基因工程概論2

（二）工具酶限制性核酸內(nèi)切酶DNA聚合酶ⅠT4DNA連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶堿性磷酸酶末端轉(zhuǎn)移酶

TaqDNA聚合酶-------“縫紉針”

--------“基因剪刀”重組DNA技術(shù)中常用的工具酶限制性核酸內(nèi)切酶---“基因剪刀”定義限制性核酸內(nèi)切酶(restrictionendonuclease,RE)是識別DNA的特異序列,并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠ作用與甲基化酶共同構(gòu)成細(xì)菌的限制修飾系統(tǒng)，限制外源DNA，保護自身DNA。分類Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ（基因工程技術(shù)中常用Ⅱ型）第一個字母取自產(chǎn)生該酶的細(xì)菌屬名，用大寫；第二、第三個字母是該細(xì)菌的種名，用小寫；第四個字母代表株；用羅馬數(shù)字表示發(fā)現(xiàn)的先后次序。命名HindⅢ屬

系

株序Haemophilusinfluenzaed株流感嗜血桿菌d株的第三種酶Ⅱ類酶識別序列特點——回文結(jié)構(gòu)(palindrome)

切口：平端切口、粘端切口GGATCCCCTAGGBamHⅠGTCCAGGCCTAGGATCCG+GGATCCCCTAGGHindⅡGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口bluntend粘端切口stickyend同功異源酶來源不同的限制酶，但能識別和切割同一位點，這些酶稱同功異源酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BamHⅠGGATCCCCTAGGGCCTAGGATCCG+BstⅠ有些限制性內(nèi)切酶雖然識別序列不完全相同，但切割DNA后，產(chǎn)生相同的粘性末端，稱為同尾酶。這兩個相同的粘性末端稱為配伍未端(compatibleend)。BamHⅠBglⅡGGATCCCCTAGGAGATCTTCTAGAGCCTAGGATCCG++ATCTAG

GATCTA同尾酶（三）目的基因（targetDNA）－“乘客”

cDNA(complementaryDNA)反轉(zhuǎn)錄合成，與mRNA互補的單鏈DNA基因組DNA(genomicDNA)一個細(xì)胞或生物體整套遺傳信息的所有DNA序列（四）基因載體—“交通工具汽車”定義為攜帶目的基因，實現(xiàn)其無性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些DNA分子。常用載體質(zhì)粒DNA噬菌體DNA病毒DNA克隆載體(cloningvector)為使插入的外源DNA序列被擴增而特意設(shè)計的載體稱為克隆載體。表達(dá)載體(expressionvector)為使插入的外源DNA序列可轉(zhuǎn)錄翻譯成多肽鏈而特意設(shè)計的載體稱為表達(dá)載體。載體的選擇標(biāo)準(zhǔn)能自主復(fù)制；具有兩個以上的遺傳標(biāo)記物，便于重組體的篩選和鑒定；有克隆位點（外源DNA插入點），常具有多個單一酶切位點，稱為多克隆位點（MCS）；分子量小，以容納較大的外源DNA。1.質(zhì)粒

(plasmid)質(zhì)粒：存在于細(xì)菌染色體之外的能獨立自主復(fù)制環(huán)狀雙鏈DNA分子。帶有某些遺傳信息,會賦予宿主細(xì)胞一些遺傳性狀目錄ori含有的lacZ基因編碼了β半乳糖苷酶的α片段（N端），插入外源DNA后，α片段不能正常合成λ噬菌體DNA改造系統(tǒng)λgt系列（插入型，適用cDNA克?。〦MBL系列（置換型，適用基因組克?。?.噬菌體(phage)

M13噬菌體DNA改造系統(tǒng)（含lacZ基因的N端）M13mp系列pUC系列3.粘性質(zhì)粒(cosmid)一種人工構(gòu)建的克隆載體，包含了λ噬菌體的cos基因。能被包裝到λ噬菌體粒子中，感染大腸桿菌；它攜帶入宿主細(xì)菌的DNA片段（超過45kb）要比質(zhì)粒載體攜帶的要大酵母人工染色體(yeastartificialchromosome,YAC)細(xì)菌人工染色體(bacterialartificialchromosome,BAC)動物病毒DNA改造的載體（如腺病毒，腺病毒相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒）其他二、重組DNA技術(shù)基本原理基本過程目的基因的獲取DNA導(dǎo)入受體菌外源基因與載體的連接克隆載體的選擇和構(gòu)建重組體的篩選克隆基因的表達(dá)

以質(zhì)粒為載體的DNA克隆過程目錄（一）目的基因的獲取1.化學(xué)合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其產(chǎn)物的氨基酸序列。小分子多肽基因2.基因組DNA文庫(genomicDNAlibrary)3.cDNA文庫(cDNAlibrary)4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,PCR)（見第22章）1*化學(xué)合成法獲取目的基因由已知氨基酸序列推測可能的DNA序列基因組DNA文庫（genomicDNAlibrary）將某一基因組DNA用適當(dāng)?shù)南拗泼盖袛嗪螅c載體DNA重組，再全部轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，存在于轉(zhuǎn)化細(xì)胞內(nèi)由克隆載體所攜帶的所有基因組DNA的集合稱為G文庫2*從基因組DNA文庫獲取目的基因cDNA文庫(cDNAlibrary)：

以某種細(xì)胞的全部mRNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶合成與mRNA互補的DNA（cDNA）再復(fù)制成雙鏈cDNA,與適當(dāng)?shù)妮d體連接后轉(zhuǎn)化入受體菌，得到含全部表達(dá)基因的種群，稱為C-文庫(cDNAlibrary)。C-文庫具有組織細(xì)胞特異性。3*從cDNA文庫獲取目的基因DNA文庫目錄Dr.KarryMullis1985年發(fā)明，獲1993年度諾貝爾化學(xué)獎

PCR(Polymerasechainreaction)

是用一對寡聚DNA作為引物，通過加溫變性－退火－DNA合成的多次循環(huán)，使目的DNA片段得到擴增。由于這種擴增產(chǎn)物是以指數(shù)形式積累的，經(jīng)25－30個循環(huán)后，擴增倍數(shù)可達(dá)106。4.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)目的:

用于擴增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。模板DNA

特異性引物耐熱DNA聚合酶

dNTPsMg2+

PCR體系及基本反應(yīng)步驟變性95?C延伸72?C退火Tm-5?C5

Primer15

Primer2Cycle2Cycle15

5

5

5

5

5

TemplateDNA5

5

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5

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5

一、基本工作原理Cycle1Cycle2基本工作原理Cycle35

5

5

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5

25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。25～30次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴大100萬倍以上。Cycle3（三）外源基因與載體的連接1.粘性末端連接方式：(1)同一限制酶切位點連接(2)不同限制酶切位點連接配伍末端連接非配伍末端連接（二）克隆載體的選擇和構(gòu)建BamHⅠ切割反應(yīng)

GGATCCCCTAGGT4

DNA連接酶15oCGATCCGGCCTAG+目的基因用BamHⅠ切割載體DNA用BamHⅠ切割重組體載體自連目的基因自連同一限制酶切位點連接目錄不同限制酶切位點（非配伍末端）的連接EcoRⅠ切割位點BglⅡ切割位點+EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切EcoRⅠ+BglⅡ雙酶切T4

DNA連接酶15oC重組體配伍末端的連接情況和同一限制酶切位點連接相似。目錄2.平端連接適用于：限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生的平端粘端補齊或切平形成的平端目的基因載體限制性內(nèi)切酶限制性內(nèi)切酶T4DNA連接酶15oC重組體載體自連目的基因自連目錄3.同聚物加尾連接在末端轉(zhuǎn)移酶(terminaltransferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再進(jìn)行粘端連接。5′3′3′5′載體DNA5′3′3′5′目的基因限制酶或機械剪切限制酶5′3′3′5′5′3′T(T)nT

T(T)nT3′5′5′

3′3′5′5′3′A(A)nA

A(A)nA3′5′λ-核酸外切酶λ-核酸外切酶末端轉(zhuǎn)移酶+dATP末端轉(zhuǎn)移酶+dTTPT(T)n