嚴(yán)重創(chuàng)傷后早期下丘腦cfos與crh1r的變化

嚴(yán)重創(chuàng)傷后早期下丘腦cfos與crh1r的變化

雖然已對(duì)嚴(yán)重傷口后的應(yīng)激反應(yīng)（crh）的重要作用達(dá)成一致，但對(duì)引起重視的下肢crh受體的形成和調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。為此,本組以大鼠右肺中部重度創(chuàng)傷合并右股骨中段骨折為模型,探討嚴(yán)重創(chuàng)傷后大鼠下丘腦CRH1R與c-fos蛋白表達(dá)變化,為創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)的進(jìn)一步研究和防治提供參考。材料和方法1實(shí)驗(yàn)和撞擊大鼠右腦并病選成年(4個(gè)月)Wistar雄性大鼠,體重(240±10)g。隨機(jī)分組,大鼠分籠飼養(yǎng)(3只/籠)于設(shè)定溫度和定時(shí)光照(光照8:00~20:00)的房間,食物和水可自由攝取。飼養(yǎng)1周后,實(shí)驗(yàn)均在10:00~12:00開始。用質(zhì)量濃度為30g/L戊巴比妥鈉腹腔注射(20mg/kg),BIM-Ⅲ型生物撞擊機(jī)撞擊大鼠右胸第四肋,計(jì)算機(jī)調(diào)節(jié)高壓氣艙壓力為500kPa,動(dòng)物右胸部距彈道出口1cm,撞擊后立即用臺(tái)鉗折斷右側(cè)股骨中段。參照人多發(fā)傷標(biāo)準(zhǔn),此傷情為重度多發(fā)傷。分別在撞擊前,撞擊后15、30分鐘、1、2、6和12小時(shí)致死動(dòng)物,在解剖顯微鏡下分離下丘腦(視交叉、乳頭體為前、后界,左右下丘腦溝為側(cè)界,深約1~1.5mm,除去腦膜及血凝塊),立即置液氮中保存。2織物的染色結(jié)果采用常規(guī)SABC法,取各時(shí)相點(diǎn)腦片采用漂浮法,顯色采用硫酸鎳胺增強(qiáng)染色,陽(yáng)性結(jié)果為紫藍(lán)色反應(yīng)物。對(duì)照實(shí)驗(yàn)用PBS代替一抗,結(jié)果為陰性。3蛋白濃度的測(cè)定提取大鼠下丘腦組織蛋白,并定量。自液氮中取出組織分裝于EP管中,每克組織加緩沖液1ml。-20℃凍存組織20分鐘后,以12000r/min,4℃離心20分鐘。上清液移至另一EP管(100μl/管)中,置100℃水中,6分鐘。于試管中加考馬斯亮藍(lán)染液3ml和蛋白上清液5μl,混勻后測(cè)定蛋白濃度。每EP管加等量加樣緩沖液(100μl),根據(jù)蛋白濃度計(jì)算所需上樣量(注:以上操作均在冰板上進(jìn)行)。聚丙烯酰胺變性凝膠分離蛋白(上樣量為40μg總蛋白),電轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上,封閉、加一抗(稀釋1:1000)、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(稀釋1:1000),化學(xué)發(fā)光試劑增強(qiáng)反應(yīng),X線膠片壓片曝光,凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果,設(shè)對(duì)照并重復(fù)3次。4統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,分別進(jìn)行t檢驗(yàn)和方差分析。crh1r在正常情況下表達(dá)情況免疫印跡(Westernbolt)結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析光密度值(Odu/mm2):下丘腦c-fos蛋白含量在正常對(duì)照組含量較低,在創(chuàng)傷后30分鐘即刻增加達(dá)高峰,隨即迅速下降,至12小時(shí)降至最低(圖1)。免疫組織化學(xué):在正常情況下有少量的CRH1R分布于下丘腦室旁核(PVN)的神經(jīng)元的胞漿,嚴(yán)重創(chuàng)傷后1小時(shí),下丘腦PVN、SON神經(jīng)元顯著著色深染(圖2)。Westernblot結(jié)果顯示,嚴(yán)重創(chuàng)傷1小時(shí)后,CRH1R表達(dá)明顯增加,創(chuàng)傷后6小時(shí)開始回落,創(chuàng)傷1小時(shí)后各組與對(duì)照組比較差異非常顯著;CP-154526可明顯抑制創(chuàng)傷后下丘腦神經(jīng)元CRH1R蛋白表達(dá)增加,創(chuàng)傷1小時(shí)后各組與對(duì)照組比較差異非常顯著(圖3)。c-fos與crh1r表達(dá)的關(guān)系CRH是一種含41個(gè)氨基酸的肽,與機(jī)體的內(nèi)分泌、生理機(jī)能、神經(jīng)化學(xué)和行為反應(yīng)密切相關(guān)。雖然CRH廣泛表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),但在急性應(yīng)激后僅在下丘腦表現(xiàn)CRH轉(zhuǎn)錄活性增加。急性應(yīng)激引起杏仁核(CeA)和室旁核(PVN)的CRHmRNA增加。c-fos屬于早期快速激活反應(yīng)基因,c-fos可作為細(xì)胞代謝水平的標(biāo)志,可激活神經(jīng)元,c-fosmRNA編碼核蛋白fos,而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄,認(rèn)為c-fos在神經(jīng)元功能持續(xù)激活中起重要作用。c-fos的表達(dá)和目的基因是否有直接的因果關(guān)系依賴于在基因的激活區(qū)是否都有一功能一致的序列。神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子、鋇、鉀引起培養(yǎng)細(xì)胞去極化都可快速誘導(dǎo)c-fos表達(dá),而在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,如出血、高滲鈉注射后,c-fos表達(dá)也表現(xiàn)為迅速地增加及隨后快速地回落,推測(cè)可能是由于c-fos表達(dá)的增加對(duì)其自身的基因表達(dá)有抑制作用,因此,c-fos的誘導(dǎo)作用是快速和短暫的。新近的研究表明,在調(diào)節(jié)CRH基因表達(dá)的促進(jìn)劑中,存在幾種AP-1序列,而Fos/Jun結(jié)合和調(diào)節(jié)這些基因。實(shí)際上,應(yīng)激后許多其它編碼基因的表達(dá),如酶、受體或其它蛋白等可能也受c-fos的調(diào)節(jié)。以往的實(shí)驗(yàn)表明,在腦室內(nèi)注射CRH后c-fos陽(yáng)性表達(dá)可激活神經(jīng)細(xì)胞,在下丘腦選擇性的上調(diào)CRH基因的表達(dá)。在創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)中,CRH在協(xié)調(diào)內(nèi)分泌、生理機(jī)能和行為反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。雖然在創(chuàng)傷后應(yīng)激反應(yīng)中下丘腦CRH表達(dá)明顯增加,但對(duì)創(chuàng)傷后下丘腦c-fos和CRH1R表達(dá)之間的相互關(guān)系知之甚少。因此,本研究探討了創(chuàng)傷后下丘腦c-fos與CRH1R表達(dá)及變化關(guān)系。在本實(shí)驗(yàn)中Westernblot結(jié)果顯示,大鼠嚴(yán)重創(chuàng)傷應(yīng)激后立即引起下丘腦組織內(nèi)c-fos蛋白表達(dá)增加,傷后30分鐘達(dá)高峰,以后逐漸下降。對(duì)照組,在下丘腦PVN有一定量的CRH1R表達(dá),可檢測(cè)到少量和散在的CRH1R,說明在生理情況下下丘腦具有一定的神經(jīng)內(nèi)分泌功能。免疫應(yīng)激或束縛應(yīng)激可引起下丘腦僅在室旁核CRH1RmRNA大量表達(dá)。嚴(yán)重創(chuàng)傷后,下丘腦PVN表達(dá)CRH1R的神經(jīng)細(xì)胞明顯增多,且染色加深,CRH1R蛋白含量在創(chuàng)傷后1小時(shí)逐漸增多,但于6小時(shí)開始回落。而預(yù)先用CRH1R拮抗劑CP-154526處理的大鼠,可明顯減少創(chuàng)傷應(yīng)激引起下丘腦CRH1R含量的增加。此實(shí)驗(yàn)提供了c-fos和CRH1R含量變化的時(shí)間過程,說明創(chuàng)傷應(yīng)激反應(yīng)中下丘腦早期表達(dá)的c-fos可能起激活CRH基因表達(dá)的作用。提示在創(chuàng)傷性應(yīng)激反應(yīng)中,CRH1R在下丘腦PVN神經(jīng)元的激活中起重要的介導(dǎo)作用,同時(shí)也說明CRH可直接調(diào)控CRH神經(jīng)元的活性。而隨后出現(xiàn)的CRH1R表達(dá)回落,可能是由于機(jī)體(如糖皮質(zhì)激素等)對(duì)下丘腦室旁核的負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到,大鼠嚴(yán)重創(chuàng)傷后,CP-154526可明顯抑制下丘腦室旁核CRH1R表達(dá)的增加,但在在體給予CP-154526處理后,不僅抑制了下丘腦的CRH1R的表達(dá),而且同時(shí)也抑制了下丘腦以外的可表達(dá)CRH1R的神經(jīng)元。因此,即使我們知道下丘腦神經(jīng)元之間有軸突聯(lián)系,在下丘腦室旁核注入外源性CRH可激活下