代謝組學(xué)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在中醫(yī)藥研究中的應(yīng)用

代謝組學(xué)是基因組學(xué)、轉(zhuǎn)換組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后系統(tǒng)生物學(xué)的另一個(gè)重要研究領(lǐng)域。它與藥物的作用和毒性的篩選和評估、作用機(jī)制的研究和合理的給藥性藥物濫用密切相關(guān)，在藥學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。將代謝組學(xué)應(yīng)用到中醫(yī)藥研究,可以通過觀察中醫(yī)藥治療所引起的內(nèi)源性代謝物的變化,尋找其與體內(nèi)生化過程和狀態(tài)變化的相關(guān)性,進(jìn)而探究其作用機(jī)制,為解決中醫(yī)藥的整體效應(yīng)和物質(zhì)基礎(chǔ)提供新思路和新方法。1中醫(yī)證候1.1轉(zhuǎn)化模型研究,確立了差異小分子代謝的基徐舒等采用“肝郁證”大鼠模型,運(yùn)用1H-NMR技術(shù)和主成分分析(PCA)、偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)對大鼠血清進(jìn)行代謝組學(xué)檢測分析。結(jié)果表明,與對照組相比,模型組血漿中葡萄糖和肌酸的含量明顯偏高,而3-羥基丁酸、谷氨酰胺、磷脂酰膽堿、磷酸膽堿和不飽和脂肪酸的含量明顯偏低,說明肝郁證模型與對照組大鼠血清代謝組分存在明顯差異,這些差異小分子物質(zhì)構(gòu)成“肝郁證”的代謝標(biāo)志物群,成為肝郁證代謝水平的物質(zhì)基礎(chǔ)。王偉明等建立大鼠肝氣郁結(jié)證模型,運(yùn)用1H-NMR和PCA與PLS-DA技術(shù),觀察與分析大鼠尿液小分子代謝物組的差異性變化譜。結(jié)果成功區(qū)分了模型組與正常組大鼠的尿液,初步得到其證型的代謝表型與差異性代謝物;與正常組相比,模型組大鼠尿液馬尿酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、異檸檬酸和烏頭酸的含量降低,肌酸酐、丙酮、乙酸、肌酸、煙酸和5-羥(基)吲哚-3-乙酸的譜峰相對積分面積明顯增高,在尿液中的含量顯著升高。說明通過尿液代謝組學(xué)的變化可以反映大鼠的生理病理基礎(chǔ),有助于闡述肝氣郁結(jié)證的生物學(xué)本質(zhì)。羅和古等采用1H-NMR結(jié)合PCA方法,通過研究慢性束縛應(yīng)激大鼠(肝郁脾虛模型)的血漿代謝表型改變,研究肝郁脾虛證候的生物學(xué)本質(zhì)。大鼠血漿1H-NMR譜的主成分分析顯示,各組動(dòng)物代謝譜各不相同,與已知應(yīng)激狀態(tài)下動(dòng)物體內(nèi)代謝的調(diào)節(jié)過程及結(jié)果相一致。正常組與模型組相比,醋酸、乳酸、酪氨酸、低密度脂蛋白和3.44×10-6的未知化合物的譜峰峰形改變較為明顯。這些發(fā)生改變的代謝物可以作為肝郁脾虛證的生物標(biāo)志物做進(jìn)一步研究。1.2中醫(yī)證型差異鑒定范群麗等選取陰虛陽亢證、肝火亢盛證和痰濕壅盛證的原發(fā)性高血壓病患者,應(yīng)用氣相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC-TOF-MS)測定陰虛陽亢證與健康人、陰虛陽亢證與其他證型患者的血清內(nèi)小分子,采用PCA和PLS-DA方法研究中醫(yī)證型的組間差異并鑒定差異化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不但可以區(qū)分高血壓病陰虛陽亢證與健康組人群,還顯示陰虛陽亢證病人體內(nèi)絕大部分小分子水平顯著低于健康組及其他證型(P<0.05)。這說明高血壓病陰虛陽亢證病人體內(nèi)小分子類物質(zhì)基礎(chǔ)明顯不同于其他證型。蔣海強(qiáng)等采用1H-NMR結(jié)合PCA方法研究高血壓病肝陽上亢證患者和健康志愿者的血液成分譜差異,尋找可能的生物標(biāo)記物,結(jié)果顯示,1H-NMR譜數(shù)據(jù)可以在得分圖實(shí)現(xiàn)分類,與健康志愿者相比,患者機(jī)體相關(guān)代謝發(fā)生顯著變化,體內(nèi)部分氨基酸代謝和葡萄糖代謝明顯異于健康志愿者,這可以為高血壓病肝陽上亢證的證侯本質(zhì)和診斷該類病證提供科學(xué)依據(jù)。1.3冠狀動(dòng)脈硬化1.3.1chd心血瘀阻證與血漿代謝相關(guān)指標(biāo)的關(guān)系簡維雄等利用GC-MS結(jié)合PCA與PLS-DA綜合分析冠心病(CHD)心血瘀阻證的代謝途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn),花生四烯酸、硬脂酸、乳酸、尿素、檸檬酸、β-羥基丁酸、油酸、葡萄糖、丙氨酸為CHD心血瘀阻證患者的血漿代謝產(chǎn)物譜;CHD心血瘀阻證與脂質(zhì)代謝、糖代謝相關(guān),同時(shí)也與缺氧、劇痛引起的應(yīng)激相關(guān)。這為探討心血瘀阻證的病理生理學(xué)基礎(chǔ)、闡明其生物學(xué)本質(zhì)提供了新思路。1.3.2痰濁證患者和瘀證患者血漿代謝相關(guān)化合物分析張紅栓等對冠心病心絞痛痰濁證和血瘀證患者的血漿代謝產(chǎn)物采用1H-NMR檢測,利用PCA與PLS-DA處理圖譜數(shù)據(jù),研究其代謝物圖譜的差異。結(jié)果顯示,痰濁證患者和血瘀證患者血漿樣本代謝物差異顯著,痰濁證組乳酸、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、脂類化合物、酮體、葡萄糖、半乳糖、N-乙酰糖蛋白、天門冬氨酸、異亮氨酸、谷氨酞胺、白蛋白賴氨酰的含量高于血瘀證組,而丙氨酸、高密度脂蛋白、不飽和脂肪酸、丙氨酸、瓜氨酸、精氨酸、脯氨酸的含量低于血瘀證組。說明兩組血漿樣本的1H-NMR代謝物圖譜存在差異,可以從中找出特異的標(biāo)志性代謝物,在一定程度上區(qū)分冠心病心絞痛的不同中醫(yī)證型。1.4甲胺和白砂糖及其衍生物高崗等應(yīng)用1H-NMR結(jié)合PCA研究腎虛證大鼠和空白對照大鼠的尿液成分譜差異。結(jié)果顯示,兩組大鼠的數(shù)據(jù)可以在得分圖實(shí)現(xiàn)分類,與對照組比較腎虛組大鼠相關(guān)代謝發(fā)生顯著變化,乳酸代謝發(fā)生堆積;二甲胺的含量增加,天冬氨酸、牛磺酸、馬尿酸和肌氨酸等的相對積分面積明顯下降;琥珀酸和檸檬酸含量降低。本研究為中醫(yī)的腎虛證和該類疾病臨床診治的研究提供了有價(jià)值的證據(jù)。孫永寧等利用GC-MS和PCA研究糖尿病腎陰虛證模型大鼠尿液的代謝組學(xué)變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):與正常組比較,模型組大鼠的尿液中的甘氨酸、琥珀酸含量顯著升高(P<0.05),十六烷酸、膽固醇含量顯著下降(P<0.05)。這說明模型大鼠的尿液代謝譜發(fā)生了明顯變化,為進(jìn)一步的糖尿病腎陰虛證研究提供了依據(jù)。2針刺陽明經(jīng)穴位對男性血漿代謝的影響謝瀟俠等利用大鼠帕金森病模型,頭針組選取“百會(huì)”旁“舞蹈震顫麻痹區(qū)”埋線,探討頭皮針埋線治療帕金森病的作用機(jī)制。結(jié)果提示,模型大鼠腦組織中丙二醛(MDA)的含量顯著降低(P<0.01)、一氧化氮(NO)的含量顯著增加(P<0.01),超氧化物歧化酶(SOD)的活性無明顯差異;其行為學(xué)和腦組織形態(tài)學(xué)方面均有明顯改善。這說明頭皮針埋線對帕金森病大鼠體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)具有調(diào)整作用,對腦組織細(xì)胞形態(tài)具有明顯的改善作用。劉莉等通過超高效液相色譜與串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀聯(lián)用技術(shù)(UPLC-Q-TOF-MS)結(jié)合PLS-D檢測分析空白組、卵蛋白致敏的豚鼠哮喘模型組及中藥穴位貼敷組豚鼠尿液代謝物圖譜,研究“冬病夏治”方藥穴位貼敷法治療哮喘豚鼠的機(jī)制,初步確認(rèn)氮4-乙?；?、6-甲基腺苷以及未確定化合物(m/z365.14)為哮喘發(fā)作潛在的生物標(biāo)志物,而甲基戊二酸、1-甲基次黃苷為冬病夏治方治療哮喘潛在的生物標(biāo)志物。吳巧鳳等采用基于1H-NMR的代謝組學(xué)方法分別觀察針刺陽明經(jīng)穴與他經(jīng)穴位對健康男性血漿代謝產(chǎn)物的影響,運(yùn)用模式識(shí)別方法(PCA和PLS-DA)分析陽明經(jīng)穴是否具有共性,與他經(jīng)穴位是否具有差異性。研究結(jié)果提示,1H-NMR和模式識(shí)別相結(jié)合的代謝組學(xué)方法能較好地區(qū)分出足三里組、陽陵泉組、委中組,針刺陽明經(jīng)穴位主要影響血漿中的小分子代謝物,與能量代謝通路密切相關(guān);針刺陽陵泉主要影響血漿代謝物中的大分子物質(zhì),與脂代謝、脂轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān);針刺委中對血漿代謝物影響不大。周思遠(yuǎn)等將代謝組學(xué)應(yīng)用于針刺臨床研究領(lǐng)域,針對人體代謝物易受外界刺激干擾的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了該技術(shù)在針刺研究中的質(zhì)量控制方法,包括嚴(yán)格篩選受試對象,適當(dāng)控制受試對象的飲食、運(yùn)動(dòng)、晝夜節(jié)律,規(guī)范樣本的采集、處理和保存以及統(tǒng)一針刺刺激量等措施,以減少干擾,突出針刺作用。這些研究思路和方法為針刺領(lǐng)域的研究提供了借鑒。3中藥的作用、作用機(jī)制和基礎(chǔ)3.1黃連素的檢測GuY等運(yùn)用代謝組學(xué)的方法,結(jié)合指紋分析和目標(biāo)分析,研究黃連素對于2型糖尿病和血脂異常治療作用的的潛在機(jī)制。結(jié)果顯示,采用正交信號(hào)校正-偏最小二乘-判別分析(OSC-PLS-DA)處理數(shù)據(jù),與安慰劑相比,患者使用黃連素治療前和治療后的數(shù)據(jù)都可以在得分圖中實(shí)現(xiàn)分類,其中,游離脂肪酸變化明顯;通過UPLC-Q-TOF-MS分析,結(jié)果得到進(jìn)一步證實(shí),伴隨黃連素的治療,脂肪酸13的濃度顯著下降,脂肪酸10的濃度與安慰劑組也有明顯不同。研究結(jié)果提示,黃連素可能通過下調(diào)的高水平的游離脂肪酸含量,在2型糖尿病的治療中發(fā)揮重要作用。湯喜蘭等運(yùn)用LC-MS-MS的代謝組學(xué)技術(shù)結(jié)合OSC-PLS-DA的模式識(shí)別方法,研究花椒水提物灌胃對大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn):花椒水提物給藥15d對尿樣代謝產(chǎn)物的影響最大;與空白組相比,給藥組大鼠尿樣中與抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、降血脂等藥理作用相關(guān)物質(zhì)的代謝發(fā)生顯著變化。這為進(jìn)一步闡釋花椒藥性的研究工作提供了依據(jù)。張啟云等采用LC-MS-MS分析方法測定給藥組和對照組大鼠的尿樣,結(jié)合PCA,PLS-DA分析,研究吳茱萸水提液灌胃給藥對大鼠內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的影響。結(jié)果顯示,給藥組與對照組相比,大鼠尿液代謝物白細(xì)胞三烯、棕櫚酰乙醇胺、二十二碳六烯酸、8(R)-氫過氧亞油酸、花生酸等有明顯變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明吳茱萸水提物灌胃對正常大鼠機(jī)體代謝產(chǎn)生影響,為進(jìn)一步闡釋吳茱萸的藥性提供了依據(jù)。RainaK等利用基于定量高分辨率質(zhì)子核磁共振光譜的代謝組學(xué)方法,對水飛薊賓治療TRAMP前列腺癌小鼠模型腫瘤的效果進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn),水飛薊賓抗腫瘤的作用是伴隨著TRAMP前列腺癌小鼠模型腫瘤的代謝物的改變實(shí)現(xiàn)的:葡萄糖含量增加6倍(P=0.016)、乳酸水平下降48%(P=0.015);檸檬酸的水平增高3倍(P=0.01),膽固醇和磷脂含量分別下降61%和50%(P<0.01),研究結(jié)果將有助于確定水飛薊賓治療時(shí)的代謝標(biāo)志物,而且當(dāng)臨床活檢或無創(chuàng)性磁共振光譜檢測時(shí)發(fā)現(xiàn)上述代謝標(biāo)志物時(shí),可以幫助監(jiān)測水飛薊賓對惡性前列腺癌的療效。3.2對熱血壓病證候的治療作用霍超等通過檢測綜合放血法所致血虛證及用四物湯干預(yù)治療后小鼠內(nèi)源性代謝物的變化,結(jié)合模式識(shí)別方法(PCA及PLS-DA),確定綜合放血法所致血虛證小鼠的血清及組織相關(guān)的生物標(biāo)記物,從代謝組學(xué)角度研究四物湯的作用機(jī)制。結(jié)果顯示,與對照組相比,模型組的血清及各組織的內(nèi)源性代謝物中乳酸、膽堿、牛磺酸、丙氨酸、低密度脂肪酸、甘油、不飽和脂肪酸、肌酐、乙酰乙酸鹽、丙氨酸及β-羥基丁酸的含量有明顯變化,這些變化在四物湯治療組中有不同程度的回調(diào)。柳長鳳等應(yīng)用代謝組學(xué)技術(shù),利用UPLC-Q-TOF-MS系統(tǒng),采用PCA和PLS-DA分析方法,研究黃連解毒湯對2,4-二硝基苯酚和干酵母誘導(dǎo)的熱病證候的干預(yù)作用。結(jié)果顯示,2個(gè)模型在同一得分圖中呈現(xiàn)明顯的聚類分組,說明2個(gè)模型所致機(jī)體代謝的改變不同;分別給予黃連解毒湯干預(yù)后,2個(gè)模型的各實(shí)驗(yàn)組代謝物在得分圖中聚類于模型恢復(fù)的路線上,表明黃連解毒湯能加快熱病證候的恢復(fù)并使其向健康方向發(fā)展。表明黃連解毒湯對不同原因誘導(dǎo)的熱病證候有良好的治療作用。彭樹靈等采用GC-MS和PCA,PLS-DA研究維胃方對大鼠實(shí)驗(yàn)性胃潰瘍的療效機(jī)制。結(jié)果顯示,模型組與正常對照組的胃黏膜代謝物譜差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,生物標(biāo)記物包括有機(jī)酸、脂肪酸、氨基酸等物質(zhì),表明胃潰瘍大鼠的胃黏膜出現(xiàn)能量代謝與物質(zhì)代謝異常,維胃方通過調(diào)節(jié)胃黏膜的代謝功能,達(dá)到有效治療胃潰瘍的目的。魯瑩等收集小鼠的尿液與血清,采用基于1H-NMR的代謝組學(xué)的方法,利用PCA進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,探討昆仙膠囊對MRL/lpr小鼠狼瘡性腎炎的影響及作用機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn),昆仙膠囊組給藥后,與模型組比較,小鼠尿蛋白濃度、血清抗ANA抗體及抗ds-DNA抗體水平顯著降低,且尿液中乳酸、檸檬酸、葡萄糖、谷氨酰胺、丙氨酸等含量降低,α-酮戊二酸、肌酸/肌酐、馬尿酸鹽含量升高。這提示昆仙膠囊可以明顯改善MRL/lpr小鼠的免疫狀況和腎臟功能。連方等通過二至天癸顆粒與六味地黃顆粒的對比,探討體外受精-胚胎移植(IVF-ET)周期人卵泡液代謝組學(xué)及Ca2+濃度、膽堿脂酶、肌酐對卵細(xì)胞質(zhì)量及妊娠結(jié)局的影響,研究二至天癸顆粒提高卵細(xì)胞質(zhì)量的機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組治療后腎陰虛證候積分、受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率都優(yōu)于對照組(P<0.05)。PCA分析兩組卵泡液代謝組學(xué),試驗(yàn)組主要分布在I區(qū),對照組主要分布在II區(qū),兩組卵泡液代謝組學(xué)有明顯差異。試驗(yàn)組Ca2+濃度顯著高于對照組(P<0.05),堿脂酶、肌酐高于對照組,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過代謝組學(xué)及Ca2+的測定,提示二至天癸顆粒提高卵胞質(zhì)量可能與患者卵泡液的代謝水平及Ca2+有關(guān)。4馬中心類型小鼠尿代謝特征分析LiuY等利用基于1H-NMR的代謝組學(xué)方法,通過研究由黃藥子導(dǎo)致的雄性SD大鼠尿毒性引起的尿液中代謝產(chǎn)物的變化,以確定其與組織病理學(xué)/生物化學(xué)的相關(guān)性和肝臟毒性的生物標(biāo)志物。尿液代謝組學(xué)分析顯示,牛磺酸、肌酸、甜菜堿、二甲基甘氨酸、醋酸鹽和甘氨酸的含量升高;琥珀酸、2-酮戊二酸、檸檬酸、馬尿酸和尿素水平下降。利用PLS-DA對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析表明,控制組和黃藥子治療組的代謝物變化明顯不同。劉霞等利用PCA處理圖譜數(shù)據(jù),通過分析C57BL/6J小鼠尿樣的代謝特征,研究馬兜鈴酸I(AAI)導(dǎo)致急性腎毒性的分子機(jī)理及其在雌性和雄性小鼠上差異的根源。結(jié)果顯示AAI的急性腎毒性主要來自AAI給藥后抑制了體內(nèi)的三羧酸循環(huán)和能量代謝,破壞了體內(nèi)腸道菌群的生態(tài)平衡,改變了腎臟細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓,從而引起了腎小管的損傷;同時(shí)雄性小鼠對AAI的腎毒性比雌性小鼠更敏感,可能源于雄性小鼠本身更低的能量代謝。梁琦等采用基于1H-NMR的代謝組學(xué)方法,利用PCA與PLS-DA處理圖譜數(shù)據(jù),比較廣防己、粉防己血、尿代謝表型差異,結(jié)合常規(guī)毒理學(xué)指標(biāo)探討廣防己、粉防己的毒性差異。研究顯示廣防己、粉防己組大鼠尿液中主要變化代謝物有檸檬酸、2-酮戊二酸、?；撬帷ⅠR尿酸鹽、肌酐等;血液中主要變化代謝物有不飽和脂肪酸、3-羥基丁酸、丙酮、乙酰乙酸、肌酐等,廣防己、粉防己均可引起肝、腎損害,且隨給藥時(shí)間延長損傷加重;粉防己的肝、腎毒性較廣防己重。梁曉萍等利用UPLC-TOF-MS,運(yùn)用代謝組學(xué)方法結(jié)合心電圖分析對蟾酥導(dǎo)致的大鼠急性毒性進(jìn)行了研究,通過PCA,OSC-PLS-DA處理數(shù)據(jù),分析對照組和各給藥組之間的血清代謝物譜差異,通過變量重要性投影和t檢驗(yàn)選取潛在的生物標(biāo)志物,結(jié)合質(zhì)譜同位素分析、數(shù)據(jù)庫檢索以及標(biāo)準(zhǔn)品對照法對潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示,蟾酥可導(dǎo)致大鼠心臟心率減慢、心律失常、甚至出現(xiàn)心肌梗塞現(xiàn)象,其導(dǎo)致心臟損傷的途徑可能是通過阻礙自由脂肪酸再?；蚣せ畹鞍准っ竿犯蓴_了脂質(zhì)代謝。5基于代謝組學(xué)技術(shù)的中藥質(zhì)量控制許多學(xué)者在將代謝組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究的其他領(lǐng)域方面也做了有益的嘗試:張明泉等對運(yùn)用代謝組學(xué)技術(shù)研究中醫(yī)氣絡(luò)的可行性進(jìn)行了探討,劉萍等提出了應(yīng)用代謝組學(xué)研究“肺與大腸相表里”理論的新思路,范剛等對基于代謝組學(xué)技術(shù)的中藥質(zhì)量控制研究思路進(jìn)行了研討等。6代謝組學(xué)與中醫(yī)藥生物代謝的關(guān)系以上研究顯示,代謝組學(xué)的研究步驟主要包括:樣品采集與制備、樣品分析與鑒定以及數(shù)據(jù)處理與分析3個(gè)部分。樣品最常用的是尿液、血漿或血清和其他組織;樣品分析與鑒定最常用的分析技術(shù)是NMR和GC-MS,LC-MS等;數(shù)據(jù)處理與分析以PCA,PLS-DA等最為常用,儀器分析與化學(xué)信息分析是代謝組學(xué)研究的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。代謝組學(xué)應(yīng)用于中醫(yī)藥研究,目前主要是通過先進(jìn)的分析技術(shù)獲得大量的內(nèi)源性代謝物信息,然后采用PCA,PLS-DA等模式識(shí)別技術(shù)對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理與分析,獲得相關(guān)生物標(biāo)記物群的信息。但現(xiàn)有的分析技術(shù)還不能實(shí)現(xiàn)對所有代謝物進(jìn)行分