高級(jí)食品微生物學(xué)- 課件 第三章 微生物課

腸源益生菌的代謝產(chǎn)物及其生理活性MetabolitesandPhysiologicalActivitiesofIntestinalProbiotics1/68目錄CONTENTS2/68Short-chainfattyacidsBacteriocins胞外多糖Extracellularpolysaccharides維生素Vitamin細(xì)菌素短鏈脂肪酸3/68短鏈脂肪酸短鏈脂肪酸（Short-chainfattyacid，SCFA）：大腸細(xì)菌代謝的主要終產(chǎn)物，是碳鏈為1~6的有機(jī)脂肪酸，主要由厭氧微生物發(fā)酵難消化的糖類而產(chǎn)生的。種類：主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸和異己酸；其中乙酸、丙酸和丁酸含量最高，三者占短鏈脂肪酸的90%~95%。活性：影響結(jié)腸上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)；促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞和小腸細(xì)胞的代謝、生長、分化；為腸黏膜上皮細(xì)胞及肌肉、心、腦、腎提供能量；增加腸道血液的供應(yīng)量；影響肝對(duì)脂質(zhì)和糖類的調(diào)控等。4/68短鏈脂肪酸一、SCFAs的產(chǎn)生及影響因素1.

SCFAs的產(chǎn)生部位：（1）盲腸、結(jié)腸是細(xì)菌酵解的主要部位。

（2）大腸內(nèi)容物每克含菌量高達(dá)1011~1012

CFU，結(jié)腸的無氧狀態(tài)為厭氧菌酵解提供了理想的環(huán)境與場所。

（3）升結(jié)腸和盲腸中SCFA的含量較高。

（4）雖然升、降結(jié)腸中SCFA的濃度不同，但產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸的濃度比卻相同。5/68短鏈脂肪酸一、SCFAs的產(chǎn)生及影響因素1.SCFAs的產(chǎn)生菌屬糞便平均菌數(shù)/g干重糞便/（CFU/g）主要發(fā)酵產(chǎn)物擬桿菌屬11.3×109乙酸、丁酸、琥珀酸雙歧桿菌10.3×109乙酸、乳酸、乙醇、甲酸真桿菌屬10.7×109乙酸、丁酸、乳酸瘤胃球菌屬10.2×109乙酸消化鏈球菌屬10.1×109乙酸、乳酸乳桿菌屬9.6×109乳酸梭菌屬9.8×109乙酸、丙酸、丁酸、乳酸鏈球菌屬8.3×109乙酸、乳酸6/68短鏈脂肪酸一、SCFAs的產(chǎn)生及影響因素1.

SCFAs的產(chǎn)生

腸道細(xì)菌對(duì)糖類代謝的主要終產(chǎn)物是乙酸、丙酸、丁酸、二氧化碳、甲烷、氫氣和水。（1）其中乙酸、丙酸、丁酸所占比例高達(dá)85%。（2）不同酵解底物生成的SCFA的總量、比例不盡相同，但乙酸鹽所占比例最高，如果膠生成乙酸、丙酸、丁酸的比例為80:12:8,淀粉則為62:15：22,通?；旌喜蜑?3：22:8。（3）若每天有20g糖類在結(jié)腸中被代謝，則生成SCFA的量約為200mmol/L。7/68短鏈脂肪酸一、SCFAs的產(chǎn)生及影響因素1.

SCFAs的產(chǎn)生

進(jìn)入結(jié)腸的蛋白質(zhì)和氨基酸進(jìn)行腸酵解后的主要產(chǎn)物也是短鏈脂肪酸。（1）梭菌能夠利用多種氨基酸生成相應(yīng)的多種有機(jī)酸，如可通過丙烯酸途徑由丙氨酸產(chǎn)生丁酸，也可在蘇氨酸脫水酶和酮酸脫氫酶的參與下由蘇氨酸產(chǎn)生丙酸。（2）乙酸可通過Stickland反應(yīng)從甘氨酸產(chǎn)生，也可通過谷氨酸二賴氨酸、鳥氨酸、絲氨酸的發(fā)酵而產(chǎn)生。（3）谷氨酸的主要發(fā)酵產(chǎn)物是乙酸和丁酸，谷氨酸進(jìn)行厭氧代謝有兩個(gè)途徑，一個(gè)是甲基天冬氨酸途徑，常見于梭菌；另一個(gè)是羥基谷氨酸途徑，常見于梭桿菌、消化鏈球菌和氨基酸球菌。8/68短鏈脂肪酸一、SCFAs的產(chǎn)生及影響因素2.SCFAs產(chǎn)生的影響因素（1）糖類底物不同，結(jié)腸微生物發(fā)酵產(chǎn)生的短鏈脂肪酸的比例和生理作用也不同。寡糖：由2~10個(gè)單糖通過糖苷鍵連接而成的低聚合度的糖類化合物。不同種類的寡糖被降解成不同種類的短鏈脂肪酸，例如，果膠與木聚糖降解的主要產(chǎn)物是乙酸，阿拉伯半乳聚糖的降解產(chǎn)物則以丙酸為主。非淀粉多糖：是大多數(shù)膳食纖維的主要組成成分,可能影響肝臟葡萄糖的生成。糖類結(jié)構(gòu)的不同而影響腸道中不同菌群的發(fā)酵能力。常見的非淀粉多糖包括谷物6-葡聚糖、戊聚糖等?？剐缘矸郏汉锌剐缘矸鄣纳攀晨梢栽黾蛹S便中丁酸的含量。9/68短鏈脂肪酸一、SCFAs的產(chǎn)生及影響因素2.SCFAs產(chǎn)生的影響因素（2）蛋白質(zhì)和氨基酸的種類不同，短鏈脂肪酸的種類和比例也不同。（3）SCFAs的種類和數(shù)量還受到pH、發(fā)酵基質(zhì)的數(shù)量、類型、降解速率、降解程度以及腸道菌群和宿主生理狀態(tài)等因素的影響。結(jié)腸內(nèi)淀粉的量增加時(shí)，糞便樣品中水解淀粉的細(xì)菌在厭氧菌總數(shù)中的比例增加，產(chǎn)生的丁酸的濃度及其在SCFAs中的比例也隨之增加。10/68短鏈脂肪酸二、SCFAs的吸收

大部分SCFAs在結(jié)腸內(nèi)已被吸收。正常生理狀況下，結(jié)腸內(nèi)SCFAs以陰離子形式存在，但其吸收通過離子與非離子形式進(jìn)行，以經(jīng)由上皮的非離子形式彌散為主。因此，SCFA的吸收需要腸腔內(nèi)的陽離子，可以通過盲腸、近端結(jié)腸上皮的Na+-K+泵交換，或?qū)O2轉(zhuǎn)化為碳酸而分解出陽離子（H+）與碳酸氫根（HCO3-）。

增加吸收面積或吸收時(shí)間、提高腔內(nèi)濃度都可增加SCFA在腸道的吸收。不同的SCFAs在結(jié)腸不同節(jié)段的吸收率也不同。11/68短鏈脂肪酸三、SCFAs的代謝乙酸：來源于盲腸，被腸道上皮組織攝取后，出現(xiàn)在門靜脈血液中，最終穿過肝臟進(jìn)入外周組織而被肌肉代謝。當(dāng)門靜脈中的乙酸降低到臨界水平以下時(shí)，肝臟會(huì)分泌游離乙酸。乙酸可以被許多組織攝取和利用，是機(jī)體從小腸不能消化吸收的糖類中得到能量的主要途徑。丁酸：體外培養(yǎng)的游離結(jié)腸上皮細(xì)胞，75%的氧消耗來自丁酸鹽的氧化。擋丁酸是唯一可利用能源時(shí)，可完全被結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞利用，生成酮體和CO2。當(dāng)葡萄糖、酮體、谷氨酰胺等作為能源時(shí)，結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞首選丁酸。丙酸：足量時(shí)不被結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞代謝，而是經(jīng)門靜脈轉(zhuǎn)運(yùn)至肝內(nèi)作為能源。乙酸鹽半衰期僅幾分鐘，可被腦、骨骼肌和心肌所代謝。12/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能1.

促進(jìn)腸道水和Na＋吸收（1）抗生素抑制腸道菌群，減少SCFAs生成，引起腸道水鈉吸收降低，可導(dǎo)致抗生素相關(guān)性腹瀉。（2）腸道管伺營養(yǎng)時(shí)，由于大部分配方中糖類大都在小腸吸收，因而結(jié)腸細(xì)菌的發(fā)酵底物減少，SCFAs生成相應(yīng)減少，這便得結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞營養(yǎng)不良和結(jié)腸內(nèi)水鈉的吸收降低，容易引發(fā)腹瀉。（3）結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞對(duì)Na+的吸收增加，然后增加對(duì)水的吸收，飲食性纖維生成的SCFAs具有抗腹瀉作用。13/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能2.促進(jìn)結(jié)腸細(xì)胞增殖（1）飲食中添加纖維素可提高結(jié)腸隱窩上皮細(xì)胞的更新和遷移。（2）將瓜爾豆膠和果膠添加到大鼠的飲食中，發(fā)現(xiàn)其結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖加快，而低纖維飲食導(dǎo)致以黏膜發(fā)育不全、結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖減少為特征的結(jié)腸萎縮。（3）丁酸對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞增殖與黏膜生長起主要作用，對(duì)隱窩上皮細(xì)胞增殖的劑量依賴性、刺激作用強(qiáng)弱的順序是丁酸>丙酸>乙酸。14/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能3.提供能源物質(zhì)（1）結(jié)腸中經(jīng)由酵解產(chǎn)生的能量主要依賴于飲食性糖類的質(zhì)和量。（2）如果人們攝入平衡飲食，理論上3%～9%的機(jī)體總需求能量來自于腸酵解（20～60g物質(zhì)被酵解），以淀粉為主食的人群中所占比例更高。（3）SCFAs提供結(jié)腸黏膜所需總能量的70%，其中結(jié)腸上皮細(xì)胞首選的能源物質(zhì)是丁酸。15/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能4.增加腸血流（1）SCFAs有擴(kuò)張結(jié)腸血管的作用，其中丁酸最強(qiáng)。（2）SCFAs對(duì)末端回腸微循環(huán)也有影響，能使離體的人回腸阻力動(dòng)脈舒張，且在質(zhì)、量上與對(duì)結(jié)腸血流的作用相似。（3）也有研究發(fā)現(xiàn)，SCFAs在體內(nèi)可刺激Hartmann術(shù)后直腸黏膜的血流增加。16/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能5.刺激胃腸激素生成（1）胃泌素、腸高糖素、醏酪肽（PeptideYY，PYY)是介導(dǎo)腸上皮細(xì)胞增殖和腸黏膜生長的三種主要的激素。（2）可酵解纖維能夠刺激結(jié)腸皮細(xì)胞增殖，與整個(gè)腸道腸高糖素及結(jié)腸PYY水平升高密切相關(guān)。（3）靜脈注射SCFAs，其可直接刺激胰腺腺泡分泌胰高血糖素和胰島素，且作用強(qiáng)弱依賴于SCFAs劑量。17/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能6.抗病原微生物和抗菌作用（1）應(yīng)用:考慮到腸道微生物在生產(chǎn)SCFAs過程中的重要作用，“益生菌療法”可以作為臨床上治療慢性炎性腸炎(IBD)的備選方案之一。SCFAs可促進(jìn)傷寒沙門菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡；SCFAs來增加腸道沙門菌亞硝酸鹽和降低超氧化物歧化酶的量，可能是其誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一。（2）通過下調(diào)由核因子NF-kB誘導(dǎo)的前炎性細(xì)胞活素的表達(dá)和促進(jìn)腸道水鈉的吸收，膳食纖維和SCFAs可以降低炎性腸炎的發(fā)病率。18/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能7.預(yù)防和緩解腫瘤作用

三種SCFAs均能通過抑制癌細(xì)胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移而起到緩解腫瘤損傷的作用。不同食物纖維素在腸道中發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs的組成存在差異，產(chǎn)生的效果不同。（1）丁酸在毫摩爾濃度水平下就能發(fā)揮抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)分化和凋亡的作用，能抑制腫瘤新生血管的形成，并對(duì)正常細(xì)胞無損傷。（2）丁酸鹽作為組蛋白脫乙酰酶(HDAC)的抑制劑，它還可以抑制大多數(shù)組蛋白脫乙酰酶類的活性，但對(duì)I類HDAC、Ⅱ類中的HDAC6和HDAC10沒有抑制作用。結(jié)腸中SLC5A8能通過調(diào)節(jié)細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物丁酸來抑制腫瘤生長。SCFAs還可通過調(diào)節(jié)結(jié)腸細(xì)胞表型、DNA的合成與甲基化、細(xì)胞周期蛋白D1和c-myc的水平來保護(hù)結(jié)腸黏膜，避免其轉(zhuǎn)化為腫瘤。19/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能8.調(diào)控基因表達(dá)（1）G-蛋白偶聯(lián)受體41(GPR41)和GPRB是SCFA在人或動(dòng)物上皮黏膜細(xì)胞和內(nèi)分泌細(xì)胞的受體蛋白，SCFA可刺激回腸和結(jié)腸酪酪肽（PYY)多肽和5-羥色胺（5-HT)的釋放。（2）有研究表明，不同的SCFA及組合對(duì)GPR41和GPR43的活性有不同程度的影響。20/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能8.調(diào)控基因表達(dá)（1）各SCFA對(duì)GPR41活性影響的強(qiáng)弱順序?yàn)椋罕?戊酸=丁酸>乙酸>甲酸；而對(duì)GPR43活性影響的強(qiáng)弱順序則有所不同：乙酸==丙酸=丁酸>戊酸>己酸=甲酸。（2）在SCFA混合物調(diào)控組蛋白乙酰化的作用中，丁酸和丙酸存在累加效應(yīng)，而乙酸則不具備。21/68短鏈脂肪酸四、SCFAs的生理功能9.改善血脂和血糖異常（1）SCFAs混合物可以刺激盲腸膳食纖維的發(fā)酵，從而影響血液中膽固醇的水平。（2）膳食中的丙酸還能降低血糖和胰島素水平，肝中的丙酸可以調(diào)節(jié)糖類和脂肪的代謝。（3）有研究表明，長期給予丙酸鹽可降低空腹血糖的濃度，這可能與其抑制肝臟釋放葡萄糖有關(guān)。22/68細(xì)菌素細(xì)菌素：由某些細(xì)菌在代謝過程中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有生物活性的蛋白質(zhì)、多肽或前體多肽，這些物質(zhì)可以抑制或殺滅與之相同或相似的其他微生物。乳酸鏈球菌素（nisin）：乳酸鏈球菌和乳酸乳球菌乳亞種(Lactococcuslactissubsp，lactis)的多個(gè)菌株產(chǎn)生的具有廣譜抑菌作用的細(xì)菌素，是典型的乳酸菌細(xì)菌素?；钚裕嚎梢韵w內(nèi)的競爭性病原微生物，從而為有益微生物提供生存和增殖的機(jī)會(huì)。例如給病人喂食約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)發(fā)酵的牛乳制品可顯著降低胃中幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的密度。23/68細(xì)菌素一、細(xì)菌素的分類

細(xì)菌素是由核糖體合成的多肽，由20~60個(gè)氨基酸組成。幾乎所有的細(xì)菌素在中性或偏酸性的環(huán)境中帶負(fù)電荷，它們的分子鏈中通常含有伸出的疏水性或兩親性鏈段。

分類：革蘭氏陰性菌細(xì)菌素和革蘭氏陽性菌細(xì)菌素24/68細(xì)菌素一、細(xì)菌素的分類類別特征細(xì)菌素Ⅰ

經(jīng)大范圍翻譯后修飾而成的核糖體小肽（相對(duì)分子量<5000）Ⅰa羊毛硫細(xì)菌素，含有羊毛硫氨酸、β-甲基羊毛硫氨酸等，能延伸并能在細(xì)胞膜形成孔洞的兩性分子乳酸鏈球菌素（Nisin）Ⅰb剛硬的球狀抗菌肽，帶負(fù)電或不帶電荷，能抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的形成美殺菌素Ⅱa小分子熱穩(wěn)定肽，由2個(gè)半胱氨酸所構(gòu)成的S-S鍵，有強(qiáng)烈抗李斯特菌的活性，N-末端氨基酸序列：YGNGVXC片球菌素PA-1米酒乳桿菌素P和A木柯霉素Ⅱ

具有膜活性，未被修飾的多肽（相對(duì)分子量<10000）Ⅱb由2個(gè)具有不同氨基酸序列的肽類寡聚體形成，一般需要2個(gè)肽段一起才能發(fā)揮活性腸球菌素P40Ⅱc以來Sec分泌途徑，N-末端和C-末端以共價(jià)鍵相連，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)格氏菌素4羅伊特菌素6Ⅲ大分子熱不穩(wěn)定肽（相對(duì)分子量>30000）瑞士乳菌素J瑞士乳菌素VⅣ細(xì)菌素和其他大分子組成的復(fù)合物乳酸菌細(xì)菌素的分類25/68細(xì)菌素一、細(xì)菌素的分類乳酸菌細(xì)菌素1.羊毛硫細(xì)菌素定義：一類小分子的修飾肽，含19~50個(gè)氨基酸分子，分子活性部位有羊毛硫氨酸、6-甲基羊毛硫氨酸、脫氫酪氨酸和脫氫丙氨酸等非編碼氨基酸，這些非編碼氨基酸形成了這類細(xì)菌素獨(dú)特的環(huán)狀剛性結(jié)構(gòu)。分類：Ia類為延伸的螺旋狀結(jié)構(gòu)，含21~38個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量為2100~3500,帶2~7個(gè)正電荷，具有兩親性，能在細(xì)菌質(zhì)膜上形成電位依賴性的孔洞，如著名的Nisin；

Ib類為球形分子，分子中不超過19個(gè)氨基酸殘基，相對(duì)分子質(zhì)量一般為1900~2100,帶負(fù)電荷或不帶電荷，如美殺菌素。26/68細(xì)菌素一、細(xì)菌素的分類乳酸菌細(xì)菌素2.不含羊毛硫氨酸的小分子熱穩(wěn)定肽定義：相對(duì)分子質(zhì)量小于10000,含37~48個(gè)氨基酸殘基，具有熱穩(wěn)定性。分類：na類為類片球菌素，氨基端都含有一段保守的序列(YGNGVXaaC),其中X代表任意氨基酸。

Hb類細(xì)菌素為含有2個(gè)不同肽鏈的寡聚體，需要2個(gè)肽鏈共同作用發(fā)揮抑菌活性，如LacticinF

nc類細(xì)菌素是依賴于Sec分泌途徑的細(xì)菌素（如AcidocinB）,它們的N-末端和C-末端以共價(jià)鍵相連，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。27/68細(xì)菌素一、細(xì)菌素的合成與分泌1.細(xì)菌素的合成

調(diào)控產(chǎn)生有活性的細(xì)菌素的基因都在操縱子簇上?；虼蟛糠治挥谫|(zhì)粒中，也有位于染色體上或轉(zhuǎn)座子（如Nisin）上。大多數(shù)典型的羊毛硫細(xì)菌素操縱子都屬于Ia類。所有類別的細(xì)菌素都是由核糖體合成的，但只有羊毛硫細(xì)菌素類須通過轉(zhuǎn)錄后修飾才能產(chǎn)生活性。2.翻譯后修飾形成有活性的細(xì)菌素

細(xì)菌素必須經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后修飾才能形成有效的轉(zhuǎn)錄本。編碼修飾酶的基因通常位于結(jié)構(gòu)基因附近。典型的細(xì)菌素合成方式是N-端的引導(dǎo)序列連著C-端的前體肽。通常前體肽在某一特定位點(diǎn)分裂去掉引導(dǎo)序列，形成有生物活性的分子，并將細(xì)菌素分泌到胞外。28/68細(xì)菌素一、細(xì)菌素的合成與分泌3.細(xì)菌素的跨膜運(yùn)輸（1）依賴轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體）系統(tǒng):主要可分成雙甘氨酸引導(dǎo)序列的細(xì)菌素和帶有不同的引導(dǎo)序列但非分泌引導(dǎo)序列的細(xì)菌素。雙甘氨酸引導(dǎo)序列的細(xì)菌素主要是II類細(xì)菌素，此外，還包括一些羊毛硫細(xì)菌素。細(xì)菌素分泌時(shí)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的水解結(jié)構(gòu)域與其前體肽的引導(dǎo)序列相結(jié)合，從而引發(fā)ATP水解和轉(zhuǎn)運(yùn)體構(gòu)象變化，最終使得引導(dǎo)序列分離脫去

（2）但是少數(shù)的II類細(xì)菌素是通過分泌依賴系統(tǒng)（Sec-dependentsystem）運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞外的。（3）成熟的細(xì)菌素分子跨過細(xì)胞質(zhì)膜分泌到細(xì)胞外。在細(xì)菌素分泌到胞外的過程中，還需要一個(gè)輔助蛋白。29/68細(xì)菌素三、細(xì)菌素的作用機(jī)制

乳酸菌細(xì)菌素可通過不同的機(jī)制產(chǎn)生抑菌效果，通常其目標(biāo)是細(xì)胞膜。細(xì)菌素作用的最初動(dòng)力是靶細(xì)胞膜和細(xì)菌素之間的靜電引力。不同類型的細(xì)菌素的作用機(jī)制是不同的。1.羊毛硫細(xì)菌素的作用機(jī)制（1）Ia類細(xì)菌素的作用機(jī)制之一是形成孔洞和抑制細(xì)胞壁合成。30/68細(xì)菌素三、細(xì)菌素的作用機(jī)制1.羊毛硫細(xì)菌素的作用機(jī)制（1）Ia類細(xì)菌素的作用機(jī)制之一是形成孔洞和抑制細(xì)胞壁合成。

①

Nisin具有雙重作用機(jī)制:①

nisin形成孔洞，引起跨膜電勢消失，使質(zhì)子動(dòng)力（PMF)喪失，由于細(xì)胞內(nèi)外pH不同而導(dǎo)致離子的泄漏和ATP的水解，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡；②

nisin也可以結(jié)合肽聚糖前體類脂II，從而干擾細(xì)胞壁的生物合成。

②nisin和Pep5還可誘導(dǎo)敏感的葡萄球菌細(xì)胞自溶，導(dǎo)致整個(gè)細(xì)胞壁的降解，這一反應(yīng)主要發(fā)生在分化子細(xì)胞的分隔區(qū)。

③

細(xì)菌素能釋放兩種細(xì)胞壁水解酶，N-乙酰胞壁酸-L-丙氨酸酰胺酶和N-乙酰葡萄糖苷酶，它們是很強(qiáng)的陽離子蛋白，經(jīng)靜電相互作用，與細(xì)胞壁中帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合。陽離子肽與細(xì)胞壁內(nèi)抑制物通過一個(gè)類似陽離子交換的過程把后者取代，然后酶被激活并快速裂解細(xì)胞。31/68細(xì)菌素三、細(xì)菌素的作用機(jī)制1.羊毛硫細(xì)菌素的作用機(jī)制（2）lb類羊毛硫抗生素主要包括肉桂霉素（cinnamycin)和mersacidin兩類，通過結(jié)合特異性膜脂發(fā)揮活性，它們也是酶抑制劑。

①肉桂霉素類細(xì)菌素通過與腦磷脂結(jié)合形成復(fù)合物，抑制磷酸解作用。

②Mersacidin的抑制肽聚糖的合成外，至細(xì)菌的細(xì)胞壁變薄。

32/68細(xì)菌素三、細(xì)菌素的作用機(jī)制2.不含羊毛硫氨酸的小分子熱穩(wěn)定細(xì)菌素的作用機(jī)制（1）這類細(xì)菌素主要通過形成孔洞，引起細(xì)胞膜溶解，消耗細(xì)胞內(nèi)ATP并導(dǎo)致氨基酸和離子的泄漏而殺死敏感細(xì)胞。（2）這類細(xì)菌素對(duì)單核細(xì)胞增生性李斯特菌的敏感性可能與其磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)EIItMan中的甘露醇透性酶有關(guān)。3.熱不穩(wěn)定的大分子蛋白質(zhì)類細(xì)菌素的作用機(jī)制（1）溶菌素(Bacteriolysins)就是熱不穩(wěn)定的大分子蛋白質(zhì)類細(xì)菌素，它能促進(jìn)細(xì)胞壁的溶解。（2）這些蛋白質(zhì)也是構(gòu)建細(xì)胞壁的成分，而且在N末端具有反應(yīng)區(qū)域，它們具有相同的肽鏈內(nèi)切酶，并且C末端可能具有目標(biāo)識(shí)別位點(diǎn)。33/68細(xì)菌素四、細(xì)菌素的免疫性

合成細(xì)菌素的細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)物具有免疫性是細(xì)菌素不同于抗生素的一種現(xiàn)象。編碼“免疫蛋白”的基因接近于細(xì)菌素其他的結(jié)構(gòu)基因和加工基因。細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)基因和免疫基因通常都位于同一個(gè)操縱子上，而且經(jīng)常是相鄰的。目前，大多數(shù)對(duì)細(xì)菌素的免疫性的研究都集中在Nisin和一些IIa類細(xì)菌素上。（1）羊毛硫細(xì)菌素的免疫性最初認(rèn)為是由于免疫基因的作用，如Nisin的nisl編碼nisl免疫蛋白。然而，細(xì)菌素的免疫性是幾種蛋白質(zhì)相互影響的結(jié)果，其他基因的刪除會(huì)導(dǎo)致宿主細(xì)胞免疫性的改變。（2）非羊毛硫細(xì)菌素類細(xì)菌素的免疫現(xiàn)象比較簡單，由一個(gè)基因編碼免疫蛋白。34/68細(xì)菌素五、細(xì)菌素的抗性機(jī)制

細(xì)菌素抗性通常和遺傳定子有關(guān)，它有利于細(xì)胞間、菌株和菌種間的抗性轉(zhuǎn)移。目前，大多數(shù)對(duì)細(xì)菌素的抗性機(jī)制的研究也都集中在羊毛硫細(xì)菌素Nisin和一些IIa類細(xì)菌素上。不像大多數(shù)抗生素抗性，細(xì)菌素抗性是靶細(xì)胞膜生理上改變的結(jié)果。是由于一種或多種酶或誘導(dǎo)肽的表達(dá)或失活。35/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素

IIa類細(xì)菌素在II類中數(shù)量最多且研究得也最多，目前為止發(fā)現(xiàn)的所有IIa類細(xì)菌素都有強(qiáng)烈的抗李斯特菌的活性。IIa類細(xì)菌素還可抑制某些食品中的腐敗菌，因而IIa類細(xì)菌素具有很好的控制食品腐敗菌及病原菌的潛在應(yīng)用前景。36/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素1.

IIa類細(xì)菌素的組成及主要結(jié)構(gòu)（1）IIa類細(xì)菌素通常包含37~48個(gè)殘基，并且擁有相似的氨基酸序列。N端有YGNGVX-aaC基團(tuán)，通常認(rèn)為這個(gè)基團(tuán)是膜結(jié)合蛋白受體的識(shí)別序列，隨著新的IIa類細(xì)菌素的發(fā)現(xiàn)，其N端基團(tuán)也可以表現(xiàn)為YGNGVXaaCXaa(K/N)XaaXaaCXaaV(N/D)(W/K/R)-Xaa(G/A/S)(A/N)。

（2）IIa類細(xì)菌素的一個(gè)重要特征是N端保守區(qū)中至少含有2個(gè)半胱氨酸，且這2個(gè)半胱氨酸形成了1個(gè)二硫鍵，二硫鍵的存在使得IIa類細(xì)菌素的N端具有兩親性結(jié)構(gòu)，而且二硫鍵的存在對(duì)IIa類細(xì)菌素抑制李斯特菌的活性是必需的。IIa類細(xì)菌素的C端只有34%~80.5%的序列相似性，C端是1個(gè)a螺旋的兩親性結(jié)構(gòu)，這個(gè)螺旋結(jié)構(gòu)在敏感菌細(xì)胞膜形成孔洞時(shí)可作為跨膜組分起作用。

括號(hào)中是很少變動(dòng)的殘基，大寫字母的殘基可能會(huì)被小寫字母的殘基替換，變化頻率高的殘基以Xaa表示37/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素2.

IIa類細(xì)菌素的產(chǎn)生菌株

所有的IIa類細(xì)菌素都是由與食品相關(guān)的乳酸菌菌株產(chǎn)生的，這些菌株分離自肉、乳制品和蔬菜制品等食品，如乳桿菌屬、腸球菌屬、片球菌屬、明串珠菌屬、肉食桿菌屬等。3.

IIa類細(xì)菌素的合成及分泌

一般情況下，細(xì)菌素的產(chǎn)生都與質(zhì)粒相關(guān)，但某些IIa類細(xì)菌素的編碼基因卻位于染色體片段上。編碼IIa類細(xì)菌素及其細(xì)菌素周邊結(jié)構(gòu)的基因，包括細(xì)菌素產(chǎn)生和跨膜定位、產(chǎn)生菌的免疫性方面的基因，以及細(xì)菌素生物合成的調(diào)控基因，形成了1~3個(gè)操縱子結(jié)構(gòu)。大部分IIa類細(xì)菌素的操縱子至少控制2個(gè)編碼與ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體及其輔助蛋白同源的蛋白質(zhì)基因，這些蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)菌素的膜外定位是必需的。38/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素3.

IIa類細(xì)菌素的合成及分泌

IIa類細(xì)菌素的合成過程跟其他細(xì)菌素相似，首先是由核糖體合成沒有生物活性的前體肽，前體肽的N端是引導(dǎo)序列，前體肽在某一特定位點(diǎn)分裂去掉引導(dǎo)序列形成有生物活性的分子并將細(xì)菌素分泌到胞外。加工分泌機(jī)制：三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體（ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體）系統(tǒng)、GSP系統(tǒng)。調(diào)控系統(tǒng)：包括誘導(dǎo)因子（IF）、組氨酸蛋白激酶（HPK）和反應(yīng)調(diào)節(jié)子（RR）,它們是誘導(dǎo)目標(biāo)基因進(jìn)行翻譯的信號(hào)。這個(gè)三組分系統(tǒng)可調(diào)控大部分IIa類細(xì)菌素的產(chǎn)生，也可共同指導(dǎo)。39/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素3.

IIa類細(xì)菌素的合成及分泌跨膜運(yùn)輸：由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體和1個(gè)輔助蛋白進(jìn)行的。IIa類細(xì)菌素的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白有著高度的同源性，C端有1個(gè)高度保守的ATP結(jié)合區(qū)，N端是1個(gè)疏水的膜結(jié)合區(qū)域，有1個(gè)長約150個(gè)氨基酸的延伸序列。這個(gè)結(jié)構(gòu)域可在引導(dǎo)序列的去除中發(fā)揮作用，在前體肽的分裂中作為識(shí)別信號(hào)，且在成熟分子的跨膜運(yùn)輸中也作為識(shí)別信號(hào)，兩者是一個(gè)同時(shí)發(fā)生的整體過程。細(xì)菌素分泌時(shí)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體的水解結(jié)構(gòu)域結(jié)合在前體肽的引導(dǎo)序列上，引發(fā)ATP水解，轉(zhuǎn)運(yùn)體構(gòu)象變化，使得引導(dǎo)序列分離，同時(shí)產(chǎn)生的成熟分子跨細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸?shù)桨狻?0/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素4.

IIa類細(xì)菌素產(chǎn)生菌的免疫性（1）很多IIa類細(xì)菌素產(chǎn)生菌可產(chǎn)生88~114個(gè)氨基酸的免疫蛋白，除了對(duì)菌體本身產(chǎn)生的細(xì)菌素具有完全免疫性之外，這個(gè)免疫蛋白對(duì)其他IIa類細(xì)菌素也有部分的抵抗作用。（2）

“交叉免疫性”：產(chǎn)生菌中存在的免疫基因不一定與編碼同源細(xì)菌素的基因之間有必然的聯(lián)系。（3）IIa類細(xì)菌素產(chǎn)生菌通?？刂浦粋€(gè)或多個(gè)IIa類細(xì)菌素的免疫基因，這些基因具有一定的同源性，且在不同情況下有不同程度的表達(dá)。相似的細(xì)菌素之間可能存在某種通用的靶物或“受體”。41/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素5.

抑菌譜（1）IIa類細(xì)菌素對(duì)乳桿菌、明串珠菌、片球菌、乳球菌、肉食桿菌、腸球菌、微球菌、葡萄球菌、鏈球菌、梭狀桿菌、芽孢桿菌、環(huán)絲菌(Brochothix)等種屬中的細(xì)菌表現(xiàn)敏感。另外，一些IIa類細(xì)菌素還可抑制梭狀桿菌的芽孢出芽和營養(yǎng)體的生長。（2）IIa類細(xì)菌素的N端有大量的序列相似性及相近的同源性，但在抑菌譜上它們有很多差異。（3）對(duì)李斯特菌有強(qiáng)烈的抑制活性是IIa類細(xì)菌素在抑菌譜上唯一明顯的共同特征。（4）IIa類細(xì)菌素從整體上來說，與其他類的細(xì)菌素如Nisin相比，抑菌譜較窄。42/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素6.

作用機(jī)制（1）

IIa類細(xì)菌素主要通過滲透到敏感細(xì)胞的細(xì)胞膜內(nèi)而起到殺死細(xì)胞的作用，使細(xì)胞形成孔洞，胞內(nèi)磷酸鹽滲漏，離子失去平衡。（2）IIa類細(xì)菌素不會(huì)引起ATP的泄漏。

43/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素6.

作用機(jī)制（1）IIa類細(xì)菌素?fù)?jù)推測其兩親性結(jié)構(gòu)使其可形成跨膜螺旋，在與膜結(jié)合時(shí)形成了“桶板”模型。

44/68細(xì)菌素六、IIa類細(xì)菌素6.

作用機(jī)制（1）IIa類細(xì)菌素作用于敏感菌細(xì)胞膜的最初步驟是帶正電荷、具疏水性的細(xì)菌素N端與膜的陰離子磷脂頭部極性殘基結(jié)合，通常發(fā)生在膜的陰離子磷脂頭部,隨后C端的疏水/兩親性結(jié)構(gòu)域和膜脂?；溨g發(fā)生疏水相互作用，然后整個(gè)分子插入膜中，形成水溶性孔洞。這個(gè)疏水結(jié)構(gòu)也許是IIa類細(xì)菌素的細(xì)胞特異性識(shí)別區(qū)域,這與結(jié)構(gòu)域和膜表面之間靜電作用的非特異性形成了對(duì)比。（2）IIa類細(xì)菌素使細(xì)胞死亡是以濃度和時(shí)間累積型的方式發(fā)生的，而且這個(gè)過程可被靶細(xì)胞或培養(yǎng)基所影響。

45/68胞外多糖六、IIa類細(xì)菌素（1）根據(jù)存在位置的不同，微生物多糖可分為細(xì)胞內(nèi)多糖、細(xì)胞壁多糖和細(xì)胞外多糖(ex-opolysaccharides，EPS)。（2）乳酸菌大量產(chǎn)生的多糖主要是胞外多糖。（3）胞外多糖的種類很多，按照所含糖苷基的情況可分為同型多糖（homopolysaccharides）和異型多糖（heteropo-lysaccharides）。

46/68胞外多糖六、IIa類細(xì)菌素（1）EPS被廣泛地用作食品工業(yè)中的增稠劑、凝膠劑以及穩(wěn)定劑。（2）其中最重要的應(yīng)用領(lǐng)域是乳制品工業(yè)，被用于生產(chǎn)不同質(zhì)地和口味的發(fā)酵乳制品。（2）乳酸菌EPS具有良好的生物活性，例如免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)胃腸道菌群等，對(duì)人類健康大有裨益。

47/68胞外多糖一、產(chǎn)EPS的菌株（1）產(chǎn)EPS的乳酸菌來源廣泛，絕大部分來源于乳制品，例如酸奶、開菲爾(Kefir)制品、奶酪等，還有一些來源于發(fā)酵肉制品和蔬菜等。（2）常見乳制品中的益生菌幾乎都產(chǎn)ESP。其中研究較多的是唾液鏈球菌嗜熱亞種篩選菌株S.salivariussubsp.thermophilusEU20,NCFB6893,IMDO01,SFi6,

SFi39和SFi12等；

48/68胞外多糖二、EPS的種類和結(jié)構(gòu)（1）按組成不同，乳酸菌產(chǎn)生的EPS可以分為三大類：

①葡聚糖類，如右旋糖苷（Dextran）、改性葡聚糖及變異聚糖（Mutans）;

②果聚糖類，如左聚糖（Levan）和菊粉（Inulin）;

③由嗜溫乳酸菌及嗜熱乳酸菌產(chǎn)生的雜多糖。49/68胞外多糖二、EPS的種類和結(jié)構(gòu)（1）葡聚糖是一種主要包括α-l,6鍵的葡聚糖。其主鏈由α-l,6鍵連接，支鏈由少量（約占5%）的α-1,3鍵連接。不同細(xì)菌產(chǎn)生的葡聚糖結(jié)構(gòu)存在差異。50/68胞外多糖二、EPS的種類和結(jié)構(gòu)（1）果聚糖具有多種分子結(jié)構(gòu)，由一個(gè)葡萄糖單位連接兩個(gè)或更多個(gè)果糖單位。51/68胞外多糖三、EPS的生物合成及遺傳調(diào)控（1）微生物胞外多糖的合成分為位于細(xì)胞壁外的同型多糖的合成與位于細(xì)胞膜上的異型多糖的合成。（2）同型多糖的合成為不依賴糖基載體酯(C55-lipid-p)的合成模式，異型多糖的合成則為依賴C55-lipid-p的合成模式。52/68胞外多糖三、EPS的生物合成及遺傳調(diào)控1.同型多糖的生物合成（1）同型多糖是在胞外合成的，合成體系包含糖基供體(蔗糖)、糖基受體及葡聚糖蔗糖酶。例如由腸膜明串珠菌生產(chǎn)的葡聚糖。（2）葡聚糖的合成屬單鏈反應(yīng)機(jī)制。（3）葡聚糖的合成特點(diǎn)是以蔗糖為唯一底物，合成所需的能量來自蔗糖的水解而不是糖基核苷酸，不需要脂載體和獨(dú)立的分支酶，產(chǎn)物分子質(zhì)量大。53/68胞外多糖三、EPS的生物合成及遺傳調(diào)控2.異型多糖的生物合成（1）異型多糖的生物合成過程比較復(fù)雜，涉及多種酶與蛋白質(zhì)。異型多糖的生物合成是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)由許多復(fù)合體聚合而成的。（2）異型多糖的合成體系除了具有糖基供體（糖核苷酸）、糖基受體（增長中的重復(fù)單元）外，還包括脂載體、?；w及酶系統(tǒng)。（3）異型多糖的生物合成是一個(gè)耗能過程。54/68胞外多糖三、EPS的生物合成及遺傳調(diào)控3.EPS的遺傳調(diào)控（1）EPS基因簇分為四個(gè)功能區(qū)域：中心區(qū)域，編碼EPS重復(fù)單元生物合成過程中必需的特異性糖基轉(zhuǎn)移酶的基因；中心區(qū)域兩側(cè)的2個(gè)區(qū)域，編碼在聚合和輸出過程中控制鏈長、輸出和聚合的酶的基因；位于基因簇開頭的調(diào)控基因區(qū)域。（2）提高EPS合成量的方法：①通過過量地表達(dá)涉及限制性步驟的磷酸葡萄糖變位酶、UDP-葡萄糖焦磷酸化酶或UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶；②在生物合成過程中多糖聚合作用的水平上，通過提高參與EPS聚合作用的糖基轉(zhuǎn)移酶的酶活性。55/68胞外多糖四、EPS的發(fā)酵生產(chǎn)3.EPS的遺傳調(diào)控（1）碳氮比(C/N)比較高的環(huán)境適合于產(chǎn)多糖微生物的生長。胞外多糖的產(chǎn)量會(huì)隨著碳氮比的增加而升高。（2）碳源的種類很多，如蔗糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖醇、山梨醇、等都可以用來生產(chǎn)微生物胞外多糖。。碳源影響胞外多糖的產(chǎn)量及其分子質(zhì)量。（3）氮源主要是硫酸銨、蛋白胨、硝酸鈉、尿素和酵母膏等。使用有機(jī)氮源會(huì)產(chǎn)生較高的比生長速率和胞外多糖產(chǎn)量，一些氮源中所含有的碳也可以作為胞外多糖合成的底物。添加復(fù)合氮源也有助于提高胞外多糖的產(chǎn)量。56/68胞外多糖四、EPS的發(fā)酵生產(chǎn)3.EPS的遺傳調(diào)控（1）其他條件對(duì)胞外多糖的產(chǎn)量也有影響。如攪拌速率、氧氣和通氣速率等。（2）培養(yǎng)基黏度的變化是微生物分泌胞外多糖的直接結(jié)果。（3）微生物胞外多糖的發(fā)酵一般可分為分批發(fā)酵和補(bǔ)料分批發(fā)酵過程，而微生物在其對(duì)數(shù)生長期并未同時(shí)合成胞外多糖，接種后的24h內(nèi)達(dá)到最大的生長速率(對(duì)數(shù)生長期)。（4）胞外多糖合成的最適溫度通常低于微生物的最適生長溫度。培養(yǎng)基中中性pH、滲透性、磷酸鹽含量和表面活性劑影響胞外多糖產(chǎn)量。57/68胞外多糖五、EPS的生物活性1.

益生作用（1）調(diào)節(jié)人體腸道菌群，促進(jìn)人體健康。（2）促進(jìn)菌體在腸黏膜上的非特異性黏附作用。（3）增加食品的黏度，使得發(fā)酵乳制品可以在胃腸道內(nèi)存留更長的時(shí)間。58/68胞外多糖五、EPS的生物活性2.

對(duì)腸道炎癥和癌癥的預(yù)防（1）作為結(jié)腸共生菌群的碳源，還可以調(diào)節(jié)結(jié)腸共生菌群的生長和代謝的激活，從而維持結(jié)腸的穩(wěn)態(tài)平衡。（2）其代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸可以被腸上皮細(xì)胞吸收，降低結(jié)腸的pH環(huán)境，使腸道內(nèi)容物的溶解度增加，并抑制二次膽酸的形成和減少不必要病原體的擴(kuò)散。（3）作為結(jié)腸的能量底物，增強(qiáng)將要產(chǎn)生病變細(xì)胞的免疫能力，使突變的腫瘤細(xì)胞凋亡或者向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并抑制致癌基因的表達(dá)，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎和結(jié)腸癌的預(yù)防具有重要作用。59/68胞外多糖五、EPS的生物活性3.

免疫刺激活性（1）胞外多糖在其免疫增強(qiáng)活性中扮演了重要的角色，能增強(qiáng)某些特定抗體活性和刺激巨噬細(xì)胞釋放細(xì)胞因子而增強(qiáng)免疫活性。4.腫瘤抑制活性（1）糖抗腫瘤活性與其分子量、單糖組成、分支度、分子構(gòu)象、糖苷鍵的構(gòu)型、溶解度、黏度等有關(guān)，但主要與其立體構(gòu)型有關(guān)。（2）目前尚未發(fā)現(xiàn)較為統(tǒng)一的構(gòu)效關(guān)系，不同種類的多糖的抗癌活性結(jié)構(gòu)可能有所不同，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)水解殼聚糖使其分子量變小后抗癌活性增強(qiáng)。60/68胞外多糖五、EPS的生物活性4.

腫瘤抑制活性（1）多糖受體的發(fā)現(xiàn)對(duì)闡明多糖的作用機(jī)制有重要意義。61/68胞外多糖五、EPS的生物活性4.

腫瘤抑制活性（1）多糖分子可能存在一個(gè)或幾個(gè)寡糖片斷的“活性中心”，多糖與受體作用時(shí)，只有分子中的“活性中心”與受體結(jié)合,因而在保持完整的“活性中心”的前提下，小分子量的多糖可能具有良好的生物學(xué)活性。。（2）目前尚未發(fā)現(xiàn)較為統(tǒng)一的構(gòu)效關(guān)系，不同種類的多糖的抗癌活性結(jié)構(gòu)可能有所不同，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)水解殼聚糖使其分子量變