銀杏葉復(fù)方對(duì)大鼠腦神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的影響

銀杏葉復(fù)方對(duì)大鼠腦神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體表達(dá)的影響

干預(yù)大腦的缺血性（ciri）可能會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的精神障礙。目前，許多中藥劑的研究用于治療銀杏葉、黃鼠尾、丹參、葛根素、紅花等mi科。然而，關(guān)于中藥的藥物研究很少。神經(jīng)生長(zhǎng)因子是一種最早發(fā)現(xiàn)并已得到深入研究的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子,它可通過(guò)不同途徑來(lái)保護(hù)缺血再灌注損傷的神經(jīng)元,并已得到證實(shí)。本研究設(shè)計(jì)把下丘腦視上核、室旁核表達(dá)的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NG-FR)作為觀察指標(biāo),研究銀杏葉復(fù)方對(duì)CIRI大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用,揭示該中藥復(fù)方可能的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,為銀杏葉復(fù)方治療CIRI提供理論依據(jù)。1材料和方法1.1動(dòng)物飼料動(dòng)物中心成年健康Sprage-Dawley大鼠21只,雌雄不拘,體重(250±50)g,購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心。喂以平衡飼料,自由進(jìn)水。隨機(jī)分為假手術(shù)組(sham組)7只,腦缺血再灌注損傷組(I/R組)7只和銀杏葉復(fù)方治療組(GBE組)7只。1.2皮膚保水性動(dòng)物模型采用pulsinelli四血管(4VO)法建立急性全腦缺血再灌注損傷(globalcerebralischemiareperfusioninjury,GCIRI)動(dòng)物模型。用2%戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔注射麻醉,切開大鼠頸部背側(cè)皮膚,暴露第一頸椎雙側(cè)翼小孔,電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈,局部縫合皮膚;改仰臥,頸正中切口切開皮膚,游離雙側(cè)頸總動(dòng)脈后鉗閉10min,造成彌漫性全腦缺血,30min后去除動(dòng)脈夾使其再灌注60min,縫合皮膚。Sham組除不電凝雙側(cè)椎動(dòng)脈和夾閉頸總動(dòng)脈外,余操作同I/R組和GBE組。成模標(biāo)準(zhǔn):造模后24h,鉗閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈,動(dòng)物昏迷并雙側(cè)虹膜變白。符合上述標(biāo)準(zhǔn)者入選,否則剔除。1.3藥物、藥品、制劑銀杏葉復(fù)方由銀杏30g,紅花12g,黃芪15g,當(dāng)歸12g,桃仁12g,丹參30g,葛根15g,甘草10g,法半夏12g,川芎9g組成。該藥購(gòu)自浙江省中醫(yī)院中藥房,加水300mL,煎成每毫升含4g生藥的制劑備用。NGFR免疫組化染色試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。1.4給藥方法GBE組大鼠從造模前1月至成模后1周,按4g/kg銀杏葉復(fù)方生藥劑量每日灌胃給藥,sham組和I/R組灌服等量生理鹽水。1.5大、大鼠腦冠狀面反復(fù)電泳組化動(dòng)物成模后1周,2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉,開胸暴露心臟,自左心室插管到主動(dòng)脈快速灌注生理鹽水沖洗,剪開右心耳,至血色清淡,然后用4%多聚甲醛(PBS)500～1000mL灌注約30min,先快后慢。斷頭取腦,標(biāo)本置入30%PBS溶液中,固定至腦下沉后,行冰凍切片。參照包新民大鼠腦立體定位圖譜選取大鼠下丘腦B-0.8～-5.2段進(jìn)行腦冠狀面連續(xù)冰凍切片,片厚20μm,每隔4片取1片,每例選相鄰切片6張,共取5套切片,按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行NGFR免疫組化染色。陰性對(duì)照組用PBS磷酸鹽緩沖液代替一抗。1.6細(xì)胞密度和腦片密度的測(cè)定電鏡下分別觀察3組動(dòng)物在視束外側(cè)區(qū)下丘腦視上核和穹隆與第三腦室間的下丘腦室旁核內(nèi)的NGFR陽(yáng)性細(xì)胞,并對(duì)每例每套腦切片的下丘腦區(qū)視上核和室旁核在200μm×200μm的方格測(cè)微尺內(nèi)計(jì)數(shù)在方格內(nèi)形態(tài)清楚的NGFR陽(yáng)性細(xì)胞數(shù),并以單位面積內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)算細(xì)胞密度值。1.7統(tǒng)計(jì)處理使用SPSS11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所得數(shù)據(jù)以均數(shù)表示,組間差別比較采用t檢驗(yàn),以P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2組fr陽(yáng)性細(xì)胞密度的比較NGFR陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài):NGFR陽(yáng)性細(xì)胞為胞漿內(nèi)含棕色顆粒的細(xì)胞,細(xì)胞為橢圓形和梭形,胞體、神經(jīng)纖維及纖維終末均可染色。NGFR陽(yáng)性細(xì)胞的密度:在GBE組,下丘腦視上核與室旁核的NGFR陽(yáng)性細(xì)胞密度最大,I/R組次之,sham組最少,有關(guān)3組NGFR細(xì)胞密度的對(duì)比詳見(jiàn)圖1～4。Sham組與I/R組視上核、室旁核NGFR陽(yáng)性細(xì)胞密度差異有顯著性(P<0.05);Sham組與GBE組NGFR密度差異有高度顯著性(P<0.01);I/R組和GBE組NGFR密度差異有高度顯著性(P<0.01),詳見(jiàn)表1。3外源性藥物治療cii的理論依據(jù)神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nervegrowthfactor,NGF)是發(fā)現(xiàn)最早、最典型、研究最多的一種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。而神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體(NGFR)有兩種類型,一種是低親和力受體(LNG-FR,p75),其不起介導(dǎo)信號(hào)作用,只對(duì)信號(hào)傳遞起協(xié)同作用;另一種是高親和力受體(HNGFR,p140),包括TrkA、TrkB、TrkC,TrkA是NGF的功能受體。NGF只有與TrkA結(jié)合并在p75的協(xié)同作用下才能發(fā)揮正常的生物學(xué)效應(yīng)。NGFR在軸突的生長(zhǎng)和細(xì)胞的存活方面起著非常重要的作用,并能促進(jìn)損傷后神經(jīng)元再生。腦缺血再灌注損傷后“級(jí)聯(lián)反應(yīng)”產(chǎn)生的各種病理毒素,通過(guò)激活內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制,NGFR效應(yīng)神經(jīng)元表達(dá)NGFR增加而產(chǎn)生抗缺血損傷作用。但內(nèi)源性NGFR表達(dá)時(shí)程很短,表達(dá)水平有限,難以對(duì)受損神經(jīng)元起到全面而持久的保護(hù)作用,腦細(xì)胞最終會(huì)死亡。這點(diǎn)在本實(shí)驗(yàn)中也得到證實(shí),I/R組大鼠的下丘腦視上核/室旁核的NGFR表達(dá)較Sham組大鼠增加,但增加幅度有限,遠(yuǎn)低于GBE組增加水平。因此外源性藥物干預(yù)可阻斷缺血后級(jí)聯(lián)反應(yīng),下調(diào)促凋亡基因、上調(diào)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BNDF)及NGF等神經(jīng)因子的表達(dá),從而起到神經(jīng)保護(hù)作用,此即為各種藥物治療CIRI的理論依據(jù)。目前已有多種中藥應(yīng)用于治療CIRI的基礎(chǔ)與臨床研究中。其中,銀杏葉提取物研究最為廣泛與深入。銀杏葉提取物(Ginkgobilobaextract)的主要有效成分為銀杏黃酮類(大于24%)和銀杏內(nèi)酯類(大于6%)。其治療腦缺血再灌注損傷的機(jī)理有以下幾方面:(1)改善腦微循環(huán)及代謝,減輕腦水腫;(2)抑制鈣超載,擴(kuò)張腦血管;(3)銀杏黃酮具有較強(qiáng)的清除自由基和抗氧化作用;(4)銀杏內(nèi)酯具有高效的抗血小板活化因子作用;(5)抗感染作用;(6)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)和受體。川芎嗪可通過(guò)擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、改善微循環(huán)、抑制缺血區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞與白細(xì)胞的黏附等作用抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡。黃芪能改善血液流變學(xué),抗氧化與氧自由基,抑制EAA的釋放與防止鈣超載,降低NO與NOS的活性,抑制HSP70表達(dá)等而產(chǎn)生抗CIRI作用。丹參可從清除氧自由基、保護(hù)線粒體、改善能量代謝、減輕鈣超負(fù)荷、調(diào)整TXA2/PGI2平衡等方面降低神經(jīng)細(xì)胞損傷與抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡。林捷等研究發(fā)現(xiàn)葛根素預(yù)防性治療腦梗死大鼠,能明顯改善大鼠神經(jīng)功能,腦梗死面積縮小,腦水腫程度降低,且呈劑量依賴性。另外,有關(guān)中藥合劑抗CIRI作用的研究也見(jiàn)諸報(bào)道,如參芎注射液可保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,改善微循環(huán),有利于神經(jīng)元修復(fù)等。但目前尚未見(jiàn)中藥復(fù)方抗CIRI作用的研究。本研究基于上述諸多中藥治療CIRI的研究,設(shè)計(jì)以銀杏葉為主藥的中藥復(fù)方,觀察該復(fù)方對(duì)下丘腦NGFR表達(dá)的影響。研究發(fā)現(xiàn),GBE組大鼠的下丘腦視上核/室旁核的NGFR表達(dá)較Sham組明顯升高,提示銀杏葉復(fù)方能明顯促進(jìn)下丘腦NGFR的表達(dá),因該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在動(dòng)物成模1月前開始用藥,推測(cè)該復(fù)方可用來(lái)預(yù)處理CIRI大鼠來(lái)達(dá)到保護(hù)神經(jīng)損傷的效果。同時(shí)亦發(fā)現(xiàn),GBE組大鼠的下丘腦視上核/室旁核的NGFR表達(dá)較I/R組大鼠明顯增加(P<0.01),表明銀杏葉復(fù)方能明顯促進(jìn)CIRI大鼠下丘腦NGFR的表達(dá),從而通過(guò)與NGF結(jié)合,促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育,誘導(dǎo)軸突生長(zhǎng),下調(diào)促凋亡基因,而達(dá)到神經(jīng)元保護(hù)作用。本研究表明銀杏葉復(fù)方能促進(jìn)CIRI大鼠下丘腦NG-FR的表達(dá)而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。但CIRI的病理生理是一個(gè)多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng),本實(shí)驗(yàn)僅是該中藥復(fù)方研究的第一步,僅揭露了該復(fù)