貴州和海南艾納香藥材質(zhì)量比較研究

貴州和海南艾納香藥材質(zhì)量比較研究

愛納香[l.c.]是艾納香科的一種多年生木蘭或亞灌木，也被稱為愛蘭姆風艾和愛蘭姆亞麻布。主要藥物為全草或土壤材料，產(chǎn)于貴州、廣東、海南等地。艾納香主要的藥效成分包括揮發(fā)油和黃酮類等,是影響艾納香質(zhì)量優(yōu)劣的主要因素。揮發(fā)油主要成分為左旋龍腦,具有抗菌、消炎、消腫、止痛等作用,黃酮類成分包括艾納香素、二氫黃酮醇等,具有抗感染、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用。不同產(chǎn)地藥材質(zhì)量間存在差異,其化學成分種類和質(zhì)量分數(shù)不盡相同。中藥材的功效講究來源的道地性,即中藥材必須在一定的地理環(huán)境下才能優(yōu)質(zhì)生長、保證療效,因此探討不同產(chǎn)地的中藥材質(zhì)量差異對于指導臨床用藥具有重要現(xiàn)實意義。就艾納香而言,目前研究主要集中于揮發(fā)油類和黃酮類化學成分的分析、藥理作用及艾納香油指紋圖譜建立等方面。有關不同產(chǎn)地艾納香化學成分差異分析的報道較少,未見涉及海南和貴州產(chǎn)區(qū)艾納香化學成分比較研究的報道。本研究在建立左旋龍腦和總黃酮測定方法的基礎上,分析貴州和海南2個主產(chǎn)區(qū)及不同居群間(居群指同一時間里同一區(qū)域內(nèi)同一物種的集合,本文主要指在同一個縣所采集的樣品)艾納香中左旋龍腦、總黃酮質(zhì)量分數(shù)差異,進一步比較2個產(chǎn)區(qū)的藥材質(zhì)量,為艾納香藥材種植、提取加工及相關生產(chǎn)實踐提供依據(jù)。1儀器、試劑和儀器7890A氣相色譜儀(美國安捷倫科技公司,包括FID氫火焰離子化檢測器、G4513A16位自動進樣器),SartariusCPA225D電子分析天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司],KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司),UNICO2012-PCS紫外-可見分光光度計[尤尼柯(上海)儀器有限公司]。左旋龍腦對照品(阿法埃莎化學有限公司,批號:10147015,質(zhì)量分數(shù)>98%),蘆丁對照品(中國藥品生物制品檢定所,批號:100080-200707,質(zhì)量分數(shù)為92.5%),水楊酸甲酯(分析純,天津光復精細化工研究所,質(zhì)量分數(shù)>99.5%),其余試劑均為國產(chǎn)分析純,H2O為蒸餾水。試驗材料均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所龐玉新副研究員鑒定為菊科艾納香屬植物艾納香[Blumeabalsamifera(L.)DC.]的功能葉片。詳見表1。2方法和結果2.1gc法測定易納香中左岸龍腦的質(zhì)量比2.1.1fid檢測條件HP-5石英毛細管色譜柱(0.32mm×30m,0.25μm);以80℃為起始溫度,保持2min;以5℃/min升溫至100℃,再以20℃/min升溫至200℃;進樣口溫度為220℃;FID檢測器,檢測器溫度為240℃;進樣量為0.6μL,分流比為9∶1。按上述條件測定,水楊酸甲酯+左旋龍腦對照品、艾納香供試品溶液的氣相色譜圖見圖1。2.1.2左旋龍腦對照品溶液精密稱取左旋龍腦對照品100.00mg,置100mL容量瓶中,加乙酸乙酯定容,搖勻,即得質(zhì)量濃度為1.0317mg/mL的左旋龍腦對照品溶液。2.1.3內(nèi)標溶液的配制精密稱取水楊酸甲酯250.00mg,置250mL容量瓶中,加乙酸乙酯定容,搖勻,即得質(zhì)量濃度為1.0144mg/mL的內(nèi)標溶液。2.1.4超聲提取工藝取艾納香葉片粉末(過20目篩)2g,精密稱定,置于50mL具塞三角瓶中,加入乙酸乙酯25mL,稱定質(zhì)量,在頻率40kHz、功率400W的條件下超聲提取30min。放冷,稱定質(zhì)量,用乙酸乙酯補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,取1mL續(xù)濾液至10mL容量瓶中,加入內(nèi)標溶液1mL,用乙酸乙酯定容,搖勻,即得。2.1.5對照品溶液的制備精密稱取“2.1.2”項下對照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0mL,置于10mL容量瓶中,精密加入“2.1.3”項下內(nèi)標溶液1.0mL,再加入乙酸乙酯定容至刻度,搖勻,即得混合對照品溶液。精密吸取0.6μL,按照“2.1.1”項下色譜條件測定。以左旋龍腦質(zhì)量濃度為橫坐標(X),對照品左旋龍腦與內(nèi)標物水楊酸甲酯的峰面積比為縱坐標(Y)繪制標準曲線,得到線性回歸方程:Y=14.823X+0.0129,r=0.9999,線性范圍為10.371~207.428μg/mL。2.1.6取貴州興義市采集的艾納香藥材,約2g,精密稱定,按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件連續(xù)測定6次,記錄色譜圖。計算得左旋龍腦與水楊酸甲酯峰面積比的RSD值為2.1%,表明本方法精密度良好。2.1.7供試品溶液制備分別取貴州興義市采集的艾納香藥材5份,每份約2g,精密稱定,按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件進行測定。結果測得左旋龍腦質(zhì)量分數(shù)的RSD值為3%,表明方法重復性良好。2.1.8測定項目的測定取貴州興義市采集的艾納香藥材1份,約2g,精密稱定,按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,于室溫下放置,分別于0、2、4、8、12、24h依法測定。結果左旋龍腦與內(nèi)標物的相對峰面積比的RSD為0.49%,表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。2.1.9精密稱定量取已知質(zhì)量分數(shù)的艾納香葉片粉末(過20目篩)1g,精密稱定,共6份。分別加入左旋龍腦對照品約5mg,按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件測定并計算加樣回收率,結果見表2。2.1.1含量測定結果取表1中各艾納香藥材,各2g,精密稱定,按照“2.1.4”項下方法制備供試品溶液,按“2.1.1”項下色譜條件測定,根據(jù)線性回歸方程計算各產(chǎn)地艾納香中左旋龍腦的質(zhì)量分數(shù)。結果見表3。從表3可知,海南白沙的艾納香中左旋龍腦質(zhì)量分數(shù)最高,為6.99mg/g;貴州望謨的質(zhì)量分數(shù)最低,為3.86mg/g,不同居群間左旋龍腦質(zhì)量分數(shù)差異無統(tǒng)計學意義,貴州與海南2個產(chǎn)區(qū)間差異亦無統(tǒng)計學意義。2.2用紫外分光光度法測定了艾納香中總黃酮的質(zhì)量比2.2.1alno3溶液配制稱取NaNO225g,用H2O定容至500mL,配成5%(質(zhì)量濃度,下同)的NaNO2溶液,備用;稱取Al(NO3)3·9H2O88g,用H2O定容至500mL,配成10%(質(zhì)量濃度,下同)的Al(NO3)3溶液,備用;稱取NaOH20g,用H2O定容至500mL,配成4%(質(zhì)量濃度,下同)的NaOH溶液,備用。2.2.2對照品溶液的制備精密稱取于105℃干燥至恒重的蘆丁對照品12.00mg,置于50mL容量瓶中,加適量75%(體積分數(shù),下同)乙醇,置水浴鍋上微熱溶解,放冷,加75%乙醇定容,搖勻,即得質(zhì)量濃度為0.2359mg/mL的蘆丁對照品溶液。2.2.3超聲提取工藝稱取艾納香藥材粉末(過20目)0.5g,至具塞錐形瓶中,加75%乙醇溶液25mL,稱定質(zhì)量,在頻率40kHz、功率400W下超聲提取40min,放冷。稱定質(zhì)量,用75%乙醇補足減失的質(zhì)量,搖勻,濾過,即得。2.2.4加nano2溶液、alno33溶液分別精密量取對照品溶液2.00mL、供試品溶液0.50mL,分別置于25mL容量瓶中,各加75%乙醇至10mL。分別加5%NaNO2溶液1mL,搖勻,放置5min;再分別加10%Al(NO3)3溶液1mL,搖勻,放置5min;加4%NaOH溶液10mL,最后加入75%乙醇至刻度,搖勻,放置15min。以相應的試劑溶液為空白,在300~999nm波長間進行全波長掃描,選擇最適測試波長為509nm。吸收曲線如圖2所示。2.2.5l容量瓶吸光度測定精密量取蘆丁對照品溶液1.00、2.00、4.00、6.00、8.00mL,分別置于25mL容量瓶中,按“2.2.4”項下方法進行顯色反應,以相應的試劑溶液為空白對照,在509nm處測定吸光度A。以對照品質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標,吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線,得到線性回歸方程為A=12.847ρ+0.0093,r=1,線性范圍為9.176~73.408μg/mL。2.2.6方法精密度試驗取質(zhì)量濃度為0.2359mg/mL的對照品溶液2mL,置于25mL容量瓶中,按“2.2.4”項下方法測定吸收值,連續(xù)測定6次,吸光度值的RSD值為1.05%,表明方法精密度良好。2.2.7測定項目及程序取同一供試品溶液,置于25mL容量瓶中,按“2.2.4”項下方法操作,每隔10min測定其吸光度,共計60min。結果溶液在顯色后40min內(nèi)吸光度值的RSD值為1.89%,表明供試品溶液在40min內(nèi)較穩(wěn)定。2.2.8總黃酮質(zhì)量分數(shù)測定分別取同一批艾納香藥材6份,每份0.5g,精密稱定,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,取供試品溶液0.5mL,按“2.2.4”項下方法測定并計算總黃酮質(zhì)量分數(shù)。結果測得總黃酮質(zhì)量分數(shù)的RSD值為3.8%,表明方法重復性良好。2.2.9精密稱定,u3000結取已知質(zhì)量分數(shù)的艾納香葉片粉末(過20目篩)0.25g,精密稱定,共6份。分別加入蘆丁對照品約30mg,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,取供試品溶液0.5mL,按“2.2.4”項下方法測定并計算加樣回收率,結果見表4。2.2.1e-la-c、c取表1中各艾納香藥材適量,按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液,按“2.2.4”項下方法測定各供試品溶液的吸光度,計算各產(chǎn)地艾納香中總黃酮的質(zhì)量分數(shù)。結果見表5。從表5可知,海南儋州的總黃酮質(zhì)量分數(shù)遠超過其他居群,為127.29mg/g,是質(zhì)量分數(shù)最低的貴州望謨產(chǎn)艾納香(11.48mg/g)的11.09倍,貴州羅甸產(chǎn)艾納香質(zhì)量分數(shù)為52.64mg/g,位列第2位,不同居群間質(zhì)量分數(shù)差異具有統(tǒng)計學意義,但海南、貴州2個產(chǎn)區(qū)間質(zhì)量分數(shù)差異不具統(tǒng)計學意義。3不同產(chǎn)地艾納香揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)的統(tǒng)計分析夏稷子等研究表明,選擇水楊酸甲酯作為內(nèi)標物,不僅保留時間與左旋龍腦接近,分離度也很好,因此本研究選擇了水楊酸甲酯作為內(nèi)標物。本研究對貴州和海南2大產(chǎn)區(qū)的艾納香中左旋龍腦和總黃酮的質(zhì)量分數(shù)進行比較。結果表明,海南白沙樣品中左旋龍腦質(zhì)量分數(shù)最高,海南瓊中產(chǎn)位居第2,但方差分析顯示,各居群間左旋龍腦質(zhì)量分數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。海南儋州樣品總黃酮質(zhì)量分數(shù)最高,為最低的貴州望謨產(chǎn)樣品的11.09倍,各居群間總黃酮質(zhì)量分數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),但海南和貴州2個產(chǎn)區(qū)間差異無統(tǒng)計學意義。羅夫來等研究表明,不同居群貴州產(chǎn)艾納香的揮發(fā)油質(zhì)量分數(shù)差異有統(tǒng)計學意義,但黃酮質(zhì)量分數(shù)差異無統(tǒng)計學意義。夏稷子等研究表明,不同產(chǎn)地間的艾納香揮發(fā)性成分種類上差異不大,但成分比例和質(zhì)量分數(shù)差異較大。由于艾納香中揮發(fā)性成分受種質(zhì)、生長環(huán)境、生長發(fā)育階段等因素影響較大,上述結果的差異