碩士研究生分子生物學(xué)復(fù)習(xí)題答案

碩士研究生分子生物學(xué)復(fù)習(xí)（JUJU）一、名詞解釋1.基因（gene）：是指核酸分子中貯存遺傳信息的遺傳單位，是指貯存有功能的蛋白質(zhì)多肽鏈或RNA序列信息及表達(dá)這些信息所必需的全部核苷酸序列。 2.基因組（genome）：是指細(xì)胞或生物體中，一套完整單倍體的遺傳物質(zhì)的總和?；蚪M的結(jié)構(gòu)主要指不同的基因功能區(qū)域在核酸分子中的分布和排列情況，基因組的功能是儲(chǔ)存和表達(dá)遺傳信息。 3.基因家族（genefamily）：是指核苷酸序列或編碼產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)具有一定程度同源性的一組基因。同一個(gè)家族的基因成員是由同一祖先基因進(jìn)化而來(lái)。4.假基因（pseudogene）：在多基因家族中，某些成員并不能表達(dá)出有功能的產(chǎn)物，這些基因稱(chēng)為假基因，用ψ表示。假基因與有功能的基因同源，原來(lái)也可能是有功能的基因，由于缺失、倒位或點(diǎn)突變等原因失去活性，成為無(wú)功能的基因，它們或者不能轉(zhuǎn)錄，或者轉(zhuǎn)錄后生成無(wú)功能的異常多肽。5.質(zhì)粒（plasmid）：是存在于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的一類(lèi)獨(dú)立于染色體的遺傳成分，它是由環(huán)形雙鏈DNA組成的復(fù)制子。質(zhì)粒DNA分子可以持續(xù)穩(wěn)定的處于染色體外的游離狀態(tài)，但在一定條件下又會(huì)可逆的整合到宿主染色體上，隨染色體的復(fù)制而復(fù)制，并通過(guò)細(xì)胞分裂傳遞到后代。 6.基因超家族（genesuperfamily）：是指一組由多基因家族及單基因組成的更大的基因家族。它們的結(jié)構(gòu)有程度不等的同源性，可能是由于基因擴(kuò)增后又經(jīng)過(guò)結(jié)構(gòu)上的輕微改變，因此它們可能都起源于相同的祖先基因。但是它們的功能并不一定相同，這一點(diǎn)正是與多基因家族的差別。這些基因在進(jìn)化上也有親緣關(guān)系，但親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。如免疫球蛋白超家族。 7.衛(wèi)星DNA（satelliteDNA）：為非編碼區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列。通常存在于內(nèi)含子和間隔DNA內(nèi)。重復(fù)次數(shù)從數(shù)次至數(shù)百次，甚至幾十萬(wàn)次，串聯(lián)重復(fù)單位從最短的2bp起，長(zhǎng)短不等。這類(lèi)重復(fù)順序組成衛(wèi)星DNA的基礎(chǔ)?？煞譃槿?lèi)：大／小／微衛(wèi)星DNA。8.基因多態(tài)性：是指由于等位基因間在特定位點(diǎn)上DNA序列存在差異造成的，一般發(fā)生在基因序列中不編碼蛋白質(zhì)的區(qū)域和沒(méi)有重要調(diào)節(jié)功能的區(qū)域。9.操縱子（operator）：是阻遏蛋白識(shí)別與結(jié)合的一小段DNA序列，轉(zhuǎn)錄過(guò)程存在阻遏調(diào)控機(jī)制的基因中均含有這樣的序列。操縱子緊接在啟動(dòng)子下游，通常與啟動(dòng)子有部分重疊。 10.順式作用元件（cis-actingelements）：是指那些與結(jié)構(gòu)基因表達(dá)調(diào)控相關(guān)、能夠被基因調(diào)控蛋白特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。原核生物中主要是啟動(dòng)子、阻遏蛋白結(jié)合位點(diǎn)、正調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)、增強(qiáng)子等。真核生物中包括啟動(dòng)子、上游啟動(dòng)子元件、增強(qiáng)子、加尾信號(hào)和一些反應(yīng)元件等。 11.反式作用因子（trans-actingelements）：在真核生物中，基因特異性轉(zhuǎn)錄因子稱(chēng)為反式作用因子，這些因子通常是通過(guò)與增強(qiáng)子或上游啟動(dòng)元件結(jié)合而發(fā)揮作用。反式作用因子通過(guò)與通用轉(zhuǎn)錄因子及RNA聚合酶相互作用而刺激轉(zhuǎn)錄，這些相互作用促進(jìn)前起始復(fù)合物的形成。 12.增強(qiáng)子（enhancer）：是一種較短的DNA序列，能夠被反式作用因子識(shí)別與結(jié)合。反式作用因子與增強(qiáng)子元件結(jié)合后能夠調(diào)控（通常為增強(qiáng)）臨近基因的轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子序列通常是數(shù)個(gè)形成一簇，位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-100~-300bp處，但在基因之外或某些內(nèi)含子中也有增強(qiáng)子序列。13.啟動(dòng)子（promoter）：是RNA聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的DNA序列。啟動(dòng)子具有方向性，一般位于結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)的上游，啟動(dòng)子本身并不被轉(zhuǎn)錄。（也有一些真核生物啟動(dòng)子位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)下游，且可以被轉(zhuǎn)錄）14.載體（vector）：攜帶外源DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞，并在宿主細(xì)胞中進(jìn)行無(wú)性繁殖或表達(dá)的小分子DNA。 這種DNA進(jìn)入受體細(xì)胞后，可自主復(fù)制，或插入到基因組中，隨受體細(xì)胞的基因組一起復(fù)制。載體上還常帶有特定的藥物抗性基因，便于篩選。（按功能可分為克隆載體和表達(dá)載體，按來(lái)源可分為質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘粒、病毒和人工染色體載體等。）15.基因工程（geneengineering）：將基因進(jìn)行克隆，并利用克隆的基因表達(dá)、制備特定的蛋白或多肽產(chǎn)物，或定向改造細(xì)胞乃至生物個(gè)體的特性所用的方法及相關(guān)的工作統(tǒng)稱(chēng)為基因工程。／是在分子水平上，用人工方法提取或制備DNA,在體外切割、拼接和重新組合，然后通過(guò)載體把重組的DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞，使外源DNA在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制與表達(dá)，生產(chǎn)出人們所需要的產(chǎn)物，或定向創(chuàng)造生物新性狀，并使之穩(wěn)定地傳給下一代。 16.PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。是在DNA聚合酶、模版DNA、引物和4種dNTP存在的條件下進(jìn)行的體外酶促DNA合成反應(yīng)，是在體外特異性擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的一種方法。／其原理是依據(jù)細(xì)胞中DNA半保留復(fù)制機(jī)理，DNA在不同溫度下變性、復(fù)性的特性，人為控制溫度（高溫變性、低溫退火、中溫延伸）循環(huán)多次后使目的基因得到擴(kuò)增。17.RNAi（RNAinterference）：RNA干涉，是指外源性的dsRNA所致的細(xì)胞內(nèi)有效的和特異性的基因封閉。其作用機(jī)制是雙鏈RNA被特異的核酸酶降解，產(chǎn)生干擾小RNA（siRNA），這些siRNA與同源的靶RNA互補(bǔ)結(jié)合，特異性酶降解靶RNA，從而抑制、下調(diào)基因表達(dá)。已經(jīng)發(fā)展成為基因治療、基因結(jié)構(gòu)功能研究的快速而有效的方法。／是指在生物體細(xì)胞內(nèi)，dsRNA引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過(guò)程。是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，在生物體內(nèi)普遍存在。／指在生物體細(xì)胞內(nèi)，外源性dsRNA（酶切產(chǎn)生siRNA）引起同源mRNA的特異性降解，因而抑制相應(yīng)基因表達(dá)的過(guò)程。是一種轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默，在生物體內(nèi)普遍存在（外源性dsRNA被一種叫DICER的dsRNA內(nèi)切酶剪切產(chǎn)生siRNA，其可識(shí)別靶mRNA分子并使其被相應(yīng)的核糖核酸酶切割成片段，從而抑制正?；虻谋磉_(dá)），正常時(shí)生物體內(nèi)不會(huì)有RNAi現(xiàn)象，只有在外源性RNA導(dǎo)入的情況下會(huì)發(fā)生。18.分子雜交（nucleicacidhybridization）：是指具有互補(bǔ)序列的兩條核酸單鏈在一定條件下按堿基酸對(duì)原則形成雙鏈的過(guò)程。 19.基因診斷（genediagnosis）：是以DNA和RNA作為診斷材料，通過(guò)檢查基因的存在、缺陷或異常表達(dá)，對(duì)人體狀態(tài)和疾病作出診斷的方法和過(guò)程。其基本原理是檢測(cè)DNA或RNA的結(jié)構(gòu)變化與否，量的多少及表達(dá)功能是否正常，以確定被檢查者是否存在基因水平的異常變化，以此作為疾病診斷的依據(jù)。 20.基因治療（genetherapy）：是應(yīng)用基因或基因產(chǎn)物，治療疾病的一種方法。狹義的說(shuō)，基因治療是把外界的正?；蛑委熁颍ㄟ^(guò)載體轉(zhuǎn)移到人體的靶細(xì)胞，進(jìn)行基因修飾和表達(dá)，改善疾病的一種治療手段。21.miRNA（microRNA）：是真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類(lèi)內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長(zhǎng)約20～25nt。成熟的miRNA是由較長(zhǎng)的初級(jí)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)過(guò)一系列核酸酶的剪切加工而產(chǎn)生的，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或阻遏靶mRNA的翻譯。／長(zhǎng)度約20-25個(gè)堿基對(duì)的非編碼單鏈RNA，通過(guò)與mRNA3'UTR互補(bǔ)的機(jī)制結(jié)合到mRNA上，抑制其轉(zhuǎn)錄或直接導(dǎo)致其降解，從而抑制基因表達(dá)。有高3.人類(lèi)基因組的組織結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。P371）人類(lèi)基因組的重復(fù)序列：（按組織結(jié)構(gòu)和分布特點(diǎn)分類(lèi)）①反向重復(fù)序列：是指兩個(gè)順序相同的拷貝在DNA鏈上呈反向排列。人類(lèi)基因組中約含5%的反向重復(fù)序列，散布于整個(gè)基因組中，常見(jiàn)于基因組的調(diào)控區(qū)內(nèi)，可能與復(fù)制轉(zhuǎn)錄的調(diào)控有關(guān)。②串聯(lián)重復(fù)序列：特點(diǎn)是具有一個(gè)固定的重復(fù)單位，該重復(fù)單位頭尾相連形成重復(fù)順序片段，約占人類(lèi)基因組10%。編碼區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列：如組蛋白基因、5sRNA基因等，其意義在于快速大量合成相應(yīng)基因的mRNA。非編碼區(qū)串聯(lián)重復(fù)序列：其通常存在于間隔DNA和內(nèi)含子內(nèi)，是組成衛(wèi)星DNA的基礎(chǔ)。③散在重復(fù)序列：除串聯(lián)重復(fù)和反向重復(fù)序列之外的所有重復(fù)序列，不論重復(fù)次數(shù)多少，都可歸在散在重復(fù)序列。根據(jù)重復(fù)序列的長(zhǎng)度可分為短散在核元件和長(zhǎng)散在核元件。2）人類(lèi)基因組中的DNA多態(tài)性：DNA多態(tài)性是指發(fā)生在DNA水平的多態(tài)性。在人類(lèi)漫長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中，由于染色體結(jié)構(gòu)的改變、DNA突變、重組、交換以及轉(zhuǎn)座子的插入等，使得除了單卵雙胞得個(gè)體外，沒(méi)有兩個(gè)個(gè)體的DNA組成是完全相同的。（人類(lèi)基因組多態(tài)性都是按孟德?tīng)栆?guī)律遺傳的，具有體細(xì)胞穩(wěn)定性和種系穩(wěn)定性，因此可用它們作為染色體上疾病基因座位的遺傳標(biāo)記。）①基因多態(tài)性：是由于等位基因間在特定位點(diǎn)上DNA序列存在差異造成的。②限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性：是指突變、重排、單個(gè)核苷酸的插入或缺失可使DNA順序發(fā)生改變，其中有些可能造成限制酶切位點(diǎn)的增加、缺失或易位，致使DNA分子的限制酶切位點(diǎn)數(shù)目、位置發(fā)生改變。用限制酶切割不用個(gè)體基因組時(shí)，所產(chǎn)生的限制性片段的數(shù)目和每個(gè)片段的長(zhǎng)度不同。③串聯(lián)重復(fù)序列多態(tài)性：是以相同的核心序列按首尾相連的形式串聯(lián)排列在一起形成一段特殊的序列的重復(fù)次數(shù)有較大變化。為DNA序列長(zhǎng)度多態(tài)性。主要發(fā)生在小衛(wèi)星和微衛(wèi)星DNA。④單核甘酸多態(tài)性：是指基因組內(nèi)特定核苷酸位置上存在不同的堿基，其中最少的一種在群體中的頻率不低于1%。4.原核生物基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。P78原核生物基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯偶聯(lián)，mRNA降解快、半衰期短。原核生物基因表達(dá)調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平，其次是翻譯水平。有兩種方式：起始調(diào)控（啟動(dòng)子調(diào)控）和終止調(diào)控（衰減子調(diào)控），轉(zhuǎn)錄是通過(guò)負(fù)調(diào)控因子和正調(diào)控因子進(jìn)行復(fù)合調(diào)控的。以大腸桿菌（E.coli）為例介紹。轉(zhuǎn)錄起始調(diào)控的主要模式：①σ因子控制特定基因的表達(dá)：不同的σ因子可以競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合RNA聚合酶，RNA聚合酶的核心酶與不同σ因子組成的全酶識(shí)別不同基因的啟動(dòng)子。②乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控：在大腸桿菌的許多操縱子中，基因的轉(zhuǎn)錄不是由單一因子調(diào)控的，而是通過(guò)負(fù)調(diào)控因子和正調(diào)控因子進(jìn)行復(fù)合調(diào)控的。細(xì)菌通常優(yōu)先以葡萄糖作為能源，葡萄糖代謝產(chǎn)物能抑制細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶和激活磷酸二酯酶的活性，結(jié)果使細(xì)胞內(nèi)的cAMP水平降低。葡萄糖耗盡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，即可通過(guò)CAP調(diào)控其它操縱子的表達(dá)。E.coli的乳糖操縱子有Z、Y、A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，編碼β-半乳糖甘酶、乳糖透酶和半乳糖甘乙?；?，結(jié)構(gòu)基因上游有一個(gè)啟動(dòng)子（P）和一個(gè)操縱子（O）。啟動(dòng)子上游有一個(gè)CAP蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。啟動(dòng)子、操縱子和CAP結(jié)合位點(diǎn)共同構(gòu)成乳糖操縱子的調(diào)控區(qū)。I基因是調(diào)節(jié)基因，編碼產(chǎn)生阻遏蛋白。阻遏蛋白為四聚體，每個(gè)亞基相同。在沒(méi)有乳糖的條件下，阻遏蛋白能與操縱子結(jié)合。由于操縱子與啟動(dòng)子有部分重疊，阻遏蛋白與操縱子結(jié)合后，抑制結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。但是阻遏蛋白的抑制作用并不是絕對(duì)的。乳糖存在時(shí)，乳糖經(jīng)透酶作用進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β-半乳糖甘酶催化，轉(zhuǎn)變成半乳糖和葡萄糖，同時(shí)催化一小部分乳糖轉(zhuǎn)變成異乳糖。異乳糖作為誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合，使阻遏蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致阻遏蛋白與操縱基因的解聚，引起結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄。lac操縱子中的lac啟動(dòng)子是弱啟動(dòng)子，RNA聚合酶與之結(jié)合的能力很弱，只有CAP結(jié)合到啟動(dòng)子上游的CAP結(jié)合位點(diǎn)后，促進(jìn)RNA聚合酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，才能有效轉(zhuǎn)錄。在這種調(diào)控中，CAP起正調(diào)控作用。乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄起始由CAP和阻遏蛋白兩種調(diào)控因子來(lái)控制，可因葡萄糖和乳糖的存在與否而有4種不同的組合。葡萄糖存在、乳糖不存在：此時(shí)無(wú)誘導(dǎo)劑存在，阻遏蛋白與DNA結(jié)合，而且由于葡萄糖的存在，CAP也不能發(fā)揮正調(diào)控作用，基因處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖和乳糖都不存在：在沒(méi)有葡萄糖的情況下，CAP可以發(fā)揮正調(diào)控作用。但由于沒(méi)有誘導(dǎo)劑，阻遏蛋白的負(fù)調(diào)節(jié)作用是基因仍然處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖和乳糖都存在：乳糖的存在對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生誘導(dǎo)作用。但由于葡萄糖的存在使細(xì)胞cAMP水平降低，cAMP-CAP復(fù)合物不能形成，CAP不能結(jié)合到CAP結(jié)合位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)錄仍不能啟動(dòng)，基因處于關(guān)閉狀態(tài)。葡萄糖不存在、乳糖存在：此時(shí)CAP可以發(fā)揮正調(diào)控作用，阻遏蛋白由于誘導(dǎo)劑的存在而失去負(fù)調(diào)控作用，基因被打開(kāi)，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。1）阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)：在沒(méi)有乳糖的條件下，阻遏蛋白能與操縱序列O結(jié)合，抑制了RNA聚合酶與啟動(dòng)子P的結(jié)合，從而抑制酶與啟動(dòng)子的結(jié)合，使乳糖操縱子處于阻遏狀態(tài)。2）CAP的正性調(diào)節(jié)：分解代謝基因激活（CAP）分子內(nèi)存在DNA和CAMP結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)沒(méi)有葡萄糖使，CAMP濃度升高，CAMP與CAP結(jié)合，CAMP－CAP復(fù)合物結(jié)合于CAP結(jié)合位點(diǎn)，提高了乳糖操縱子的轉(zhuǎn)錄活性。3）不同生長(zhǎng)條件下的協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：是指LAC操縱子阻遏蛋白的負(fù)性調(diào)節(jié)與CAP的正性調(diào)節(jié)機(jī)制協(xié)調(diào)合作。CAP不能激活被阻遏蛋白封閉的基因轉(zhuǎn)錄，反之沒(méi)有CAP的存在來(lái)加強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性，即使阻遏蛋白從操縱子上解離，基因仍無(wú)轉(zhuǎn)錄活性。具體以下4種情況。③阿拉伯糖操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控④色氨酸操縱子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控⑤DNA片段倒位對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控轉(zhuǎn)錄終止的調(diào)控：分為依賴(lài)p因子和不依賴(lài)p因子的終止調(diào)控，核糖體也參與轉(zhuǎn)錄終止。翻譯的可調(diào)控性及調(diào)控方式：①SD序列對(duì)翻譯的影響A.SD序列的順序及位置對(duì)翻譯的影響不同的SD序列有一定的差異，因而翻譯起始效率不一樣。SD序列的核心序列是六個(gè)嘌呤（AGGAGG），SD序列與核糖體小亞基中16SrRNA3’端的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合，使起始密碼子定位于翻譯起始部位。SD1、SD2、SD3的序列可以不同，SD1/ORF1，SD2/ORF2，SD3/ORF3的AUG和SD之間的距離也不同。核糖體以不同的效率結(jié)合不同的SD和起始翻譯。SD序列位于起始密碼子AUG上游8～13個(gè)堿基處，不同的開(kāi)放閱讀框上游的SD序列與起始密碼子之間的距離是不同的，這使得起始密碼子在翻譯起始部位定位的精確度不同，因而翻譯的起始效率也不相同。此外，某些蛋白質(zhì)與SD序列的結(jié)合也會(huì)影響mRNA與核糖體的結(jié)合，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯。不同的SD序列有一定的差異，因而翻譯起始效率不一樣。SD序列與起始密碼子之間的距離，也影響mRNA翻譯效率。核糖體以不同的效率結(jié)合不同的SD和起始翻譯。不同的開(kāi)放閱讀框上游的SD序列與起始密碼子之間的距離是不同，這使起始密碼子在翻譯起始部位定位的精確度不同，因而翻譯的起始效率也不同。B.mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)隱蔽SD序列的作用在某些mRNA分子中，核糖體結(jié)合位點(diǎn)在莖環(huán)中，使核糖體無(wú)法結(jié)合，只有破壞莖環(huán)結(jié)構(gòu)，核糖體才能結(jié)合。（紅霉素抗性的細(xì)菌編碼一種紅霉素甲基化酶，該酶使核糖體23SmRNA上特定位點(diǎn)的一個(gè)腺嘌呤甲基化，阻止紅霉素的結(jié)合。紅霉素通過(guò)該位點(diǎn)結(jié)合于核糖體，抑制蛋白質(zhì)合成。）②mRNA的穩(wěn)定性許多細(xì)菌mRNA降解速度很快，細(xì)菌的生理狀態(tài)和環(huán)境因素都會(huì)影響mRNA的降解速度。細(xì)菌mRNA的降解是由核酸內(nèi)、外切酶共同完成的。③翻譯產(chǎn)物對(duì)翻譯的調(diào)控：如核糖體蛋白的調(diào)控、翻譯終止因子RF2調(diào)節(jié)自身的翻譯。1．核糖體蛋白：核糖體蛋白合成的控制主要是在翻譯水平。每個(gè)操縱子轉(zhuǎn)錄的mRNA所編碼的蛋白質(zhì)中都有一種蛋白（或兩種蛋白形成的一個(gè)復(fù)合物）可以結(jié)合到多順?lè)醋由嫌蔚囊粋€(gè)特定部位，阻止核糖體結(jié)合和起始翻譯。2．翻譯終止因子RF2調(diào)節(jié)自身的翻譯：RF2識(shí)別終止密碼UGA和UAA，RF1識(shí)別終止密碼UAG和UAA。④小分子RNA的調(diào)控作用1．調(diào)整基因表達(dá)產(chǎn)物的類(lèi)型2．低水平表達(dá)基因的控制5.真核生物轉(zhuǎn)錄水平的基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制。P891）轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成反式作用因子通過(guò)與順式作用元件結(jié)合來(lái)影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。TATA因子結(jié)合TATA盒，并與其他轉(zhuǎn)錄因子一起輔助RNApolII與啟動(dòng)子結(jié)合，形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)錄復(fù)合物。2）轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控真核基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制涉及反式作用因子的激活及反式作用因子的作用。①反式作用因子的活性調(diào)節(jié)：A.表達(dá)式調(diào)節(jié)；B.共價(jià)修飾；C.配體結(jié)合；D.蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用。②反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合③反式作用因子的作用方式：A.成環(huán)：反式作用因子結(jié)合于增強(qiáng)子后，利用DNA的柔曲性，彎曲成環(huán)，與RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)靠近而發(fā)揮作用。B.扭曲：使DNA構(gòu)型改變而發(fā)揮作用。C.滑動(dòng)：反式作用因子結(jié)合到特異的位點(diǎn)上，然后沿DNA滑動(dòng)到另一特異的序列發(fā)揮作用。D.Oozing：一種反式作用因子與順式作用元件結(jié)合，促進(jìn)另一種反式作用因子與鄰近的順式作用元件結(jié)合，后者又促使下一個(gè)反式作用因子與其順式作用元件的結(jié)合，直到基因的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)，進(jìn)而影響基因的轉(zhuǎn)錄。④反式作用因子的組合式調(diào)控作用：反式作用因子結(jié)合順式作用元件后，可激活轉(zhuǎn)錄，也可抑制轉(zhuǎn)錄。反式作用因子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控不是由單一因子完成的，而是幾種因子組合，發(fā)揮特定的作用，稱(chēng)為組合式基因調(diào)控。3）轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控①5’端加帽和3’端多聚腺苷酸化的調(diào)控意義：加帽和poly（A）尾不是mRNA穩(wěn)定的唯一因素，但是十分重要，保證mRNA在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中不被降解。②mRNA的選擇剪接對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用A.mRNA選擇性剪接：真核細(xì)胞前體mRNA的剪接過(guò)程中，參加拼接的外顯子可以不按其在基因組的線性分布次序拼接，內(nèi)涵子也可以不被切除而保留，即一個(gè)外顯子或內(nèi)含子是否出現(xiàn)在成熟的mRNA中是可以選擇的，這種剪接方式稱(chēng)為選擇性剪接。包括：外顯子選擇、內(nèi)含子選擇、互斥外顯子、內(nèi)部剪接位點(diǎn)。B.選擇剪接對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控作用③mRNA運(yùn)輸?shù)目刂脾躮RNA穩(wěn)定性條件調(diào)控主要是通過(guò)反式作用因子、順式作用元件和RNA聚合酶的相互作用來(lái)完成的。當(dāng)反式作用因子和順式作用元件結(jié)合后，將影響轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成，從而影響轉(zhuǎn)錄的起始和效率。因此真核生物的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特點(diǎn)在于：反式作用因子的結(jié)構(gòu)作用特點(diǎn)，以及反式作用因子如何影響轉(zhuǎn)錄起始過(guò)程，特別是轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物的形成。1）反式作用因子有三個(gè)明顯的結(jié)構(gòu)作用特點(diǎn)：①分子中含有DNA識(shí)別結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活域、蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)結(jié)合域；②能特異性識(shí)別及結(jié)合基因上游調(diào)控區(qū)的順式作用元件；③結(jié)合后，可激活或阻遏下游基因的表達(dá)。DNA結(jié)合域有以下結(jié)構(gòu)模式：鋅指結(jié)構(gòu)、同源結(jié)構(gòu)域、亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)、螺旋環(huán)螺旋結(jié)構(gòu)，堿性@結(jié)構(gòu)。轉(zhuǎn)錄活性域通常也具有酸性a螺旋結(jié)構(gòu)域，富含谷氨酰胺結(jié)構(gòu)域，富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域。反式作用因子通過(guò)上述結(jié)構(gòu)特征介導(dǎo)反式作用因子與反式元件的相互作用。2）反式作用因子對(duì)轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)控涉及反式作用因子的活性調(diào)節(jié)以及反式作用因子與順式作用元件的結(jié)合方式及特點(diǎn)。①活性調(diào)節(jié)：反式作用因子合成后，可以無(wú)活性的狀態(tài)存在，也可以在需要時(shí)才合成，合成后就有活性。總之，反式作用因子的激活包括以下4種類(lèi)型：A.表達(dá)式調(diào)節(jié)：這類(lèi)因子合成出來(lái)后就有活性，只在需要時(shí)才合成并迅速降解，不能積累。B.共價(jià)修飾調(diào)節(jié)：包括磷酸化去磷酸化修飾和糖基化修飾。C.配體結(jié)合后激活：如某些激素的受體型的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與激素結(jié)合后即被激活。D.蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用：形成同源或異源二聚體后，才有調(diào)節(jié)活性。②與順式元件的結(jié)合方式及特點(diǎn)：反式作用因子被激活后，即可結(jié)合上游啟動(dòng)子元件和增強(qiáng)子元件中的保守性序列。只有少數(shù)是優(yōu)先于DNA序列結(jié)合，然后才被激活。A.作用方式：反式作用因子的結(jié)合位點(diǎn)一般離其所調(diào)控的基因域或RNA聚合酶結(jié)合位點(diǎn)的距離較遠(yuǎn)，一般通過(guò)成環(huán)、扭曲、滑動(dòng)、Oozing等方式影響轉(zhuǎn)錄起始的調(diào)節(jié)。B.組合式調(diào)控作用：反式作用因子的作用可以是激活轉(zhuǎn)錄，也可以是抑制轉(zhuǎn)錄，但反式作用因子對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控不是由單一因子完成的，而是幾種因子組合發(fā)揮特定的作用。不同因子的正或負(fù)調(diào)控的綜合結(jié)果，影響著基因的最后轉(zhuǎn)錄與否，而且產(chǎn)生的凈效應(yīng)也不是簡(jiǎn)單加和的結(jié)果。一種反式作用因子可參與調(diào)控不同基因的表達(dá)，幾種不同的反式作用因子可以控制一個(gè)基因的表達(dá)。通過(guò)上述組合式的表達(dá)，使有限數(shù)量的反式作用因子可以調(diào)控不同基因的表達(dá)。6.在大腸桿菌中如何獲得蛋白質(zhì)類(lèi)的基因工程產(chǎn)品。P158、P1771）目的基因：插入大腸桿菌表達(dá)的目的基因可以是真核基因也可以是原核基因，目的基因如果來(lái)自真核細(xì)胞，必須是cDNA，并除去5端非編碼區(qū)和信號(hào)肽編碼區(qū)。2）選擇合適的載體：所用載體必須是大腸桿菌表達(dá)載體pRSET質(zhì)粒。3）選擇合適的限制性酶分別切割載體和靶基因片段4）用連接酶連接目的基因與載體：對(duì)于pRSET來(lái)說(shuō)，目的基因與載體有兩種不同的連接方式，可構(gòu)建兩種不同的重組DNA表達(dá)載體，產(chǎn)生兩種不同的蛋白：即融合型蛋白和非融合型蛋白。5）轉(zhuǎn)化：將重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞（用氯化鈣制備感受態(tài)細(xì)胞）可采用CaCl2制備感受態(tài)細(xì)胞，也可使用電轉(zhuǎn)化、PEG方法等。6）篩選：包括抗生素耐藥菌株的篩選及重組轉(zhuǎn)化子的篩選7）表達(dá)：選擇受體菌株和誘導(dǎo)條件，A.受體菌與表達(dá)載體匹配；B.誘導(dǎo)條件主要由啟動(dòng)子決定。為了提高外源基因的表達(dá)水平，常用的方法是將受體菌的生長(zhǎng)與外源基因的表達(dá)分開(kāi)。8）從分子量、生物活性等方面對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步鑒定9）表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。7.如何實(shí)現(xiàn)疾病基因的克??？基因克隆即是在體外通過(guò)人工剪、接，將不同來(lái)源的DNA分子組成一個(gè)重組體，然后進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)。疾病基因克隆通常包括如下步驟：1）目的基因的提?。杭膊』虻奶崛?；2）基因載體（克隆載體）的選擇與構(gòu)建；3）限制性酶切：將疾病基因切成不同大小的片段；4）連接到另一個(gè)DNA分子上（克隆載體）；5）轉(zhuǎn)化：將這個(gè)重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞；6）篩選和鑒定：對(duì)吸收了重組DNA的受體細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定；7）基因表達(dá)：對(duì)含有重組DNA的細(xì)胞進(jìn)行大量培養(yǎng)，檢測(cè)外源基因是否表達(dá)。8.PCR的原理和引物設(shè)計(jì)原則。P185PCR的基本原理：PCR是模板DNA、引物和4種dNTP存在的條件下依賴(lài)DNA聚合酶進(jìn)行體外的酶促DNA合成反應(yīng)，是在體外特異性擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段的一種方法。反應(yīng)體系中包括DNA模板、耐熱的TaqDNA聚合酶、化學(xué)合成的寡聚核苷酸引物、4種dNTP以及合適的緩沖體系。PCR技術(shù)的特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。反應(yīng)分為3步：變性，退火和延伸。是半保留復(fù)制。原理：PCR的原理與細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制相似，但反應(yīng)體系較簡(jiǎn)單。是根據(jù)DNA半保留復(fù)制原理，DNA在不同溫度下變性、復(fù)性的特性，以待擴(kuò)增的目的DNA分子為模板，以一對(duì)分別與模板5’末端和3’末端互補(bǔ)配對(duì)的寡核苷酸片段為引物，在4種dNTP和耐熱的TaqDNA聚合酶及合適的緩沖體系中，通過(guò)人為控制溫度（高溫變性、低溫退火、中溫延伸）發(fā)生依賴(lài)DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng)，循環(huán)多次后可使模板上介于兩個(gè)引物之間的目的DNA片段得到擴(kuò)增。其特異性取決于引物與模板結(jié)合的特異性。PCR引物設(shè)計(jì)原則：1）引物長(zhǎng)度一般為15～30個(gè)核苷酸。2）引物中的堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶的堆積現(xiàn)象。引物序列中3端不應(yīng)有連續(xù)3個(gè)G和C，否則會(huì)使引物在模板的G+C富集區(qū)錯(cuò)誤配對(duì)。引物中G+C的含量在45～55%左右。設(shè)計(jì)引物時(shí)要考慮3和5端引物具有相似的Tm值。引物長(zhǎng)度要確保解鏈溫度不低于54oC。3）引物自身內(nèi)部不應(yīng)存在互補(bǔ)序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。4）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其應(yīng)避免3端的互補(bǔ)重疊。5）引物的堿基序列不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。6）引物3端是引發(fā)延伸的起點(diǎn)，因此一定要與模板DNA配對(duì)。每條引物的3末端序列不能與任一條引物中的任何序列互補(bǔ)（互補(bǔ)序列不能超過(guò)3個(gè)堿基）。7）引物與模板結(jié)合是，引物的5端最多可以游離十幾個(gè)堿基而不影響PCR反應(yīng)的進(jìn)行。引物的5端可以修飾，因而可以改變幾個(gè)堿基，以引入酶切位點(diǎn)。9.核酸分子雜交的原理和基本過(guò)程。P214核酸分子雜交的原理：具有互補(bǔ)序列的兩條單鏈核酸分子在一定條件下（適宜的溫度及離子強(qiáng)度等）堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，重新形成雙鏈；在這一過(guò)程中，核酸分子經(jīng)歷了變性和復(fù)性的變化，以及復(fù)性過(guò)程中各分子間鍵的形成和斷裂等。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列和已知核酸序列。在雜交體系中已知的核酸序列稱(chēng)作探針，探針通常用于進(jìn)行核素或非核素示蹤標(biāo)記。基本過(guò)程：1）Southern印跡雜交：鑒別DNA靶分子。①待測(cè)核酸樣品的制備：制備待測(cè)DNA，DNA的限制酶消化；②待測(cè)DNA樣品的電泳分離；③凝膠中的核酸變性（堿變性）；④Southern轉(zhuǎn)膜；⑤探針的制備；⑥Southern雜交（預(yù)雜交、雜交、洗脫）；⑦雜交結(jié)果的檢測(cè)。2）Northern印跡雜交：鑒別RNA靶分子。①實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備，創(chuàng)造一個(gè)無(wú)RNA酶的環(huán)境；②制備凝膠；③樣品的處理，確保核酸樣品具有相當(dāng)?shù)募兌群屯暾?；④RNA的電泳；⑤RNA的轉(zhuǎn)移；⑥RNA的固定；⑦探針標(biāo)記；⑧Northern雜交；⑨雜交結(jié)果的檢測(cè)。10.基因治療的基本策略。P270基因治療理論上可以通過(guò)兩個(gè)基本策略達(dá)到目的，即原位矯正病變基因和正?；蛉〈蚋深A(yù)。1）原位矯正病變基因：如同外科手術(shù)，切除病變部分，換上正常健康基因，目前難以做到。2）正?；蛉〈蚋深A(yù)：①基因置換，用正常的基因替換致病基因。即將特定的目的基因?qū)胩囟ǖ募?xì)胞，通過(guò)定位同源重組，以導(dǎo)入正?；蛑脫Q基因組內(nèi)原有的缺陷基因，不涉及基因組的任何改變。②基因添加，是指不除去異?；?，向靶細(xì)胞導(dǎo)入外源基因通過(guò)非定點(diǎn)整合，使其表達(dá)產(chǎn)物，從而彌補(bǔ)缺陷基因的功能。或向靶細(xì)胞導(dǎo)入原本不表達(dá)的基因，利用該基因的表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。③基因干預(yù)，是采用特定的方法，抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或通過(guò)破壞某個(gè)基因，使之不能表達(dá)，達(dá)到治療疾病的目的。4、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)性基因治療、化療保護(hù)性基因治療、特異性細(xì)胞殺傷性基因治療、生殖細(xì)胞基因治療等。11.RNA如何調(diào)節(jié)基因表達(dá)？P327下述一些重要種類(lèi)的不編碼蛋白質(zhì)的RNA分子在生物大分子加工和基因表達(dá)調(diào)控等方面起著重要作用：1）gRNA（引導(dǎo)RN