催乳素釋放多肽的原核表達及細胞免疫組化

催乳素釋放多肽的原核表達及細胞免疫組化

產(chǎn)乳酶的釋放是牛奶中的一種親水活性物質。RF多肽在C端含有Arg-Phe-NH2的共同結構,于1977年首先在無脊椎動物中發(fā)現(xiàn),隨后很多的無脊椎動物RF肽被發(fā)現(xiàn)和確定,它們具有很多的生物活性。然而,有關脊椎動物RF肽的研究非常有限,最近幾年只有少量的脊椎動物RF肽被確定。最近研究的熱點是從兩棲動物腦中分離的2個RF肽:RanaRFamide(R-RFa)和26RFa。至今確定的哺乳動物RF多肽包括神經(jīng)肽FF(NPFF)、神經(jīng)肽AF(NPAF)、PrRP、RF多肽相關多肽(PFRPs)等。NPFF和NPAF是1985年首先報道的2個哺乳類RF多肽。然而很多年后,再沒有新的哺乳類RF多肽的報道。直到1998年,HinumaS等分離得到了編碼人G蛋白耦聯(lián)受體(hGR3或UHR1或GPR10)的互補DNA,hGR3受體只在人垂體特異性表達。進一步研究發(fā)現(xiàn),在牛下丘腦存在hGR3受體的配體,是一種與其他已知多肽和蛋白沒有相似序列的多肽,它能夠有效地促進大鼠垂體前葉細胞釋放催乳素,于是被命名為催乳素釋放多肽(PrRP)。PrRP基因在1998年首先克隆,由cDNA編碼的前催乳素釋放肽原至少能衍生2種PrRP異構體:PrRP31和PrRP20。1prrp在神經(jīng)纖維分布的研究細胞免疫化學方法顯示在大鼠下丘腦室旁核、視上核、丘腦帶旁核、杏仁基底外側核、終紋床核都有高密度的PrRP免疫反應性神經(jīng)纖維網(wǎng)的存在,同時在神經(jīng)垂體中也含有少量的PrRP神經(jīng)纖維。然而,PrRP不同于其它的下丘腦釋放激素,在正中隆起的外部區(qū)域,即釋放經(jīng)典下丘腦激素的部位,并沒有發(fā)現(xiàn)PrRP免疫反應性細胞。PrRP免疫反應性細胞大多分布于下丘腦背內側核和孤束核的尾部,同時PrRP能神經(jīng)元體及末梢在前腦和腦干中分布較廣。YanoT等運用原位雜交和免疫組化技術探討了不同發(fā)育時期大鼠腦中PrRP的表達,發(fā)現(xiàn)PrRP神經(jīng)纖維起源于延髓,在大鼠的早期發(fā)育中,在腦中分布較廣泛。發(fā)育18d的胎兒孤束核(NTS)中開始有PrRPmRNA的表達。發(fā)育20d的胎兒在延髓尾部網(wǎng)狀核的側部和腹部有PrRPmRNA的表達。出生后13d,下丘腦開始有PrRPmRNA的表達。運用RT-PCR技術,從發(fā)育18d胎兒的延髓和出生后13d幼鼠的下丘腦中檢出PCR的產(chǎn)物,是一條268bp的鏈。用抗PrRP前提物的單克隆抗體免疫檢測發(fā)現(xiàn)在發(fā)育18d胎兒孤束核、發(fā)育20d胎兒網(wǎng)狀核的腹側部、出生后13d的下丘腦背內側核部位中檢測到了染色較深的細胞。利用抗成熟PrRP的單克隆抗體,同時利用免疫組化方法,檢測了出生后6d的大鼠PrRP在神經(jīng)纖維腦中的分布。PrRP神經(jīng)纖維分布在下丘腦室旁核、下丘腦室周核、視前內側核、杏仁體基底外側部、下丘腦背內側核、下丘腦腹內側核、丘腦室周核和終紋床核,這和成年大鼠中的分布類似。出生6和9d,視交叉中部、網(wǎng)狀核腹側尾部也有PrRP神經(jīng)纖維的存在,而成年鼠中上述部位卻沒有分布。MaruyamaM等研究發(fā)現(xiàn)動情周期活動并不影響大鼠PrRP的分布。綿羊PrRP和大鼠PrRP一樣在腦干中的表達比在下丘腦中的表達豐富。然而,在綿羊的下丘腦中PrRPmRNA的表達比大鼠下丘腦中的表達更加廣泛,主要在下丘腦正中基底的尾部和腹邊緣部有PrRP的表達。2prrp受體mrna的轉錄表達PrRP受體含有7個跨膜域的G蛋白耦聯(lián)受體。IbataY等利用運用定量RT-PCR發(fā)現(xiàn)了PrRP受體。進一步利用原位分子雜交和組化技術發(fā)現(xiàn)在大鼠垂體前葉、居間小葉和腦中的許多地方有PrRP受體mRNA的表達,但在垂體后葉中并沒有發(fā)現(xiàn)此受體的表達。PrRP及其受體的表達并不完全一致。下丘腦中的很多地方都有PrRP受體的轉錄,但PrRPmRNA的表達局限于下丘腦的背內側核腹部,在下丘腦神經(jīng)內分泌核區(qū)并沒有發(fā)現(xiàn)PrRPmRNA的表達。同時在丘腦網(wǎng)狀核PrRP受體mRNA表達強烈,但卻沒有PrRP神經(jīng)元體和末梢的分布。原位雜交組化和Northern印跡分析表明,雌性大鼠中的PrRP受體轉錄表達水平高于雄性大鼠,但泌乳大鼠和非泌乳大鼠之間沒有顯著差異。SatohF等報道大鼠PrRP結合位點存在于腦(下丘腦、延髓、小腦)、垂體、心臟、比目魚肌脂肪組織、腎、腎上腺、睪丸、小腸組織細胞膜上面。競爭結合試驗表明:在下丘腦、垂體、心臟、比目魚肌中結合位點各自具有自己的特異性。在大鼠的心肌和骨骼肌組織中可能含有不同于UHR-1的其他PrRP受體。3神經(jīng)肽對prrp表達的影響大鼠垂體前葉細胞對PrRP的親和性受生理機制的調控。不同生育時期雌性大鼠的垂體前葉細胞對PrRP的敏感性不同,其中采自泌乳大鼠的垂體細胞,相比于妊娠和其他任意時期的垂體細胞,對PrRP的親和性最大。它反映了不同的生育時期,垂體前葉細胞的活動情況不一樣,其中可能是PrRP受體mRNA的表達水平不一樣。此外,雌激素處理雄性大鼠,能使其垂體細胞對PrRP的親和性增加。性別差異研究方面表明:雌性大鼠,特別是發(fā)情前期的雌性大鼠比雄性大鼠對PrRP更敏感。RF肽在對NPFF受體的結合上有相對較低的分辨性,人PrRP31和NPFF2神經(jīng)肽受體亞型2結合后,其作用顯著高于NPFF和它的類似物,從而人PrRP可能通過NPFF受體進行信號傳導。而NPFF和它的類似物對人PrRP受體無效。4ri的生物學效果4.1prrp對大鼠血漿中prl的影響PrRP和TRH一樣能促進離體培養(yǎng)的雌性大鼠垂體細胞prl的分泌,并且PrRP的作用比較專一。但在不同生育時期,雌性大鼠的垂體前葉細胞對PrRP的敏感性不同,其中泌乳大鼠的垂體細胞,與妊娠期和其他時期大鼠的垂體細胞相比,對PrRP的敏感性最大。10、100nmolPrRP可以促進成年雄性大鼠垂體細胞培養(yǎng)物prl的分泌,并呈劑量依賴性關系,而0.1和1nmolPrRP則抑制prl的分泌。其促進和抑制效果受其他激素的影響。地塞米松降低促進效應的最高峰,雌激素和T3既強烈地降低其抑制效應,也降低其促進效應。同時即使1nmolPrRP也能抵消多巴胺抑制prl釋放的效應。而SamsonWK等研究發(fā)現(xiàn),體外培養(yǎng)雄性大鼠垂體細胞試驗表明,PrRP及其類似物pfrp-1都不能顯著影響PRL的釋放。PrRP也不能促進高牛垂體前葉培養(yǎng)細胞中的prl的釋放。RubinekT等報道,人PrRP-31能促進人胎兒初級垂體培養(yǎng)物prl的分泌,并呈劑量依賴關系,當達到10nmol的PrRP時,prl的分泌提高到最大值35%。雌激素孵育能增強其促進prl釋放的效果。PrRP雖然不能促進prl腺瘤細胞分泌prl,但能促進gh細胞腺瘤分泌prl。PrRP在體內特定的生理環(huán)境中起著重要的調節(jié)prl分泌的作用。PrRP促進prl的效果主要受性別和發(fā)情周期的影響,表明PrRP敏感性受機體內內源性激素水平的影響,特別是雌激素水平的影響。雌性大鼠,尤其是發(fā)情前期的雌性大鼠比雄性大鼠對PrRP更敏感。腦室灌流0.1nmolPrRP,可提高大鼠血漿中PRL的水平。IV注射1、10mgPrRP能使雌激素處理的卵巢切除大鼠prl的分泌增加。提前IV注射1mg多巴胺D2受體的抑制劑(sulpiride),能加強PrRP促進prl分泌的作用。ICV0.1～1000ngPrRP在15min內能促進漏斗柄中多巴胺能神經(jīng)元的活動,血清中prl的水平并沒有顯著變化。靜脈注射PrRP31能提高大鼠血漿中prl的水平,呈劑量依賴性關系。靜脈注射50nmol/kgPrRP31后,25min內能顯著提高發(fā)情前期、發(fā)情期及發(fā)情后期雌性大鼠血漿中prl的水平(P<0.05);但對于雄性大鼠,只有PrRP31的注射濃度達到500nmol/kg時,才能促進血漿中prl顯著提高。PrRP31并不影響其他垂體激素的分泌,表現(xiàn)出了專一促進prl分泌的特性。ICV3nmolPrRP31,能使禁食3d的雌激素和孕激素預處理的去卵巢大鼠prl的分泌波得到恢復。腦室注射抗大鼠PrRP31血清,可使prl分泌波顯著下降,同時延遲了prl波的發(fā)生。但有些在體試驗表明,PrRP對prl的釋放沒有明顯作用。CurlewisJD等研究發(fā)現(xiàn)PrRP不能促進雄性大鼠和泌乳大鼠中催乳素的分泌,也不影響及其他垂體激素的釋放。ICV1.0和3.0nmolPrRP-31或RFRP-1時,3nmolRFRP-1而不是PrRP-31可以顯著提高清醒雄性大鼠prl的釋放。靜脈注射1mgPRRP不能促進雌激素誘導prl釋放的作用。靜脈注射3.59μg/kg·BWPrRP不能促進牛prl的分泌,血漿中prl的變化不大,而注射TRH和牛垂體后葉提取物后,血漿中prl立即升高。PrRP對下丘腦-垂體-性腺軸有一定的調節(jié)作用,可通過調節(jié)下丘腦中的lhrh等來影響腺垂體中促性腺激素的釋放。離體試驗表明,PrRP并不能直接促進雄性大鼠垂體細胞分泌LH、FSH的釋放,但能顯著促進下丘腦外植體lhrh的釋放(p<0.05)。腦室注射(Intracerebroventricular,ICV)5nmolPrRP,10min后,與注射生理鹽水組相比,血漿中LH的水平極顯著升高(p<0.001),并持續(xù)50min。注射20min后,血漿中的FSH水平極顯著升高(p<0.01)。注射60min后,血漿中總的睪酮水平顯著升高。PrRP可能通過激活下丘腦中視前區(qū)中部GnRH能神經(jīng)元從而參與調節(jié)類固醇類激素誘導的LH的分泌,從而可能參與排卵前期LH的分泌。3nmolPrRP31能使雌激素和孕激素進行預處理的去卵巢大鼠,禁食3d后LH的基礎分泌短時間內得以提高。PrRP神經(jīng)元和下丘腦中CRH能神經(jīng)元有類似突觸的聯(lián)系,可以通過影響下丘腦而非垂體前葉促進應激激素的分泌。PrRP通過促進下丘腦室旁核中神經(jīng)肽的釋放,如CRH、神經(jīng)肽Y等來提高血漿中ACTH水平。ICV注射PrRP可以提高血漿中ACTH的水平,同時引起下丘腦室旁核中c-fos的表達。ICV注射5nmolPrRP,10min后血漿中的ACTH含量比注射生理鹽水組的顯著升高。室旁核直接注射1nmolPrRP,5min后血漿中的ACTH含量顯著升高。離體試驗中,1～100nmol/LPrRP并不影響垂體前葉細胞ACTH的基礎分泌和CRH誘導的釋放。100nmol/LPrRP可顯著提高下丘腦中CRH的釋放,但不影響抗利尿素的釋放。同時顯著提高神經(jīng)肽Y的釋放;而在奔跑應激(Runningstress)中,PrRP能神經(jīng)元隨著運動強度的增大而活動增強,其產(chǎn)生的內源性PrRP可以減弱ACTH的釋放和血漿中乳酸鹽的蓄積,并呈劑量依賴性關系;ICV1.0和3.0nmolPrRP-31時,均不能顯著提高清醒雄性大鼠血清中ACTH的水平。IVCRH的拮抗劑,并不阻斷PrRP-31的作用,但是提前IVCRH的抗血清可顯著降低下丘腦-垂體-腎上腺軸對PrRP-31的反應。進一步的研究發(fā)現(xiàn)PrRP參與了應激信號的傳導,并和NA一起協(xié)同提高血漿中ACTH的水平,從而調節(jié)下丘腦-垂體-腎上腺軸。下丘腦背內側核和一些A1/A2神經(jīng)元可以產(chǎn)生PrRP。A1/A2細胞群中的PrRP神經(jīng)元含有酪氨酸羥化酶,而此酶是含有兒茶酚胺的神經(jīng)元的一種標志性酶。A1/A2去甲腎上腺素能神經(jīng)元在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能調節(jié)應激反應,壓力刺激A1/A2去甲腎上腺素能神經(jīng)元產(chǎn)生NA,NA通過下丘腦CRH促進ACTH的釋放。A2PrRP神經(jīng)元中有雌激素α受體的表達,從而其調節(jié)應激的反應受雌激素的影響。雌激素能抑制應激條件下PrRP神經(jīng)元的激活。水沉浸大鼠可導致A1/A2和下丘腦背內側核PrRP神經(jīng)元中c-Fos蛋白蓄積量大量升高。在A1/A2細胞群中的PrRP、酪氨酸羥化酶雙陽性細胞中有c-Fos蛋白特異性地表達。ICVPrRP30min后,大鼠下丘腦室旁核中c-fosmRNA的得到最大表達,并呈劑量依賴性關系,同時血漿中皮質酮激素的水平顯著升高。ICV抗PrRP抗體能顯著降低疼痛刺激引起的室旁核c-fosmRNA的表達。電子顯微鏡顯示室旁核PrRP免疫反應性神經(jīng)纖維末梢和其它非PrRP免疫反應性神經(jīng)元有突觸聯(lián)系,一部分神經(jīng)纖維和末梢位于釋放抑制素(SOM)的神經(jīng)元附近。腦室灌流PrRP可迅速使抑制素能神經(jīng)元中NGFI-A基因的轉錄。雙層標記原位雜交技術顯示SOM能神經(jīng)元能表達PrRP受體mRNA。因此,室旁核中部分SOM能神經(jīng)元受PrRP的直接控制。腦室灌流PrRP可引起血漿中GH水平的下降,但當SOM被耗竭或者中和后,其降低作用消失。其機理可能是PrRP旁分泌的形式作用于SOM能神經(jīng)元,使其釋放SOM到垂體門脈中,從而抑制垂體前葉GH的釋放。而體外試驗的結果與上述結果并不一致,RubinekT等發(fā)現(xiàn)PrRP能刺激幾種生長激素細胞分泌GH。在雌激素存在的情況下,人PrRP-31能促進發(fā)育20～27周的人胎兒初級垂體培養(yǎng)物GH的分泌增加。PrRP也能提高幾種腺瘤細胞GH的釋放,使其分泌量增加25%～27%,同時促進gh、prl混合腫瘤細胞GH的分泌。而另一方面有研究報道PrRP對成年雄性大鼠垂體細胞培養(yǎng)物GH的釋放沒有影響。PrRP可能是調節(jié)催產(chǎn)素的一種神經(jīng)調節(jié)因子。雙層細胞免疫化學試驗表明在下丘腦室旁核、視上核中PrRP陽性神經(jīng)元和催產(chǎn)素陽性神經(jīng)元有突觸聯(lián)系。ICVPrRP能提高雌性大鼠、雄性大鼠血漿中催產(chǎn)素的水平,同時提高雌性大鼠血漿中抗利尿素的水平。大鼠腦室灌輸0.1nmolPrRP可促進REM睡眠,1nmol劑量時可同時促進非REM和REM睡眠,10nmol劑量時只能促進非REM睡