響應(yīng)面法優(yōu)化土茯苓多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

響應(yīng)面法優(yōu)化土茯苓多糖提取工藝及其抗氧化活性研究

土耳其語(yǔ)是一種保存和繁殖的植物。性平,味甘淡,歸肝胃脾經(jīng),有除濕、解毒、通利關(guān)節(jié)之功效,臨床用于濕熱淋濁,帶下,癰腫,瘰疬、疥癬,梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣,筋骨疼痛。文獻(xiàn)報(bào)道其主要化學(xué)成分為黃酮類(lèi)、多糖類(lèi)、有機(jī)酸類(lèi)、甾醇類(lèi)及酚苷類(lèi)等。多糖類(lèi)物質(zhì)具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力及抗癌等多方面功效,黃少偉等對(duì)土茯苓多糖(Smilaxglabrapolysaccharides,SGP)的微波提取工藝進(jìn)行了研究,但對(duì)SGP藥理活性方面的研究,筆者未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)土茯苓提取物能調(diào)節(jié)腎性高血壓大鼠血壓,改善其血液流變學(xué)及體內(nèi)氧化應(yīng)激,但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚未明確。響應(yīng)面分析法已被廣泛用于同時(shí)存在多因素影響的試驗(yàn)優(yōu)化上,但采用響應(yīng)面法優(yōu)化SGP的超聲提取工藝和研究其抗氧化活性方面筆者尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立超聲提取SGP的數(shù)學(xué)模型,采用苯酚-硫酸法測(cè)定SGP的含量,對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行初步研究,以期闡明土茯苓調(diào)節(jié)腎性高血壓病的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),為SGP的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)。藥品與試劑1.儀器UV2550型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司);RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠);SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司);KQ2200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);B-220恒溫水浴鍋(上海亞榮生化儀器廠);ACS-E2電子秤(上海三積分電子有限公司)。2.材料與試劑土茯苓(產(chǎn)地:浙江,批號(hào):110326),購(gòu)于杭州蕭山醫(yī)藥公司中藥分公司,經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院資源與鑒定教研室熊耀康教授鑒定為百合科植物光葉菝葜SmilaxglabraRoxb.的干燥根莖。鉬酸胺(批號(hào):090108,天津市化學(xué)試劑四廠凱達(dá)化工廠);硫酸(批號(hào):20091201,衢州巨化試劑有限公司);硫酸亞鐵(批號(hào):20070201,衢州巨化試劑有限公司);丁基羥基甲酸(BHT)(批號(hào):20101128,南京億隆科技有限公司);鐵氰化鉀(批號(hào):F20070928,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);三氯乙酸(批號(hào):050220,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司);氯化鐵(批號(hào):20070420,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);無(wú)水葡萄糖(批號(hào):110833-200904,中國(guó)藥品生物制品鑒定所),其他試劑均為分析純。gn型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)1.SGP的含量測(cè)定采用改良的苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量,SGP的提取量以每克原料中所含多糖的毫克數(shù)表示。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制備如下。精確稱(chēng)取經(jīng)干燥至恒重的標(biāo)準(zhǔn)無(wú)水葡萄糖20mg,用50mL蒸餾水定容,分別吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL,以水補(bǔ)至2.0mL,然后加入6%苯酚水溶液1.0mL,再迅速加入濃硫酸5.0mL,顯色后在冷水中冷卻,以蒸餾水代替糖溶液作空白對(duì)照,用紫外-可見(jiàn)分光光度法在490nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值,以吸光值為縱坐標(biāo),葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。準(zhǔn)確稱(chēng)取50mgSGP,定容至50mL,測(cè)定樣品吸光值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SGP含量。2.SGP的提取工藝研究利用響應(yīng)面法中centralcompositedesign型的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,選取對(duì)SGP提取率影響最大的3個(gè)因素為自變量,分別以Z1、Z2、Z3表示,并以-1、0、1分別代表自變量水平,以SGP提取率為指標(biāo),進(jìn)行響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn),并利用統(tǒng)計(jì)軟件Design-Expert對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析,預(yù)測(cè)SGP提取的最佳工藝參數(shù),見(jiàn)表1。3.SGP的制備3.1SGP的提取土茯苓干燥藥材100g,第1次加入35倍量的水90w超聲提取18.6min,紗布過(guò)濾,殘?jiān)尤?5倍量的水繼續(xù)90w超聲提取18.6min,重復(fù)2次,合并2次濾液,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀內(nèi)濃縮至100mL左右,邊攪拌邊緩緩加入400mL95%乙醇(最終酒精濃度為80%),4℃冰箱中靜置24h,布氏漏斗抽濾,沉淀分別用無(wú)水乙醇、丙酮和石油醚洗滌。3.2Sevage法除蛋白取粗多糖溶于50mL離心管中,按照4∶1的體積加入蛋白質(zhì)沉淀試劑(氯仿∶正丁醇=4∶1)10mL,劇烈振搖20min,常溫下4000r/min離心10min,取上清液重復(fù)上述操作5次。3.3SGP的透析和冷凍干燥除蛋白后的多糖溶液分別對(duì)自來(lái)水和蒸餾水透析2d(透析袋分子截留量為7000Da)。袋內(nèi)糖溶液減壓濃縮至適量體積,冷凍干燥得SGP,稱(chēng)重。4.抗氧化活性4.1還原力的測(cè)定根據(jù)參考文獻(xiàn),不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0moL/L)的SGP各1.0mL,加入0.2mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH=6.6)2.5mL和1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL,得混合物于50℃水浴保溫20min,然后加入2.5mL10%[重量(w)/體積(v)]三氯乙酸溶液,混合溶液3000r/min離心10min,精密吸取上清液2.5mL,加入2.5mL蒸餾水和0.5mL0.1%的三氯化鐵溶液,在700nm處測(cè)吸光度(吸光度值越大,還原力越強(qiáng))。BHT做為陽(yáng)性對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,求平均值。4.2總的抗氧化活性的測(cè)定根據(jù)參考文獻(xiàn),分別取不同濃度(0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0moL/L)的SGP各1.0mL,置10mL離心管中,加入3.0mL試劑溶液(試劑溶液中包括0.6mol/L的硫酸、28mmol/L的磷酸鈉、4mmol/L的鉬酸銨)。混合液于95℃水浴鍋中分別水浴30、60、90、150、180min。放冷至室溫,695nm處測(cè)吸光度值。以蒸餾水為空白,吸光度值越大,表明抗氧化能力越強(qiáng)。BHT做為陽(yáng)性對(duì)照。將實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,求平均值。模型選取和顯著性分析1.SGP含量的測(cè)定由圖1可知,吸光值隨著葡萄糖濃度的變化而呈線性變化。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:Y=5.9756X+0.0213,r=0.9999。式中:X為標(biāo)準(zhǔn)溶液的葡萄糖濃度(mg/mL);Y為葡萄糖在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定的吸光值。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出SGP的多糖含量為82.67%。2.響應(yīng)面優(yōu)化SGP的工藝在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上選取液固比、提取時(shí)間、超聲功率對(duì)本試驗(yàn)有關(guān)鍵影響的3個(gè)因素,設(shè)定試驗(yàn)因素與水平,對(duì)提取液固比Z1、提取時(shí)間Z2和超聲功率Z3作變換如下:X1=(Z1-30)/5,X2=(Z2-20)/5,X3=(Z3-80)/10,以X1,X2,X3為自變量,提取次數(shù)選用單因素試驗(yàn)所得的最佳值,即2次。根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理采用3因素3水平共計(jì)20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及其預(yù)測(cè)值見(jiàn)表2。由于各因素對(duì)SGP提取率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系,為了更明確各因素對(duì)其的影響,利用Design-Expert7.1.3Trial統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合,獲得超聲提取SGP提取率對(duì)自變量液固比(X1)、提取時(shí)間(X2)、超聲功率(X3)的二次多項(xiàng)回歸模型方程為SGP提取率Y=0.29+0.028X1+9.352×10-4X2+0.017X3-9.375×10-3X1X2+0.016X1X3-4.375×10-3X2X3-4.676×10-3X12-0.021X22-0.024X32。式中:X1,X2,X3為一次項(xiàng)系數(shù);X1X2,X1X3,X2X3為交互項(xiàng)系數(shù);X12,X22,X32為二次項(xiàng)系數(shù)。方程中各項(xiàng)系數(shù)絕對(duì)值的大小直接反映了各因素對(duì)指標(biāo)值的影響程度,系數(shù)的正負(fù)反映了影響的方向。由方程可知影響SGP提取率的因素的主次順序?yàn)?液固比>超聲功率>提取時(shí)間。為了檢驗(yàn)方程的有效性,對(duì)該模型和回歸模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。由表可知此模型的P=0.0023,說(shuō)明選用的模型極顯著(P<0.01);失擬項(xiàng)P=0.1009不顯著,說(shuō)明模型的擬合程度良好,未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很小。本研究得到模型擬合程度良好,試驗(yàn)誤差小,可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)超聲提取SGP的得率。由表3可知液固比(X1)偏回歸系數(shù)極顯著,二次項(xiàng)X22、X32偏回歸系數(shù)顯著,表明液固比對(duì)SGP的超聲提取具有較大影響,而提取時(shí)間和超聲功率的影響均不顯著。交互項(xiàng)的偏回歸系數(shù)也不太顯著,說(shuō)明各具體實(shí)驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。3.響應(yīng)面分析和優(yōu)化依據(jù)各因素對(duì)其響應(yīng)值所構(gòu)成的三維立體曲面圖,可反映各因素對(duì)其響應(yīng)值的影響。本研究中固定1個(gè)因素在0水平上,研究另2個(gè)因素間的交互作用,根據(jù)所作的三維空間曲面圖,分析液固比、提取時(shí)間、超聲功率交互作用對(duì)提取效果的影響。根據(jù)回歸分析結(jié)果作出響應(yīng)曲面圖和等高線圖,見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,液固比、超聲功率、提取時(shí)間均影響SGP的提取,隨著液固比的增大,SGP的提取率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì);隨著超聲功率的增強(qiáng),SGP的提取率呈現(xiàn)先上升后稍微下降的趨勢(shì);隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng),SGP提取率增加,但超過(guò)一定范圍后,多糖的提取率反而下降。因此,液固比對(duì)SGP的提取率影響最大,其可能原因在于SGP中主要成分為水溶性物質(zhì),隨著溶劑量的增大,溶解多糖的能力提高;隨著超聲功率增強(qiáng),提取時(shí)間的延長(zhǎng),溶出的多糖提高,但提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或超聲功率過(guò)高,多糖可能被破壞,導(dǎo)致提取率下降。由Design-Expert軟件的優(yōu)化分析,并考慮到試驗(yàn)的可操作性,確定優(yōu)化提取條件為液固比35∶1,超聲功率90w,提取時(shí)間18.60min,SGP提取率為0.3255%。4.驗(yàn)證試驗(yàn)采用上述優(yōu)化條件提取SGP,重復(fù)3次進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),在此條件下SGP實(shí)際得率平均值為0.3106%,與理論預(yù)測(cè)值相比,其相對(duì)誤差小于5%。5.抗氧化活性測(cè)定5.1還原力的測(cè)定由表4可知,SGP具有較強(qiáng)的還原能力,且還原能力隨多糖含量(0.1-1.0mg/mL)升高而增強(qiáng);相關(guān)分析表明,SGP的還原力(Y)與多糖濃度(X)呈顯著正相關(guān)(Y=0.3932X+0.0941,r=0.9974);陽(yáng)性對(duì)照BHT在本研究中呈現(xiàn)了較好的還原力和顯著的相關(guān)性(Y=3.868X+0.1612,r=0.9952)。當(dāng)多糖含量為1.0mg時(shí),SGP的還原能力在700nm下的吸光值為(0.490±0.004),但本研究條件下SGP還原能力比BHT低。5.2總的抗氧化活性的測(cè)定由表5及圖3的結(jié)果可知,SGP具有較強(qiáng)的抗氧化能力。溶液在695nm處的吸光度依次遞增說(shuō)明了SGP總的抗氧化活性大小與其濃度和反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)短成正比,即樣品濃度越高(0.1-1.0mg/mL)、混合溶液反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)(0.5-3.0)h,總的抗氧化活性越強(qiáng)。相關(guān)分析表明,SGP總的抗氧化活性(Y)與多糖濃度(X)呈顯著正相關(guān)(Y=0.4942X+0.0905,r=0.9846)。土茯苓茯苓多糖抗氧化在食品及其他浸提液中的應(yīng)用研究響應(yīng)面分析法系多元二次回歸方法,作為函數(shù)估計(jì)的工具,將多因子試驗(yàn)中因素與指標(biāo)的相互關(guān)系用多項(xiàng)式進(jìn)行擬合,依此可對(duì)函數(shù)的響應(yīng)面和等高線進(jìn)行分析,該方法具有周期短,回歸方程精度高等優(yōu)點(diǎn)。為明確土茯苓調(diào)節(jié)腎性高血壓的藥效物質(zhì)基礎(chǔ),本研究采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化了SGP的提取工藝,并對(duì)SGP進(jìn)行了純化與精制,采用紫外分光光度法測(cè)定其多糖含量為82.67