內(nèi)毒素檢測(cè)方法

內(nèi)毒素檢測(cè)方法一、內(nèi)毒素的檢測(cè)方法常用的檢測(cè)內(nèi)毒素的方法有以下幾種：.凝膠法：通過鱟試劑（鱟試劑中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）與內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)產(chǎn)生凝固蛋白（凝膠）的原理來定性檢測(cè)或半定量?jī)?nèi)毒素的方法。凝膠法是通過觀察有無凝膠形成作為反應(yīng)的終點(diǎn)。此法操作比較簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，不需要專用測(cè)定設(shè)備，可以進(jìn)行定性或半定量測(cè)定。.動(dòng)態(tài)濁度法；濁度法系利用檢測(cè)鱟試劑與內(nèi)毒素反應(yīng)過程中的濁度變化而測(cè)定內(nèi)毒素含量的方法。內(nèi)毒素與鱟試劑中的凝固酶原激活呈凝固酶，凝固酶可使凝固蛋白原變成凝固蛋白（即產(chǎn)生凝膠），使液體的濁度發(fā)生變化，通過動(dòng)態(tài)觀察濁度變化速率檢測(cè)。.終點(diǎn)顯色法:通過由于細(xì)菌內(nèi)毒素激活鱟試劑（鱟試劑中含有C因子、B因子、凝固酶原、凝固蛋白原等）C因子，引起一系列酶促反應(yīng)，激活凝固酶原形成凝固酶，凝固酶分解人工合成的顯色基質(zhì)（含N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽），使其分解為多肽和黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA，λmax=405nm）。同時(shí)，對(duì)硝基苯胺（PNA）也可用偶氮化試劑染成玫瑰紅色Qmax=545nm），避免了供試品本身的顏色對(duì)405nm處吸收峰的干擾。根據(jù)產(chǎn)物顏色判斷內(nèi)毒素濃度，又稱為比色法。.動(dòng)態(tài)顯色法:內(nèi)毒素可激活鱟試劑引起一系列酶促反應(yīng)，產(chǎn)生黃色的對(duì)硝基苯胺（pNA，λmax=405nm），在一定時(shí)間內(nèi)，動(dòng)態(tài)觀察對(duì)硝基苯胺（PNA）的生成量，與細(xì)菌內(nèi)毒素濃度成正相關(guān)。但此方法需要帶溫育系統(tǒng)的動(dòng)態(tài)光度測(cè)定儀器及配套軟件。.其他檢測(cè)方法：還有一些直接測(cè)定內(nèi)毒素定量的方法如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）、免疫學(xué)方法（如火箭免疫電泳試驗(yàn)法、L-聚賴氨酸法、雙抗體夾心法、熒光偏振法等）等，這些方法的特點(diǎn)是特異性、準(zhǔn)確性高，但其應(yīng)用尚待大量臨床實(shí)踐的驗(yàn)證，操作尚待進(jìn)一步簡(jiǎn)化；還有一些間接測(cè)定的方法，如生物學(xué)方法利用LPS刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生IL-1、TNF，通過間接測(cè)定IL-1、TNF等細(xì)胞因子含量，推算出待檢樣本中的LPS含量；化學(xué)發(fā)光法：應(yīng)用CR1和CR3受體誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞的氧化反應(yīng)作為一個(gè)反應(yīng)平臺(tái)，通過測(cè)定內(nèi)毒素對(duì)中性粒細(xì)胞的生物學(xué)作用來檢測(cè)內(nèi)毒素的含量；流式細(xì)胞術(shù)：應(yīng)用針對(duì)內(nèi)毒素表面抗原決定簇的單克隆抗體對(duì)內(nèi)毒素進(jìn)行熒光標(biāo)定而后應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，正常人血中內(nèi)毒素濃度為：＜0.1EU∕mlo隨著內(nèi)毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，不同的前處理方法、儀器及測(cè)定原理的不同，檢測(cè)結(jié)果會(huì)存在著一定差異。由于干擾鱟試驗(yàn)準(zhǔn)確性干擾因素的分析包括鱟試劑本身、操作條件、配制原料等，如試驗(yàn)的最適PH為6.25?7.25才能形成最佳凝膠、溫度對(duì)鱟試劑的靈敏度影響很大，溫度應(yīng)控制在25?40℃之間、檢測(cè)用水要求按中國藥典規(guī)定稀釋用的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水應(yīng)達(dá)到在（37±1）℃的條件下與0.03EU/ml鱟試劑混勻二十四小時(shí)內(nèi)不產(chǎn)生凝集反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)、所用器皿要徹底的洗干凈和滅菌，防止外源性內(nèi)毒素的混入等等條件。因此也限制了內(nèi)毒素測(cè)定應(yīng)用于臨床，建議當(dāng)使用內(nèi)毒素應(yīng)用于臨床診療過程中，臨床檢測(cè)內(nèi)毒素時(shí)，應(yīng)盡量選擇定量動(dòng)態(tài)水平的檢測(cè)，并結(jié)合臨床癥狀，應(yīng)用合適的儀器和試劑盒來檢測(cè)內(nèi)毒素這一個(gè)檢驗(yàn)指標(biāo)評(píng)估和預(yù)測(cè)病人是否發(fā)生敗血癥，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該建立標(biāo)準(zhǔn)化檢測(cè)方案，以更好的為臨床精準(zhǔn)診療服務(wù)。細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法，目前國內(nèi)一個(gè)是凝膠法，另一個(gè)是光度法，多數(shù)是以光度法測(cè)定，可得到一個(gè)定量的結(jié)果，這樣的結(jié)果也較可靠。內(nèi)毒素很多人較陌生，甚至有些臨床醫(yī)生，不是感染方面的醫(yī)生，可能不一定知道，或知道部分，內(nèi)毒素其實(shí)是革蘭氏陰性桿菌，細(xì)胞上的一種脂多糖，這個(gè)細(xì)菌死亡后，這些細(xì)胞壁脂多糖釋放，其為一種熱原質(zhì)，當(dāng)此種內(nèi)毒素進(jìn)入血流后會(huì)造成發(fā)熱。所以有必要檢查此方面，有時(shí)是感染性疾病，不知是病毒感染、細(xì)菌感染，還是真菌感染，就需用內(nèi)毒素來檢查，觀察是否比正常高較多，若高較多，則可能是細(xì)菌方面感染，內(nèi)毒素方面確實(shí)是陰性桿菌，可能是革蘭氏陰性菌感染，醫(yī)生可能需用抗陰性桿菌的藥物控制病情。二、內(nèi)毒素是什么？?jī)?nèi)毒素(endotoxin,ET)是構(gòu)成革蘭陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外膜最外層的脂多糖(LPS)成分，其基本結(jié)構(gòu)高度保守，由O—特異性側(cè)鏈、核心多糖和類脂A(lipidA)組成。 (特異Q抗原)」「(核心多皓) LLiPtdAO????硝酶珞?氨基乙靜■,辛長昆脂防的內(nèi)枇素的制俄結(jié)叼三、內(nèi)毒素的作用內(nèi)毒素的活性中心是類脂A,是已知最強(qiáng)的免疫刺激物之一?？赏ㄟ^刺激單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，使其產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素(IFN)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1(MIP-I)、白細(xì)胞致熱源(LP)等炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子。內(nèi)毒素的生物活性很廣泛，主要通過與靶細(xì)胞作用而誘導(dǎo)這些細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子表現(xiàn)出來的，可引起發(fā)熱反應(yīng)，促進(jìn)前列腺素合成，促使血管活性物質(zhì)的釋放，降低血壓，激活凝血系統(tǒng)和補(bǔ)體，引起局部過敏，影響或參與免疫反應(yīng)，影響血糖及腫瘤壞死等，嚴(yán)重的會(huì)致死。三、內(nèi)毒素受體目前已知的內(nèi)毒素受體主要分為以下幾類：清道夫受體(scavengerreceptor，SR)、脂多糖結(jié)合蛋白(lipopolysaccharidebindingpr