IgA腎病患者TBK1基因多態(tài)性與臨床和病理表型關(guān)系研究

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（81200518）、上海市科委基金（12ZR1446600）、上海市衛(wèi)生局青年科研基金項(xiàng)目（Z011Y108）作者單位：200092上海，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腎臟科通訊作者：蔣更如，電子郵箱為jianggeng-ru@IgA腎病患者TBK1基因多態(tài)性與臨床和病理表型關(guān)系研究于霞吳萍林芙君鄒軍劉爽朱逸蔣更如【摘要】目的探討TBK1基因多態(tài)性與IgA腎病患者臨床和病理表型的關(guān)系。方法收集上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腎臟科收治的原發(fā)性IgA腎病患者134例及正常對(duì)照者140例，PCR產(chǎn)物直接測序法篩選TBK1基因21個(gè)外顯子SNP位點(diǎn)，對(duì)篩選到的SNP位點(diǎn)與IgA腎病患者臨床和病理表型進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果(1)TBK1第8外顯子c.1137T>A存在基因多態(tài)性，正常對(duì)照組TT、AT和AA基因型頻率分別為40.7%、45.7%、13.6%，IgA腎病組頻率分別為47.8%、42.5%、9.7%，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=1.804，P=0.406），正常對(duì)照組等位基因T和A頻率分別為63.6%、36.4%，IgA腎病組頻率分別為69%、31%，兩組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=1.824，P=0.177）；（2）IgA腎病組AA型臨床特征與AT型和TT型有顯著差異，AA基因型的收縮壓（P=0.015）、24h尿蛋白定量（P=0.041）、尿酸(P=0.006)顯著高于AT型和TT型，IgA/C3的比值（P=0.014）與eGFR（CG:P=0.048）明顯降低；（3）IgA腎病組AA型系膜增生與AT型和TT型有明顯差異（χ2=6.336，P=0.042），AA型＞50%腎小球出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生的例數(shù)最多（M1=92.31%），AT型最少（M1=54.55%）。結(jié)論TBK1基因c.1137T>A與lgA腎病患者腎功能下降顯著相關(guān)，提示TBK1在IgA腎病發(fā)病和進(jìn)展中可能有一定的作用?！娟P(guān)鍵詞】IgA腎?。欢鄳B(tài)性；單核苷酸；TBK1ThestudyontheassociationofsinglenucleotideTBK1genepolymorphismwithclinicalfeaturesandhistologicalphenotypesinIgAnephropathyYUXia,WUPing,LINFujun,ZOUJun,LIUShuang,ZHUYi,JIANGGengru.DepartmentofNephrology,XinhuaHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092,Correspondingauthor:JIANGGengru.E-mail:jianggeng-ru@【Abstract】ObjectiveTofindtheroleofTBK1kinaseinthepathogenesisofIgAnephropathy．Methods134renal-biopsyprovensporadicIgAnephropathycasesofChineseHannationalityand140normalvolunteerswererecruited.Polymorphismof21exonsofTBK1genewasdetectedand1candidateSNPs(frequency>5％)ofboththecaseandcontrolgroupsweregenotypedwithdirectsequencing.Acase—controlassociationstudywascarriedout.ResultsThegenotypefrequenciesofTT，AT，AAinthe8thexonofTBK1genec.1137T>Awere40.7%，45.7%，13.6%inhealthycontrolcasesand47.8%，42.5%，9.7%inIgAnephropathycases.Therewasnosignificantdifferenceingenotypefrequenciesbetweenpatientsandcontrols(χ2=1.804，P=0.406)．ThefrequenciesofTandAallelewere63.6%and36.4%inhealthycontrolcasesand69%、31%inIgAnephropathycases.Therewasneithersignificantdifferenceinfrequenciesbetweenpatientsandcontrols(χ2=1.824，P=0.177).TherewasastatisticaldiscrepancyinclinicalfeaturesamongAAgenotypeandATgenotype,TTgenotypeinIgAnephropathycases.Thelevelsofsystolicpressure（F=4.353，P=0.015）,24hourstotalurineprotein（F=3.281，P=0.041）anduricacid(F=5.412，P=0.006)werehigherinAAgenotypethaninATandTTgenotypewhilethelevelsofIgA/C3（F=4.471，P=0.014）andeGFR（CG:F=3.106，P=0.048）werelower.ThedegreeofmesangialproliferationwasalsodifferentsignificantlyamongAAgenotypeandATgenotype,TTgenotype（χ2=6.336，P=0.042）.Thenumberofmesangialcellproliferationinmorethan50%glomeruluswasthemostinAAgenotype（M1=92.31%）buttheleastinATgenotype（M1=54.55%）.ConclusionTheSNPofc.1137T>Awassignificantlyassociatedwithpatient’srenalfunctionofIgAnephropathy.ThissuggestedTBK1maytakearoleinthepathogenesisofIgAnephropathy.【Keywords】IgAnephropathy；Polymorphism，singlenucleotide;TBK1IgA腎病(IgAnephropathy，IgAN)是世界上最常見的原發(fā)性腎小球疾病[1,2]，是引起終末期腎功能衰竭的主要原因之一。目前認(rèn)為感染、環(huán)境因素、免疫反應(yīng)、炎癥介質(zhì)、遺傳因素與IgA腎病發(fā)病有關(guān)，且越來越多證據(jù)表明遺傳因素在IgA腎病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，是一種多基因遺傳病[3]，但哪些基因參與其發(fā)病，目前尚不完全明確。TBK1(TANKbindingkinase-1)是一種TRAF((TNFRassociatingfactor)家族相關(guān)的結(jié)合激酶，主要在機(jī)體固有免疫應(yīng)答中起著重要作用?；罨腡BK1能夠誘導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3(Interferonregulatoryfactor3，IRF3)的磷酸化以及NF-κB的激活，進(jìn)而促進(jìn)干擾素β(IFN-β)的產(chǎn)生[4]。近期有研究發(fā)現(xiàn)，TBK1可以負(fù)性調(diào)節(jié)IgA的類別轉(zhuǎn)換[5]，研究者制作的TBK1-BKO（TBK1在B細(xì)胞中特異性切除）小鼠產(chǎn)生更多的抗原特異性IgA,血清IgA濃度顯著升高，自身抗體生成增多，并表現(xiàn)出腎病的癥狀，包括抗體在腎小球沉積，血肌酐、尿素氮和尿蛋白的濃度升高[6]。但TBK1激酶在人類IgA腎病發(fā)病機(jī)制中的作用尚缺乏研究。本研究首先對(duì)TBK1外顯子直接測序，選取其中的中高頻SNP(singlenucleotidepolymorphism)進(jìn)行病例-對(duì)照相關(guān)分析，探討TBK1與IgA腎病發(fā)病的關(guān)系。1對(duì)象與方法1.1研究對(duì)象收集2010-2013年上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院腎臟科收治的經(jīng)腎活檢病理檢查確診為原發(fā)性IgA腎病患者134例，其中男71例，女63例，男：女=1：0.86，年齡37.1±12.8歲（13~76歲）。所有患者均為漢族人，均排除各種繼發(fā)性疾病所致腎臟出現(xiàn)IgA沉積，排除腎炎家族史。140例健康對(duì)照組均為中國漢族人，一般情況與IgA腎病組相似。既往無腎臟疾病及其他重大疾病史，尿常規(guī)和腎功能檢測均在正常范圍。1.2實(shí)驗(yàn)室檢查尿常規(guī)、24h尿蛋白定量、肝腎功能和血電解質(zhì)等，腎小球?yàn)V過率（eGFR）用兩種公式計(jì)算[7]：(1)CG方程：本方程估計(jì)的是Ccr(ml／min)，乘以O(shè)．84轉(zhuǎn)化為GFR，再用BSA標(biāo)準(zhǔn)化即為CG-eGFR：Ccr=[(140一年齡)×體重×(0．85女性)]／(72×Scr)，CG-eGFR=Ccr×0．84×1．73/BSA，BSA采用DuBois方程計(jì)算：BSA(m2)=0．007184×體重(Kg)0.425×身高(cm)0.725，(2)簡化MDRD公式=186×(Scr)一1.154×(年齡)一0.203×(0．742女性)。Scr單位為mg／dl；年齡以歲為單位；體重以kg為單位。平均動(dòng)脈壓=(收縮壓+2×舒張壓)/3。1.3使用血液基因組DNA抽提試劑盒提取外周血基因組DNA，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及外顯子測序由凌科生物科技（上海）有限公司完成。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用SPSS13．0forWindows軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以±s表示，組間均數(shù)比較用方差分析，組間基因頻率和基因型頻率比較用χ2檢驗(yàn)，組間病理表型的比較用χ2檢驗(yàn)，P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1SNP位點(diǎn)分析TBK1基因21個(gè)外顯子測序后選取一個(gè)中高頻的SNP(c.1137T>A)，該SNP位于外顯子8，rs7486100,存在三種基因型：TT型（野生型）、AA型（突變純合型）、AT型（突變雜合型），見圖1圖1TBK1基因外顯子8SNP位點(diǎn)的3種基因型.2.2Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)將該TBK1基因SNP進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡定律檢驗(yàn)，其基因型頻率已達(dá)到遺傳平衡，具有群體代表性。2.3TBK1基因SNP位點(diǎn)基因型頻率及等位基因頻率分布兩組受試者SNP位點(diǎn)基因型頻率分布與等位基因頻率分布見表1，在IgA腎病組，基因型頻率高低依次為TT型＞AT型＞AA型；在正常對(duì)照組中，基因型頻率高低依次為AT型＞TT型＞AA型。兩組比較，TBK1第8號(hào)外顯子SNP位點(diǎn)基因型頻率（χ2=1.804，P＞0.05）與T、A等位基因頻率（χ2=1.824，P＞0.05）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1TBK1基因外顯子8SNP位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率分布組別例數(shù)基因型頻率n(%)等位基因頻率n(%)TTATAATA正常對(duì)照組14057（40.7）64（45.7）19(13.6)178(63.6)102(36.4)IgA腎病組13464(47.8)57(42.5)13(9.7)185(69.0)83(31.0)χ2值1.8041.824P值0.4060.1772.4臨床表型與TBK1基因SNP位點(diǎn)基因型的關(guān)系TBK1基因c.1137T>A基因多態(tài)性與臨床特征的關(guān)系見表2，AA基因型的收縮壓（P=0.015）、24h尿蛋白定量（P=0.041）、尿酸(P=0.006)顯著高于AT型和TT型，IgA/C3的比值（P=0.014）與eGFR（CG:P=0.048）明顯降低。

表2TBK1基因c.1137T>A基因多態(tài)性與臨床特征的關(guān)系臨床特征AA(13例)AT(57例)TT（64例）統(tǒng)計(jì)量P值血壓（mmHg，±s）收縮壓

152.85±33.65*131.77±19.35135.28±23.99F=4.3530.015舒張壓

89.92±11.88

82.82±14.3684.45±16.98F=1.1190.330平均動(dòng)脈壓110.90±18.6699.14±15.17101.40±18.29F=2.5120.085IgA/C32.27±0.65*3.31±1.072.96±1.07F=4.4710.01424h尿蛋白定量（mg，±s）

3363.98±2662.90*

2051.98±1866.211888.24±1746.70F=3.2810.041尿酸478.00±95.50*371.04±111.55373.46±111.44F=5.4120.006eGFRCG

45.01±29.91*

72.42±34.2769.60±38.68F=3.1060.048簡化MDRD49.24±33.0379.05±39.2779.59±45.93F=2.9990.053血尿[例，率（%）]肉眼血尿

2(15.39%)

17(29.82%)15(23.44%)χ2=2.4030.675鏡下血尿

10(76.92%)

32(56.14%)37(57.81%)無血尿1(7.69%)8(14.04%)12(18.75%)*代表AA型與AT型、TT型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。2.5病理表型與TBK1基因SNP位點(diǎn)基因型的關(guān)系TBK1基因c.1137T>A基因多態(tài)性與病理表型的關(guān)系見表3，3種基因型的系膜增生積分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.336，P=0.042），其中AA型＞50%腎小球出現(xiàn)系膜細(xì)胞增生的例數(shù)最多（M1=92.31%），AT型最少（M1=54.55%）。

表3TBK1基因c.1137T>A基因多態(tài)性與病理表型的關(guān)系病理表型AA(13例)AT(55例)TT(58例)統(tǒng)計(jì)量P值Oxford病理分級(jí)

M01(7.69%)

25(45.45%)23(39.66%)χ2=6.3360.042M112(92.31%)30(54.55%)35(60.34%)S02(15.38%)24(43.64%)26(44.83%)χ2=4.0240.134S111(84.62%)31(56.36%)32(55.17%)E012(92.31%)51(92.73%)54(93.10%)χ2=0.2931.000E11(7.69%)4(7.27%)4(6.90%)T03(23.08%)26(47.27%)27(46.55%)χ2=4.6880.323T12(15.38%)13(23.64%)12(20.69%)T28(61.54%)16(29.09%)19(32.76%)3討論TBK1(TANK結(jié)合激酶，也稱為T2K和NAK)，其編碼基因定位于12號(hào)染色體[l2ql4.1]，由2827個(gè)核苷酸組成，包含21個(gè)外顯子，編碼由942個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)，是一種TRAF(TNFR–associatingfactor)家族相關(guān)的NF-κB激活劑結(jié)合激酶，主要在機(jī)體固有免疫應(yīng)答中起著重要作用，也參與調(diào)節(jié)自噬[8]和癌癥[9-11]。IgA腎病是一種多基因、多因素決定的異質(zhì)性疾病，對(duì)IgA腎病易感基因的搜尋從來沒有停止過。Feehally[12]和Gharavi[13]及YuXQ[14]等使用全基因組關(guān)聯(lián)分析技術(shù)（Genome-WideAssociationStudy，GWAS）鑒定出了IgA腎病的多個(gè)易感位點(diǎn)，但未發(fā)現(xiàn)TBK1基因與IgA腎病患者相關(guān)。重復(fù)研究的效能較低或由于環(huán)境、地理分布、種族的不同，使得關(guān)聯(lián)研究的陽性結(jié)果在不同的研究當(dāng)中很難被重復(fù)，仍有一定數(shù)量的SNP等待進(jìn)一步研究。本研究選取上海地區(qū)134例IgA腎病患者和140例正常人群對(duì)TBK1基因的21個(gè)外顯子直接測序，在TBK1基因第8號(hào)外顯子發(fā)現(xiàn)一個(gè)中高頻SNP，其它區(qū)域不存在多態(tài)性位點(diǎn)。該SNP位點(diǎn)（T→A）為同義編碼SNPs,基因型分別為TT型（野生型）、AA型（突變純合型）、TA型（突變雜合型），該位點(diǎn)等位基因頻率T>A。IgA腎病組AA型臨床特征與AT型和TT型有顯著差異：收縮壓、24h尿蛋白定量、尿酸顯著升高，IgA/C3的比值與eGFR（CG）明顯降低。因此推測AA基因型為患者腎功能惡化的危險(xiǎn)因素。由于目前收集樣本數(shù)目過少，導(dǎo)致IgA腎病組基因型頻率與正常對(duì)照組無顯著差異，需要大數(shù)量的病例樣本進(jìn)行研究統(tǒng)計(jì)。該實(shí)驗(yàn)存在后續(xù)問題亟待解決，如①由于TBK1功能缺陷引起的過多的IgA是否是低程度糖基化的IgA,②這種類型的IgA的來源等，對(duì)其上述問題的闡明將有助于對(duì)IgA腎病發(fā)病機(jī)制進(jìn)一步的了解。4參考文獻(xiàn)1. Levy,Berger.WorldwideperspectiveofIgAnephropathy.AmJKidneyDis,1988,12(5):340-347.2. Donadio,Grande.IgAnephropathy.NEnglJMed,2002,347(10):738-748.3. Hsu,Ramirez,Winn,Bonventre,Owen.EvidenceforgeneticfactorsinthedevelopmentandprogressionofIgAnephropathy.KidneyInt,2000,57(5):1818-1835.4. Fitzgerald,McWhirter,Faia,Rowe,Latz,Golenbock,Coyle,Liao,Maniatis.IKKepsilonandTBK1areessentialcomponentsoftheIRF3signalingpathway.NatImmunol,2003,4(5):491-496.5. Jin,Xiao,Chang,Yu,Hu,Starr,Brittain,Chang,Cheng,Sun.ThekinaseTBK1controlsIgAclassswitchingbynegativelyregulatingnoncanonicalNF-kappaBsignaling.NatImmunol,2012,13(11):1101-1109.6. Carney.Glomerulardiseases:RegulationofIgAproductionbyTBK1preventsnephropathy.NatRevNephrol,2012,8(12):680.7. 張曉光,俞崗,汪年松,崔勇平,劉華,王蕾.7種腎小球?yàn)V過率評(píng)估方程在慢性腎臟病患者中的比較.中國中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志,2008(06):517-520.8. Bram.TBK1suppressionofIgAintheNIKoftime.NatImmunol,2012,13(11):1027-1029.9. Kim,Jung,Wang,Joseph,Mishra,Hill,Krebsbach,Pienta,Shiozawa,Taichman.TBK1regulatesprostatecancerdormancythroughmTORinhibition.Neoplasia,2013,15(9):1064-1074.10. Kim,Welsh,Oguz,Fang,Bai,Kinos