9],但對脾氣虛證患者血漿方面的研究目前還未見報道。本研究的結(jié)果顯示代謝綜合征組中l(wèi)ysoPCC16∶0、GPCho(32∶2)、GPCho(32∶1)濃度是明顯升高的,可能為代謝綜合征的潛在標(biāo)志物。lysoPCC16∶0是溶血磷脂酰膽堿(俗稱卵磷脂),它屬于磷脂的一類,能保護(hù)細(xì)胞氧化并提供營養(yǎng)補(bǔ)充,增加脂肪燃燒,預(yù)防心血管疾病。但卵磷脂在脂肪生成方面的作用尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)卵磷脂能促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化和分化特異基因的表達(dá),并增加甘油三酯類和游離脂肪酸的水平。GPCho(32∶2)、GPCho(32∶1)是甘油磷酸膽堿,是膜磷脂代謝物,也屬于磷脂的范疇。GPCho能誘導(dǎo)人外周單核細(xì)胞炎性細(xì)胞因子的增加,從而損傷腸粘膜壁的功能,增加腸的通透性。脂代謝紊亂的病因病機(jī)主要是飲食不節(jié),過食肥甘厚膩,脾胃受損,加之惰怠少動,令中焦氣機(jī)壅滯,脾胃升降失常,運化失司,終致發(fā)病。脾虛為本,痰瘀為標(biāo),久病入絡(luò),變證從絡(luò),所以在疾病早期就要預(yù)防代謝綜合征的發(fā)生,改善胰島素抵抗、糾正糖脂代謝紊亂,最終減少心腦血管事件的發(fā)生率。脾氣虛代謝綜合征組GPCho(38∶6)、carnitineC8∶0和分子量為341.282的未知化合物濃度是明顯降低的,可能為脾氣虛證代謝綜合征的潛在標(biāo)志物。GPCho(38∶6)是甘油磷酸膽堿,屬于磷脂的范疇。carnitine