神經(jīng)調(diào)節(jié)因子在色度學(xué)中的表達(dá)與分布

神經(jīng)調(diào)節(jié)因子在色度學(xué)中的表達(dá)與分布

神經(jīng)調(diào)節(jié)因子nerdic1（nrg1）是從乳腺癌腫瘤細(xì)胞中提取的。它是nrg1基因選擇性切割代碼的表皮生長(zhǎng)因子家族的重要成員之一。nrg1也被稱為cac細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ngf），是從牛腦和垂體中提取的，在外部條件下具有促進(jìn)絲綢起源的活性。Nrg1基因選擇性剪切產(chǎn)生至少6種Nrg1異形體,其中最主要的有Ⅰ到Ⅲ型Nrg1。ErbB3和ErbB4受體可直接與Nrg1發(fā)生作用,作用形式包括同二聚體:ErbB3/ErbB3和ErbB4/ErbB4以及異二聚體形式:ErbB3/ErbB2和ErbB4/ErbB2。Nrg1與其受體相互作用可激活ERK、AKT、MAPK,PI3γ、PKC和JakSTAT信號(hào),進(jìn)而引起細(xì)胞周期改變、細(xì)胞分化、抗凋亡程序啟動(dòng)和腫瘤形成。在發(fā)育中的大鼠腦組織中,Nrg1的表達(dá)可見于灰質(zhì)、下丘腦以及小腦。成年期,Nrg1則表達(dá)于更廣泛的腦組織區(qū)域,包括下丘腦、海馬、基底節(jié)以及腦干。Nrg1與其受體ErbB2,ErbB3和ErbB4二聚體復(fù)合物相互所用,參與了一系列生物學(xué)過程。有報(bào)道,Nrg1受體表達(dá)于下丘腦星形細(xì)胞,在Nrg1旁分泌作用下激活,分泌前列腺素E2,進(jìn)而刺激黃體生成素釋放激素(LHRH)的釋放,參與性成熟。新近研究發(fā)現(xiàn),Nrg1可表達(dá)于垂體促性腺激素細(xì)胞,并以鄰分泌方式激活泌乳素細(xì)胞表面受體磷酸化,促進(jìn)泌乳素釋放。體外條件下,Nrg1還可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲,通過自分泌或旁分泌方式調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架,促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。Nrg1已用于恒河猴體內(nèi)疾病模型研究,如心律失常誘導(dǎo)的心功能衰竭,且重組Nrg1可增加健康獼猴心臟體積。Nrg1還可通過提高PKB和Bcl-xl活性來對(duì)抗恒河猴心臟衰竭過程中心動(dòng)過速誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。此外,Nrg1受體ErbB2,ErbB3及ErbB4mRNA表達(dá)可廣泛見于青年及成年期恒河猴大腦組織。本研究比較觀察Nrg1及其受體ErbB2、ErbB4在成年期恒河猴大腦及小腦灰質(zhì)、白質(zhì)中表達(dá)與分布,從而促進(jìn)對(duì)Nrg1/ErbB信號(hào)通路在大腦、小腦中功能的了解。1材料和方法1.1抗小鼠及抗熒光減封劑小鼠抗Nrg1抗體購自美國ThermoScientific公司,兔抗ErbB2及兔抗ErbB4抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;抗小鼠DylightTM488及山羊抗兔DylighTMt594購自美國JacksonImmunoResearch公司。DAPI染液及抗熒光衰減封片劑購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。蘇木精及伊紅染液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。含有恒河猴大腦及小腦組織的組織芯片購自陜西超英生物技術(shù)有限公司。1.2木本工業(yè)上的蘇-蘇-木4μm厚恒河猴垂體組織微陣列切片脫蠟、水化,然后入蘇木精液染色約2min,1%鹽酸酒精分化;之后行伊紅染色,脫水、透明及中性樹膠封片。1.3小鼠抗nrg1和兔抗erbc1的生長(zhǎng)4μm厚恒河猴組織微陣列切片脫蠟、水化,然后入pH9.0枸櫞酸鹽緩沖液中80℃抗原修復(fù)50min。室溫冷卻后,切片入PBS中浸泡5min,10%驢血清室溫封閉60min,然后加入小鼠抗Nrg1以及兔抗ErbB2抗體或小鼠抗Nrg1及兔抗ErbB4抗體(稀釋比例分別為1∶100)混合液4℃孵育過夜。PBS洗后,加驢抗小鼠DylightTM488二抗和山羊抗兔DylightTM594二抗(稀釋度均為1∶500)混合液于切片上,室溫孵育1h。PBS輕洗后行DAPI染色5min,PBS充分洗滌,并使用抗熒光衰減封片液封片,熒光顯微鏡(德國Zeiss,AXIOIMAGERZ1)下觀察并采集圖像。2結(jié)果2.1熒光雙標(biāo)法檢測(cè)nrg1和erbc3H&E染色顯示恒河猴大腦皮質(zhì)(圖1-A)及白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)(圖1-B)。免疫熒光雙標(biāo)法顯示Nrg1可與其受體ErbB2或ErbB4可共位表達(dá)于恒河猴大腦皮質(zhì)部分細(xì)胞胞體中,且均呈密集點(diǎn)狀分布(圖2);而在大腦白質(zhì)神經(jīng)纖維集中區(qū)域三種分子均有分布,但Nrg1僅與ErbB4存在明顯共定位(圖3)。2.2nrg1與erbc2H&E染色顯示恒河猴小腦皮質(zhì)(圖4-A)及白質(zhì)基本結(jié)構(gòu)(圖4-B)。免疫熒光顯示Nrg1主要表達(dá)于小腦數(shù)量較多的顆粒細(xì)胞中并廣泛分布于白質(zhì)神經(jīng)纖維,熒光雙標(biāo)顯示Nrg1與其受體ErbB2可共定位于顆粒細(xì)胞及白質(zhì)神經(jīng)纖維。其受體ErbB4在小腦皮質(zhì)及白質(zhì)中無明顯表達(dá)和分布,未見與Nrg1存在明顯共定位(圖5)。3明確nrg1和erbc4在成年高等動(dòng)物受體信號(hào)通路的分布Nrg1/ErbB受體通路在器官發(fā)育、細(xì)胞分化以及腫瘤發(fā)生中具有重要作用。有報(bào)道,Nrg1參與下丘腦神經(jīng)元膠質(zhì)細(xì)胞間通訊,促進(jìn)下丘腦LHRH釋放,從而誘導(dǎo)大鼠垂體促性腺激素釋放和正常性成熟。以往研究發(fā)現(xiàn)重組Nrg1α可誘導(dǎo)垂體細(xì)胞ErbB3受體磷酸化以及ErbB3受體的內(nèi)源性磷酸化激活,提示Nrg1/ErbB受體通路可能是多種生理和病理?xiàng)l件下重要信號(hào)通路的起點(diǎn),此外還發(fā)現(xiàn)Nrg1與其受體ErbB4可部分表達(dá)于恒河猴垂體前葉兩鄰近細(xì)胞中,說明在高等動(dòng)物垂體組織中存在以Nrg1及其受體信號(hào)通路為基礎(chǔ)的旁分泌和鄰分泌機(jī)制。因此,明確高等動(dòng)物中Nrg1及其受體表達(dá)與分布,對(duì)進(jìn)一步研究Nrg1ErbB受體信號(hào)在高等動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)在恒河猴皮質(zhì)Nrg1與ErbB2及ErbB4均存在明顯共定位,提示Nrg1/ErbB受體信號(hào)通路在成年高等動(dòng)物腦組織中具有重要作用,且Nrg1信號(hào)通路可能是以旁分泌或自分泌方式,通過ErbB2/ErbB4或ErbB4/ErbB4受體復(fù)合物實(shí)現(xiàn)的。在大腦白質(zhì)神經(jīng)纖維中僅觀察到Nrg1與ErbB4共定位,表明在白質(zhì)ErbB4/ErbB4是介導(dǎo)Nrg1功能的主要受體復(fù)合物形式。與大腦皮質(zhì)及白質(zhì)不同,小腦皮質(zhì)及白質(zhì)主要表達(dá)ErbB