氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定魚(yú)腥草揮發(fā)油中4種成分的含量

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定魚(yú)腥草揮發(fā)油中4種成分的含量

魚(yú)糞草是三白草科植物。別名:則耳根、豬鼻孔、魚(yú)鱗草、九蓮草等。具有清熱解毒、消癰排膿、利尿等功效,有抗病毒、抗菌的作用。廣泛分布于南方各省,主產(chǎn)于四川省、重慶市、貴州省、云南省等地區(qū)[2~4]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,有學(xué)者采用GC法測(cè)定魚(yú)腥草揮發(fā)油中甲基正壬酮的含量,另有學(xué)者采用GC/MS法分析魚(yú)腥草揮發(fā)油中的成分,若僅以甲基正壬酮的含量作為魚(yú)腥草質(zhì)量評(píng)價(jià)的單一指標(biāo),卻難以反映魚(yú)腥草藥材質(zhì)量。本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法(GasChromatography-massSpectrometry,GC-MS),同時(shí)選擇內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定鮮品魚(yú)腥草揮發(fā)性中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮4種成分,該方法快速簡(jiǎn)便、靈敏準(zhǔn)確,為有效控制和評(píng)價(jià)魚(yú)腥草質(zhì)量提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。1實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備1.1白草科植物菜材料采自什邡市回瀾鎮(zhèn)四川美大康中藥材種植有限責(zé)任公司魚(yú)腥草基地,經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李敏教授鑒定為三白草科植物蕺菜Houttuyniacordatathumb.的新鮮地上部分。1.2儀器和試劑盒1.2.1儀器7890A/5975C安捷倫氣質(zhì)聯(lián)用儀,安捷倫GC/MSD系統(tǒng)。1.2.2藥品對(duì)照品甲基正壬酮對(duì)照品(批號(hào):118034-200502)、乙酸龍腦酯對(duì)照品(批號(hào):110759-200604)、α-松油醇對(duì)照品(批號(hào):111859-201001)均購(gòu)置于中國(guó)藥品生物制品檢定所;4-萜品醇對(duì)照品(江蘇金壇市威德龍化學(xué)有限公司,純度98.0%);正十一碳烯(東京化成工業(yè)株式會(huì)社,純度>98.0%);正己烷為色譜純;無(wú)水硫酸鈉等其他試劑為分析純。2方法和結(jié)果2.1氣相色譜質(zhì)量分析系統(tǒng)的適用性2.1.1序條件毛細(xì)管柱為HP-5彈性石英毛細(xì)管柱(30m×0.25m×250μm)。升溫程序條件:70℃(持續(xù)5min),5℃/min,140℃(持續(xù)5min),10℃/min,250℃(持續(xù)10min)。進(jìn)樣口溫度為230℃,載氣為高純He,流速為1.0mL·min-1;分流比為10∶1;進(jìn)樣量為1μL。2.1.2質(zhì)量分析條件EI為70EV,四極桿溫度為150℃,離子源溫度為230℃。2.2溶液的制備2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制精密稱取內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(正十一碳烯)0.20426g,置100mL容量瓶中,加溶劑(正己烷)稀釋至刻度,配成2.0426mg·mL-1的溶液。2.2.2對(duì)照品貯備液的配制分別取4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮適量,精密稱定,加正己烷分別配成1.082、3.6574、6.064、2.0305mg·mL-1的貯備液,分別精密移取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液3、0.15、1、5mL置10mL量瓶中,加正己烷稀釋至刻度,搖勻,即得混合對(duì)照品貯備液,低溫保存。2.2.3正己烷改性na2so4稱取鮮品魚(yú)腥草50g,剪碎,置500mL圓底燒瓶中。自揮發(fā)油測(cè)定器上端加蒸餾水150mL,再加正己烷1mL,連接回流冷凝管,加熱至沸,保持微沸4h,停止加熱,冷卻至室溫,取正己烷層,加無(wú)水Na2SO4約0.4g,振搖,除去水分,取上層溶液至10mL量瓶,并用適量正己烷洗滌無(wú)水Na2SO4,洗液并入同一量瓶中,精密加入0.5mL內(nèi)標(biāo)溶液,加正己烷定容至刻度,搖勻,即得。2.3方法學(xué)的檢驗(yàn)2.3.1專屬性試驗(yàn)結(jié)果按照2.1項(xiàng)下的色譜條件,分別測(cè)定空白溶劑、混合對(duì)照品與供試品溶液,結(jié)果顯示對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)及目標(biāo)成分分離較好,無(wú)雜質(zhì)影響,且其它成分也對(duì)測(cè)定無(wú)影響,表明該方法專屬性良好(見(jiàn)圖1)。2.3.2線性回歸的測(cè)定分別精密量取混合對(duì)照品貯備液0.10、0.15、0.375、0.75、1.00、1.50、2.00mL,置5mL容量瓶中,精密加入0.25mL內(nèi)標(biāo)溶液,以正己烷定容至刻度。分別按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。再以A對(duì)照品/A內(nèi)標(biāo)為Y軸,以C對(duì)照品為X軸,進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮分別在6.492~129.84μg·mL-1,1.097~21.944μg·mL-1,12.128~242.56μg·mL-1,84.76~169.52μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(見(jiàn)表1)。2.3.3儀器精密度試驗(yàn)精密吸取供試品溶液1μL,按照2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,連續(xù)進(jìn)樣6次,結(jié)果測(cè)得4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮4種揮發(fā)性成分的峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值(Ai/As)的RSD分別為0.58%、2.14%、1.52%、1.47%,表明儀器精密度良好。2.3.4重復(fù)性試驗(yàn)精密稱取同一批號(hào)樣品50g,稱取6份,按照2.2.3項(xiàng)下供試品溶液配制方法制備,2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,結(jié)果測(cè)得4-萜品醇,α-松油醇,乙酸龍腦酯,甲基正壬酮4種揮發(fā)性成分的RSD分別為2.4%、1.5%、1.9%、2.3%,表明該方法重復(fù)性好。2.3.5揮發(fā)性成分檢測(cè)取同一供試品溶液,室溫下放置0、2、4、8、12、24h,按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,結(jié)果測(cè)得4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮4種揮發(fā)性成分與內(nèi)標(biāo)峰面積比的RSD分別為0.58%、2.14%、1.52%、1.47%,表明在24h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定。2.3.6加樣回收率試驗(yàn)稱取已知4種成分含量的同一批魚(yú)腥草鮮品藥材25g,共取6份,分別適量加入各對(duì)照品貯備液,按照“2.2.3”項(xiàng)下供試品溶液配制方法制備供試品溶液,在“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,測(cè)得4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮4種揮發(fā)性成分的平均回收率分別為81.2%、80.6%、88.3%、84.6%,RSD分別為1.5%、2.3%、1.1%、0.7%。2.4樣品測(cè)定8批不同采收期魚(yú)腥草鮮品揮發(fā)油中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯、甲基正壬酮4種揮發(fā)性成分的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2~5。3樣品含量測(cè)定結(jié)果3種載氣流速分別為0.5、1、2mL·min-1,結(jié)果表明載氣流速為1mL·min-1時(shí),峰型較好,完全出峰時(shí)間較短;3種分流方式分別為不分流、10∶1、20∶1,結(jié)果顯示分流比為10∶1時(shí),峰型較好,峰較多,基線較平穩(wěn)。提取3、4、5h3個(gè)不同水平,結(jié)果顯示提取4h和5h的揮發(fā)油提取率高,且提取完全,綜合考慮時(shí)間、耗能等因素,提取時(shí)間為4h;加入2、3與4倍水3種不同料液比,結(jié)果顯示加入3倍量水時(shí)揮發(fā)油提取效果好,效率高。2010版《中華人民共和國(guó)藥典》(一部)對(duì)魚(yú)腥草無(wú)定量測(cè)定,只有以甲基正壬酮作為指標(biāo)的薄層鑒別。魚(yú)腥草主要有效成分為揮發(fā)油,其組分復(fù)雜,雖有以單一成分為指標(biāo)進(jìn)行魚(yú)腥草含量測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道,仍難以客觀反映和評(píng)價(jià)魚(yú)腥草的質(zhì)量。因此,本實(shí)驗(yàn)首次建立了GC/MS法同時(shí)采用內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定魚(yú)腥草鮮品藥材揮發(fā)油中4-萜品醇、α-松油醇、乙酸龍腦酯和甲基正壬酮4種成分含量的方法。該方法采用多指標(biāo)反映魚(yú)腥草的質(zhì)量,快速簡(jiǎn)便,靈敏準(zhǔn)確,可為鮮魚(yú)腥草的質(zhì)量控制提供參考和依據(jù)。不同采收期