環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨鈣及骨羥肱氨酸的影響

環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨鈣及骨羥肱氨酸的影響

氨基丙烯酸酯是一種烷化劑。由于其明顯的抗癌和免疫抑制作用，它被廣泛用于各種腫瘤和變形病。文獻(xiàn)報(bào)道某些腫瘤病人在使用環(huán)磷酰胺等化療藥后引起迅速骨丟失;我們?cè)谇捌诘念A(yù)試中也發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺有顯著地減少小鼠骨鈣和骨量的作用。為了觀察不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨代謝的影響,并探討用環(huán)磷酰胺建立大鼠骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型。為研究和篩選抗骨質(zhì)疏松藥建立新的實(shí)驗(yàn)方法。我們進(jìn)行了下述研究。1材料和方法1.1藥物和試劑1.1.1動(dòng)物大劑量和中劑量的計(jì)算(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司,批號(hào)為:00010901按成年人每天用量為50mg,用體表面積法計(jì)算出大鼠用量相當(dāng)于4.5mg·kg-1,據(jù)此,本研究把低于此劑量3倍的劑量(1.5mg·kg-1)作為低劑量組,高于此劑量約3倍的劑量(12.5mg·kg-1)作為高劑量組,而把4.5mg·kg-1作為中劑量組進(jìn)行研究。1.1.2對(duì)二甲替氨基苯甲醛氯胺T(中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司,批號(hào)為F990320);對(duì)二甲替氨基苯甲醛(廣州化學(xué)試劑廠,批號(hào)為971101);其余均為國產(chǎn)分析試劑。1.2紫外光柵分光光度計(jì)WFX-1D原子吸收分光光度計(jì)(北京第二光學(xué)儀器廠生產(chǎn));752紫外光柵分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠生產(chǎn));梅特勒-托利多AE240電子天平(梅特勒-托利多公司生產(chǎn))。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1環(huán)磷酰胺1次溶劑組b組3月齡♂Sprague-Dawley(SD)大白鼠32只,體重(270±37)g,廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,普通級(jí)。按體重對(duì)等原則隨機(jī)分為4組:A組:正常對(duì)照組;L組:環(huán)磷酰胺低劑量組;M組:環(huán)磷酰胺中劑量組;H組:環(huán)磷酰胺高劑量組。每組8只。正常對(duì)照A組每天灌胃給予生理鹽水10ml·kg-1;環(huán)磷酰胺L組每天灌胃給予環(huán)磷酰胺1.5mg·kg-1;環(huán)磷酰胺M組每天灌胃給予環(huán)磷酰胺4.5mg·kg-1;環(huán)磷酰胺H組每天灌胃給予環(huán)磷酰胺12.5mg·kg-1。四組動(dòng)物均自由飲水和進(jìn)食標(biāo)準(zhǔn)飼料。于實(shí)驗(yàn)d15處死動(dòng)物,測(cè)定體重并取血白細(xì)胞、胸腺、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸和右側(cè)肱骨供測(cè)定用。1.3.2骨有機(jī)質(zhì)的測(cè)定胸腺、肝、脾、腎、腎上腺、睪丸用AE240電子天平稱重。肱骨解剖除凈骨上附著的軟組織后80℃烘干至恒重,用AE240電子天平稱重;然后,每份骨樣本加6NHCl在108℃溫度下消化16h后,把消化液分成兩份。一份稀釋后用原子吸收光譜法測(cè)定骨鈣含量,與骨干重進(jìn)行比較,用骨鈣總量(mg)/骨干重(mg)的比值來作為骨礦物質(zhì)含量的指標(biāo),骨鈣量/骨干重的比值越大,說明骨礦物質(zhì)在骨中所占的比例越大。另一份消化液過濾后調(diào)pH值至6,然后,參考文獻(xiàn)測(cè)定羥脯氨酸吸光度,在標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出其含量。由于骨有機(jī)質(zhì)中骨膠原占90%以上;骨膠原中羥脯氨酸含量比較穩(wěn)定,約占12.5%。因此,根據(jù)骨羥脯氨酸的含量可推算出骨有機(jī)質(zhì)的相對(duì)含量。即骨有機(jī)質(zhì)=骨羥脯氨酸/0.125/0.90。用骨有機(jī)質(zhì)/骨干重的比值作為骨有機(jī)質(zhì)含量的指標(biāo)。其比值越大,說明骨有機(jī)質(zhì)含量越高。1.3.3統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果用xˉ±sxˉ±s表示,計(jì)量資料用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。2結(jié)果2.1對(duì)大鼠體重、環(huán)磷酰胺和紅細(xì)胞計(jì)數(shù)的影響給予不同劑量的環(huán)磷酰胺15d后,大鼠體重及血白細(xì)胞的變化結(jié)果見表1。從表1可見,給予低劑量和中劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較,體重有下降的趨勢(shì)(P>0.05),但給予高劑量組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較,體重下降了11.7%(P<0.05),低劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較白細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無顯著性;中劑量和高劑量環(huán)磷酰胺組大鼠與對(duì)照組大鼠比較白細(xì)胞計(jì)數(shù)均降低(P<0.01);提示本實(shí)驗(yàn)低劑量對(duì)白細(xì)胞無明顯影響,而中劑量和高劑量的環(huán)磷酰胺可使大鼠白細(xì)胞明顯降低。2.2對(duì)大鼠肝重和脾重的影響不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠肝、脾、腎重量的變化結(jié)果見表2。從表2可見,給予低劑量和中劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較,肝重分別減輕了16.5%和19.8%(P<0.01),但大劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠肝重與對(duì)照組大鼠比較則沒有影響;低劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較脾重有下降的趨向,中劑量和大劑量環(huán)磷酰胺組大鼠的脾重則有減輕,分別降低了31.6%和33.1%(P<0.01);3種劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠的腎重沒有顯著影響。2.3對(duì)大鼠胸徑、臟器和臟器重/體重比值的影響不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠胸腺、腎上腺、睪丸重量的變化的影響結(jié)果見表3。從表3可見,給予不同劑量的環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較,胸腺重/體重的比值隨劑量增加而減少,中劑量組和高劑量組分別減少了53.2%和87.3%(P<0.01);腎上腺重/體重比值隨劑量增加而增加,低劑量組腎上腺重與對(duì)照組大鼠比較減少差異有顯著性;睪丸重/體重比值也有隨劑量增加而增加的趨勢(shì),但各劑量組與對(duì)照組大鼠比較,差異無顯著性。2.4對(duì)大鼠骨鈣總量和骨鈣/骨干重比值的影響不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨干重、骨鈣總量及骨鈣總量/骨干重比值的影響見表4。從表4可見,不同劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較,骨干重和骨干重/體重的比值無顯著差異,而3組不同劑量環(huán)磷酰胺組大鼠的骨鈣總量和骨鈣/骨干重比值均有明顯的下降,差異有顯著性(P<0.01),提示3組不同劑量環(huán)磷酰胺均可影響骨鈣代謝,造成使大鼠骨鈣丟失和骨鈣/骨干重比值下降。2.5環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨羥脯氨酸/骨干重比值和骨有機(jī)質(zhì)/骨干重比值的影響不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨羥脯氨酸及骨羥脯氨酸/骨干重比值的影響見表5。從表5可見,低劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較,骨羥脯氨酸增加了33%(P<0.01),骨羥脯氨酸/骨干重比值和骨有機(jī)質(zhì)/骨干重比值增加了26%(P<0.01);提示低劑量環(huán)磷酰胺可使大鼠骨羥脯氨酸和骨有機(jī)質(zhì)明顯增加。中劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較,骨羥脯氨酸減少了26%(P<0.01),骨羥脯氨酸/骨干重比值和骨有機(jī)質(zhì)/骨干重比值減少了26%(P<0.01);提示中劑量環(huán)磷酰胺可使大鼠骨羥脯氨酸和骨有機(jī)質(zhì)明顯減少。大劑量環(huán)磷酰胺組的大鼠與對(duì)照組大鼠比較,各項(xiàng)指標(biāo)均無明顯差異。3環(huán)磷酰胺的作用機(jī)制3.1中劑量環(huán)磷酰胺(4.5mg·kg-1)可致大鼠胸腺萎縮和骨質(zhì)疏松研究表明環(huán)磷酰胺按每天4.5mg·kg-1灌胃給予大鼠,共15d,可導(dǎo)致大鼠胸腺明顯萎縮;胸腺重量降低53.2%(P<0.01)。胸腺被認(rèn)為是重要的中樞免疫器官,其重量可反映免疫功能的高低;隨著免疫功能的降低或年齡的增長(zhǎng),胸腺會(huì)逐漸萎縮,因此,胸腺重量是衰老的一個(gè)重要的衡量指標(biāo)。研究表明中劑量環(huán)磷酰胺還對(duì)大鼠的肝重和脾重有明顯的降低作用,肝臟、脾臟和胸腺都屬于免疫器官,環(huán)磷酰胺對(duì)這些免疫器官的抑制作用,說明了該藥有抑制免疫和促進(jìn)衰老的作用。本研究發(fā)現(xiàn)該劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠的骨代謝有明顯的影響,實(shí)驗(yàn)大鼠4.5mg·kg-1按每天灌胃服用環(huán)磷酰胺,與對(duì)照組相比,骨鈣總量明顯減少,骨鈣/骨干重比值明顯降低,骨羥脯氨酸含量明顯減少,骨羥脯氨酸/骨干重比值明顯降低,提示了環(huán)磷酰胺有抑制骨鈣的沉積和骨膠原的形成作用。骨鈣是構(gòu)成骨礦物質(zhì)的重要成分,骨鈣減少是骨礦物質(zhì)減少的主要標(biāo)志;骨羥脯氨酸是骨膠原特有的氨基酸,骨膠原占骨有機(jī)質(zhì)的90%,因此,骨羥脯氨酸也是構(gòu)成骨有機(jī)質(zhì)的最主要的物質(zhì)。骨羥脯氨酸減少是骨基質(zhì)減少的主要標(biāo)志。目前認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥主要是指骨量減少,包括骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)等比例的減少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,環(huán)磷酰胺使骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)同時(shí)減少,故可以認(rèn)為該劑量的環(huán)磷酰胺可造成大鼠骨質(zhì)疏松,也就是說,用該劑量可造成大鼠骨礦物質(zhì)和骨基質(zhì)等比例的減少骨質(zhì)疏松模型,用于研究各種抗骨質(zhì)疏松藥物的作用和作用機(jī)制。該劑量的環(huán)磷酰胺致骨質(zhì)疏松的機(jī)制,根據(jù)環(huán)磷酰胺使骨羥脯氨酸的含量降低來推測(cè),由于骨羥脯氨酸是骨膠原的重要組成成分,主要由成骨細(xì)胞合成與分泌的,是骨合成的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。因此,環(huán)磷酰胺使骨膠原減少,說明了其可能對(duì)成骨細(xì)胞合成與分泌骨膠原產(chǎn)生抑制作用,使其合成和分泌膠原減少。骨的合成過程是先有骨基質(zhì)的分泌,再有鈣質(zhì)的沉積。該劑量的環(huán)磷酰胺使骨膠原減少可進(jìn)一步導(dǎo)致骨鈣沉積減少,并使骨量丟失。對(duì)此,我們將作進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。3.2高劑量的環(huán)磷酰胺(12.5mg·kg-1)對(duì)大鼠的藥理作用增強(qiáng),毒性也增加高劑量的環(huán)磷酰胺(12.5mg·kg-1)可使大鼠的體重明顯降低(P<0.05),血白細(xì)胞也顯著降低,免疫器官肝臟、脾臟和胸腺都受到明顯抑制;提示了環(huán)磷酰胺隨著劑量的增加,其藥理作用增強(qiáng),毒性也增加,特別是白細(xì)胞減少和胸腺萎縮明顯。文獻(xiàn)報(bào)道環(huán)磷酰胺劑量為20和70mg·kg-1時(shí),一次給藥可引起大鼠廣泛的胸腺細(xì)胞凋亡,本研究發(fā)現(xiàn)高劑量的環(huán)磷酰胺(12.5mg·kg-1)連用15天也可使部分胸腺細(xì)胞凋亡,8例中有5例胸腺重量為0;大鼠胸腺對(duì)環(huán)磷酰胺的敏感性值得注意,臨床化療應(yīng)用相當(dāng)此劑量(如150～200mg·次-1)時(shí),應(yīng)注意對(duì)胸腺,T細(xì)胞及其他等免疫器官的影響。本研究還發(fā)現(xiàn)該劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠的骨代謝與中劑量有所不同,可使骨鈣總量減少,骨鈣/骨干重比值明顯降低,但骨羥脯氨酸含量沒有變化,其意義有待進(jìn)一步闡明。3.3低劑量的環(huán)磷酰胺(1.5mg·kg-1)可使大鼠胸腺增重,骨鈣丟失但骨羥脯氨酸增高低劑量的環(huán)磷酰胺(1.5mg·kg-1)對(duì)大鼠體重、白細(xì)胞、重要器官?zèng)]有明顯影響,但可使大鼠的胸腺增重,胸腺增重提示了該劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠的免疫功能可能促進(jìn)作用,不同劑量環(huán)磷酰胺對(duì)胸腺的不同影響值得注意,對(duì)其的深入探討可能會(huì)發(fā)現(xiàn)免疫藥理學(xué)方面的一些較為重要的問題。低劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨代謝來說,可使骨鈣總量減少和骨鈣/骨干重比值明顯降低,但骨羥脯氨酸含量增加和骨羥脯氨酸/骨干重比值增加,提示了該劑量的環(huán)磷酰胺可能促進(jìn)骨膠原的合成,這與其增加胸腺重量可能有一定的內(nèi)在聯(lián)系。低劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨藥理作用在防治骨質(zhì)疏松方面的意義有待進(jìn)一步闡明。4環(huán)磷酰胺和環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠骨生理指標(biāo)的影響研究表明不同劑量的環(huán)磷酰胺對(duì)大鼠體重、血白細(xì)胞、重要的免疫器官等有量效關(guān)系,隨著環(huán)磷酰胺的劑量增加而藥理作用增強(qiáng),