高級食品微生物學(xué)- 課件 第九章 微生物的系統(tǒng)生物學(xué)研究技術(shù)

第九章微生物的系統(tǒng)生物學(xué)研究技術(shù)1/34目錄CONTENTS2/34蛋白質(zhì)組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)微生物基因組學(xué)人體微生態(tài)研究前沿3/34生物系統(tǒng)是一個(gè)非常復(fù)雜的體系。首先，在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)，儲存信息的基因表達(dá)出有生物功能的蛋白質(zhì)以及代謝子，然后，這些基本成分形成高層次的調(diào)控模體和代謝通路，大量的模體和通路進(jìn)一步構(gòu)成基本的功能模塊，最后，多個(gè)功能模塊組成更復(fù)雜的大尺度多細(xì)胞生物網(wǎng)絡(luò)。系統(tǒng)生物學(xué)：系統(tǒng)生物學(xué)是研究系統(tǒng)組成成分的構(gòu)成與相互關(guān)系的結(jié)構(gòu)、動態(tài)與發(fā)生，以系統(tǒng)論和實(shí)驗(yàn)、計(jì)算方法整合研究為特征的新型學(xué)科，由基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)組、代謝組等構(gòu)成，其最大的特點(diǎn)在于全域性，具有典型的多學(xué)科交叉研究的特點(diǎn)，可以在整體規(guī)模上描述生物反應(yīng)過程及其調(diào)控機(jī)制，因此，系統(tǒng)生物學(xué)又被稱為組學(xué)時(shí)代的代謝工程人體微生態(tài)前沿4/34意義：建立在全基因組序列基礎(chǔ)上的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，通過整合其他組學(xué)數(shù)據(jù)和生物信息學(xué)的研究策略，可讓研究者從全基因組規(guī)模去全面理解微生物發(fā)生在基因、蛋白質(zhì)、生化反應(yīng)、代謝產(chǎn)物等層次上的時(shí)序變化；全面理解細(xì)胞的代謝網(wǎng)絡(luò)、調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)以及遺傳和環(huán)境擾動對細(xì)胞全局代謝的影響，并在此基礎(chǔ)上發(fā)展代謝工程策略，從而為從整體水平上闡明微生物生理活動規(guī)律及定向改善微生物細(xì)胞的表型和生產(chǎn)性狀創(chuàng)造了可能。因此，綜合運(yùn)用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)來闡釋和解析微生物的生理和功能已成為研究熱點(diǎn)問題人體微生態(tài)前沿5/34微生物基因組學(xué)一、基因組學(xué)的概念基因組學(xué)(Genomics)是指對所有基因進(jìn)行基因組繪圖(包括遺傳圖譜、物理圖譜、轉(zhuǎn)錄本圖譜)、核苷酸序列分析、基因定位和基因功能分析的一門科學(xué)。研究范圍：以全基因組測序?yàn)槟繕?biāo)的結(jié)構(gòu)基因組學(xué)(StructuralGenomics)和以基因功能鑒定為目標(biāo)的功能基因組學(xué)(FunctionalGenomics),又被稱為后基因組(Postgenome)研究。特點(diǎn)：與傳統(tǒng)的分子生物學(xué)方法進(jìn)行的研究相比，基因組學(xué)研究是通過結(jié)合全基因組序列信息和生物體的功能和結(jié)構(gòu)，從基因組水平去認(rèn)識和理解整個(gè)生物體的生理和行為，因而具有更全面、深刻、細(xì)致等顯著特點(diǎn)。6/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義1、研究意義微生物是指一切肉眼看不見或看不清的微小生物的統(tǒng)稱，包括細(xì)菌、病毒、真菌和少數(shù)藻類等。微生物相對于其他生物體而言，結(jié)構(gòu)簡單、基因組較小，對其整體的基因調(diào)控和代謝網(wǎng)絡(luò)的研究將給基因組學(xué)的研究開辟出一條新的道路，也將極大地促進(jìn)發(fā)酵業(yè)、制藥業(yè)、疫苗生產(chǎn)、環(huán)保產(chǎn)業(yè)等工農(nóng)業(yè)的發(fā)展。微生物基因組的研究成果不僅可以極大地推動理論科學(xué)的發(fā)展，還能以多種形式廣泛地應(yīng)用于人類生產(chǎn)生活中，對人類生活所產(chǎn)生的影響也是難以估計(jì)的。微生物基因組學(xué)7/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、發(fā)展現(xiàn)狀1995年，采用全基因組隨機(jī)測序法(Whole-GenomeShotgunSequencing)成功地完成了流感嗜血桿菌全基因組序列測定和組裝。截至2014年1月，已經(jīng)完成的細(xì)菌基因組有4419個(gè)，正在測序的超過300個(gè)。2007年底，美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)宣布將投入1.15億美元啟動“人類微生物組計(jì)劃”。目標(biāo)是通過繪制人體不同器官中微生物元基因組圖譜，解析微生物菌群結(jié)構(gòu)變化對人類健康的影響。2009年8月1日，來自國內(nèi)二十多家科研機(jī)構(gòu)的中國科學(xué)家共同發(fā)起“萬種微生物基因組計(jì)劃”，該計(jì)劃的研究領(lǐng)域涵蓋了工業(yè)微生物、農(nóng)業(yè)微生物、醫(yī)學(xué)微生物等，研究種類包括古細(xì)菌、細(xì)菌、真菌、藻類和病毒，項(xiàng)目的終極目標(biāo)是建立一個(gè)中國微生物資源的基因組百科全書。微生物基因組學(xué)8/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、微生物全基因組測序策略Sanger發(fā)明了具有里程碑意義的末端終止測序法，同年，Maxam和Gilbert等發(fā)明了化學(xué)降解法。此后，在Sanger法的基礎(chǔ)上，20世紀(jì)80年代中期出現(xiàn)了以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記、以熒光信號接收器和計(jì)算機(jī)信號分析系統(tǒng)代替放射性自顯影的自動測序儀。另外，20世紀(jì)90年代中期出現(xiàn)的毛細(xì)管電泳技術(shù)使得測序的通量大為提高?；谏鲜龇椒ǎ谝淮蚪M測序策略主要有兩種：以克隆為基礎(chǔ)的鳥槍法測序(Clone-basedShotgunSequencing)和全基因組鳥槍測序法(WholeGenomeShot-gunSequencing)。微生物基因組學(xué)9/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、微生物全基因組測序策略基于上述方法，第一代全基因組測序策略主要有兩種：以克隆為基礎(chǔ)的鳥槍法測序(Clone-basedShotgunSequencing)和全基因組鳥槍測序法(WholeGenomeShot-gunSequencing)。以克隆為基礎(chǔ)的鳥槍法測序是先將基因組分離構(gòu)建BAC文庫，制作基因組的物理圖譜，然后挑選出一些重疊效率較高的克隆群，再對這些克隆進(jìn)行鳥槍法隨機(jī)測序。全基因組鳥槍測序法是直接將全基因組隨機(jī)打斷成小片段DNA,構(gòu)建質(zhì)粒文庫，然后對質(zhì)粒兩端進(jìn)行隨機(jī)測序。與前一種方法相比，該法省去了復(fù)雜的構(gòu)建物理圖譜的過程，能夠快速地對基因組進(jìn)行測序。微生物基因組學(xué)10/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、微生物全基因組測序策略隨著測序技術(shù)的改進(jìn)，成熟的第二代測序儀推出。第二代測序技術(shù)的核心思想是邊合成邊測序(SequencingbySynthesis),即通過捕捉新合成的末端的標(biāo)記來確定DNA的序列，現(xiàn)有的技術(shù)平臺主要包括454FLX、SolexaGenomeAnalyzer和SOLIDsystemo。優(yōu)點(diǎn):454FLX的測序片段比較長，片段(Read)能達(dá)到400bp;Solexa測序性價(jià)比最高，不僅機(jī)器的售價(jià)比其他兩種低，而且運(yùn)行成本也低，在數(shù)據(jù)量相同的情況下，成本只有454測序的1/10；SOLID測序的準(zhǔn)確度高，原始堿基數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度大于99.94%,而在15X覆蓋率時(shí)的準(zhǔn)確度可以達(dá)到99.999%,是目前第二代測序技術(shù)中準(zhǔn)確度最高的。微生物基因組學(xué)11/34二、微生物基因組學(xué)發(fā)展現(xiàn)狀及研究意義2、微生物全基因組測序策略目前，以單分子測序?yàn)橹饕卣鞯牡谌鷾y序技術(shù)已經(jīng)初現(xiàn)端倪。第三代測序技術(shù)解決了錯誤率的問題，通過增加熒光的信號強(qiáng)度及提高儀器的靈敏度等方法，使測序不再需要PCR擴(kuò)增這個(gè)環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)了單分子測序，并繼承了高通量測序的優(yōu)點(diǎn)。盡管第三代測序技術(shù)尚處于研發(fā)及應(yīng)用的初級階段，然而新的測序技術(shù)的不斷發(fā)明，將為全球范圍內(nèi)的微生物基因組學(xué)研究帶來前所未有的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。同時(shí)，幾種測序技術(shù)之間互相補(bǔ)充和結(jié)合將給微生物基因組學(xué)的研究帶來全新的變革。微生物基因組學(xué)12/34一、蛋白質(zhì)組概念蛋白質(zhì)組(Proteome)的概念在1994年首次提出，是指由一個(gè)細(xì)胞、一個(gè)組織或有機(jī)體所表達(dá)的全部的蛋白質(zhì)。傳統(tǒng)的分析蛋白質(zhì)的方法是通過對單個(gè)蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析，包括分析酶的活性以及對細(xì)胞過程的影響等等。而蛋白質(zhì)組是一個(gè)整體的概念，是應(yīng)用二維凝膠電泳、質(zhì)譜和生物信息學(xué)等分析技術(shù)從整體上研究蛋白質(zhì)在復(fù)雜的細(xì)胞環(huán)境中的功能。根據(jù)其研究內(nèi)容主要分為結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)組學(xué)和功能蛋白質(zhì)組學(xué)，研究的熱點(diǎn)主要集中于三個(gè)方面：針對有關(guān)基因組或轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的生物體或組織細(xì)胞,建立蛋白質(zhì)組或亞蛋白質(zhì)組的組成性蛋白質(zhì)組學(xué)；以重要生命過程或重大疾病為對象,進(jìn)行重要生理病理狀態(tài)或過程的比較蛋白質(zhì)組學(xué)；通過多種先進(jìn)技術(shù)研究蛋白質(zhì)之間的相互作用，繪制某個(gè)體系的蛋白質(zhì)，即相互作用蛋白質(zhì)組學(xué)等。蛋白組學(xué)13/34二、蛋白質(zhì)組學(xué)原理及研究的基本流程蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展有賴于對基因表達(dá)產(chǎn)物一蛋白質(zhì)進(jìn)行高效率的大規(guī)模的分離與鑒定。蛋白質(zhì)組分析常用技術(shù)手段包括：①蛋白質(zhì)分離技術(shù)，如雙向凝膠電泳；②蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)，如質(zhì)譜技術(shù)、蛋白質(zhì)和多肽的C端、N端測序等；③用于蛋白質(zhì)相互作用，如酵母雙雜交技術(shù)等；④生物信息學(xué)技術(shù)等。較為傳統(tǒng)的方法是采用雙向電泳技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)分離，再通過質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。蛋白組學(xué)14/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)1、蛋白質(zhì)提取技術(shù)通常選擇細(xì)胞或組織中的全部蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。制備合適的蛋白質(zhì)樣品是蛋白質(zhì)組研究的關(guān)鍵，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌瑯悠愤x擇合理的蛋白質(zhì)提取分離方法，盡可能提高樣品的溶解度，抽提最大量的蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)的損失。同時(shí),在蛋白質(zhì)提取時(shí)，為降低樣品的復(fù)雜性，可以通過順序抽提法、亞細(xì)胞分離技術(shù)等手段對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)分離。一般而言，蛋白質(zhì)組樣品的制備過程主要包含裂解細(xì)胞或組織樣品，對蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解、變性和解聚，去除非蛋白質(zhì)成分，提取全部蛋白質(zhì)。蛋白組學(xué)15/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)1、蛋白質(zhì)提取技術(shù)通常選擇細(xì)胞或組織中的全部蛋白質(zhì)組分進(jìn)行蛋白質(zhì)組分析。制備合適的蛋白質(zhì)樣品是蛋白質(zhì)組研究的關(guān)鍵，必須根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮筒煌瑯悠愤x擇合理的蛋白質(zhì)提取分離方法，盡可能提高樣品的溶解度，抽提最大量的蛋白質(zhì)，減少蛋白質(zhì)的損失。同時(shí),在蛋白質(zhì)提取時(shí)，為降低樣品的復(fù)雜性，可以通過順序抽提法、亞細(xì)胞分離技術(shù)等手段對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行預(yù)分離。一般而言，蛋白質(zhì)組樣品的制備過程主要包含裂解細(xì)胞或組織樣品，對蛋白質(zhì)進(jìn)行溶解、變性和解聚，去除非蛋白質(zhì)成分，提取全部蛋白質(zhì)。蛋白組學(xué)16/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)2、蛋白質(zhì)檢測技術(shù)蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，雙向凝膠電泳(2-DE)是目前應(yīng)用最為廣泛的研究方法。其原理是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子質(zhì)量特性區(qū)分各種蛋白質(zhì)，第一向是等電聚焦(IEF)電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離。每個(gè)蛋白質(zhì)都是兩性分子，在不同的pH條件下可能帶正電荷、負(fù)電荷或不帶電荷，在進(jìn)行電泳的過程中，它們會自動遷移到使其自身靜電荷為零的pH，所以在電場的作用下，不同的蛋白點(diǎn)聚焦到不同的位置。第二向是二十烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)，根據(jù)蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量不同分離蛋白質(zhì),通過二維電泳可以將復(fù)雜的蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行分離。雖然二維凝膠電泳難以檢測到低豐度蛋白質(zhì)以及一些疏水性蛋白質(zhì)，對操作的要求也較高，但其通量高、分辨率和重復(fù)性好以及可與質(zhì)譜連用的特點(diǎn)，使其成為常用的一種技術(shù)手段。蛋白組學(xué)17/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)2、蛋白質(zhì)檢測技術(shù)差異凝膠電泳(DIGE)是對2-DE在技術(shù)上的改進(jìn)，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?即在同一塊膠上共同分離多個(gè)分別由不同熒光標(biāo)記的樣品，采用不同的熒光標(biāo)記混合后進(jìn)行2-DE來檢測蛋白質(zhì)在兩種樣品中的表達(dá)情況，極大地提高了結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性和可重復(fù)性。在該技術(shù)中，由于每個(gè)蛋白點(diǎn)都有它自己的內(nèi)標(biāo)，且軟件可全自動地根據(jù)每個(gè)蛋白點(diǎn)的內(nèi)標(biāo)對其表達(dá)量進(jìn)行校準(zhǔn)，保證了所檢測到的蛋白質(zhì)豐度變化的真實(shí)性。蛋白組學(xué)18/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)3、凝膠染色方法在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，凝膠的染色方法有考馬斯亮藍(lán)染色法、銀染法、熒光染色法、同位素標(biāo)記法。其中比較常用的是銀染法和考馬斯亮藍(lán)染色法，考馬斯亮藍(lán)染色法的靈敏性可以達(dá)到微克水平，而且使用該方法的成本較低，與后續(xù)質(zhì)譜鑒定方法具有相容性。相比而言，銀染法比考馬斯亮藍(lán)染色法具有更高的靈敏度，但是染色步驟比較復(fù)雜，對后續(xù)的圖譜分析以及質(zhì)譜鑒定有一定的影響。蛋白組學(xué)19/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)質(zhì)譜技術(shù)是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最為常用的技術(shù)。選擇雙向電泳凝膠圖中感興趣的蛋白點(diǎn)，切膠并經(jīng)過酶解后用質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行鑒定。其基本原理是蛋白質(zhì)分子經(jīng)過離子化后，根據(jù)不同離子之間質(zhì)量電荷比的差異分離確定蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量，從而可以得到蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量等信息，確定蛋白質(zhì)的種類。用來分析蛋白質(zhì)和肽樣品的離子化技術(shù)主要包括電噴霧電離（ESI）和基質(zhì)輔助激光解析（MALDI）兩種電離技術(shù),此外，還包括同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)和多維液相色譜技術(shù)等。蛋白組學(xué)20/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）是近年來發(fā)展起來的一種生物質(zhì)譜技術(shù)，具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和較高的分辨率。MALDI的電離方式是Karas和Hillenkamp于1988年提出的。MALDI的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子（尼古丁酸及其同系物）中并形成晶體，當(dāng)用激光（337nm的氮激光）照射晶體時(shí)，基質(zhì)分子吸收激光能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移，使樣品分子電離。它從固相標(biāo)本中產(chǎn)生離子，并在飛行管中測定其分子質(zhì)量，MALDI-TOF-MS-般用于肽質(zhì)量指紋圖譜，非常快速（每次分析只需3~5min）、靈敏達(dá)到飛摩爾（fmol）水平,可以精確測量肽段質(zhì)量。但是如果在分析前不修飾肽段，MALDI-TOF-MS不能給出肽片段的序列。蛋白組學(xué)21/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）,利用較高的電場使樣品離子化，常用于一些復(fù)雜蛋白質(zhì)的分離鑒定。ESI-MS是利用高電場使質(zhì)譜進(jìn)樣端的毛細(xì)管柱流出的液滴帶電，在N2氣流的作用下，液滴溶劑蒸發(fā)，表面積縮小，表面電荷密度不斷增加，直至產(chǎn)生的庫侖力與液滴表面張力達(dá)到雷利極限，液滴爆裂為帶電的子液滴。這一過程不斷重復(fù)，使最終的液滴非常細(xì)小，呈噴霧狀，這時(shí)液滴表面的電場非常強(qiáng)大，使分析物離子化,并以帶單電荷或多電荷的離子形式進(jìn)入質(zhì)量分析器。ESI-MS從液相中產(chǎn)生離子。一般說來，肽段的混合物經(jīng)過液相色譜分離后，經(jīng)過偶聯(lián)的與在線連接的離子阱質(zhì)譜分析,給出肽片段的精確的氨基酸序列，但是，分析時(shí)間一般較長。蛋白組學(xué)22/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)同位素標(biāo)記親和標(biāo)簽技術(shù)（ICAT）是差異蛋白質(zhì)組研究技術(shù)中的核心技術(shù)之一,分別用含有輕重同位素的兩種標(biāo)記分子對比較研究樣品中的半胱氨酸進(jìn)行標(biāo)記，然后對混合的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。用具有不同質(zhì)量的同位素親和標(biāo)簽（IcATs）標(biāo)記處于不同狀態(tài)下的細(xì)胞中的半胱氨酸，利用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，對混合的樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析。蛋白組學(xué)23/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)4、蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)多維液相色譜技術(shù)（MLC）是與串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的2D-LC-MS/MS,可以檢測動態(tài)范圍10000:1內(nèi)的低豐度肽段，是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究最主要的技術(shù)路線。該技術(shù)可快速、高通量地鑒定復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物。最常用的是離子交換色譜-反相液相色譜的聯(lián)用，實(shí)現(xiàn)對復(fù)雜生物樣品的二維分離。而多維蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)（MudPIT）是將不同分離模式的色譜柱以串聯(lián)的方式合并于同一根色譜柱中進(jìn)行的。該方法可對樣品量較少的蛋白質(zhì)進(jìn)行快速分析，適用并且已經(jīng)成功應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)中大規(guī)模蛋白質(zhì)的分離鑒定。蛋白組學(xué)24/34三、蛋白質(zhì)組學(xué)主要技術(shù)5、生物信息學(xué)分析生物信息學(xué)是蛋白質(zhì)組學(xué)研究中不可缺少的一部分，把基因組DNA序列信息分析作為源頭，找到基因組序列中代表蛋白質(zhì)和RNA基因的編碼區(qū)，在此基礎(chǔ)上，歸納、整理與基因組遺傳信息釋放及其調(diào)控相關(guān)的轉(zhuǎn)錄譜和蛋白質(zhì)譜的數(shù)據(jù)，從而認(rèn)識代謝、發(fā)育、分化、進(jìn)化的規(guī)律，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定所得到的數(shù)據(jù)通過在數(shù)據(jù)庫中搜索得到基本的注釋信息，然后利用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)和功能。蛋白質(zhì)鑒定數(shù)據(jù)庫包括SWISSPROT、InterPro、UniProt、蛋白質(zhì)功能分類數(shù)據(jù)庫COG、蛋白質(zhì)生物途徑檢索數(shù)據(jù)庫KEGG等。計(jì)算機(jī)分析軟件主要有蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜分析軟件PDQuest、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和物理信息分析-蛋白質(zhì)專家分析系統(tǒng)ExPASy、蛋白質(zhì)細(xì)胞定位分析Psort等。蛋白組學(xué)25/34一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)1、轉(zhuǎn)錄組的概念轉(zhuǎn)錄組是指在某一時(shí)間點(diǎn)生物體細(xì)胞內(nèi)全部基因轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的RNA的總稱。通過完成對轉(zhuǎn)錄組的分析，可以高通量地獲得有關(guān)基因組內(nèi)全部基因的RNA表達(dá)水平信息，可以發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)水平與某些細(xì)胞表型之間的內(nèi)部關(guān)系。整個(gè)轉(zhuǎn)錄組分析的主要目標(biāo)是：對所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分類；確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，如其起始位點(diǎn)、5'和3'末端、剪接模式和其他轉(zhuǎn)錄后修飾；并量化各轉(zhuǎn)錄本在發(fā)育過程中和不同條件下表達(dá)水平的變化。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)26/34一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)2、轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)主要有基因表達(dá)系列分析(SerialAnalysisofGeneExpression，SAGE)、基因芯片(Microarray)、大規(guī)模平行測序(MassivelyParallelSignatureSequencing,MPSS)以及目前應(yīng)用最深入的RNA測序(RNA-sequencing,RNA-seq)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)27/34一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)基因芯片技術(shù)，此技術(shù)可以將樣品RNA轉(zhuǎn)錄成帶有熒光標(biāo)記的cDNA,這些帶有標(biāo)記的核苷酸序列可與基因芯片某一特定位點(diǎn)上的探針進(jìn)行雜交，通過測定雜交信號的強(qiáng)弱就可以檢測樣品細(xì)胞內(nèi)各基因的表達(dá)水平差異。這一技術(shù)的不足在于對目的基因的檢測數(shù)量及靈敏度有限，對某些異常轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物如多順反子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、融合基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物等難以檢測。SAGE不需任何基因序列的信息,能夠全局性地檢測所有基因的表達(dá)水平，除了具有顯示基因差異表達(dá)譜的作用外，還對那些未知基因特別是那些低拷貝基因的發(fā)現(xiàn)起到了巨大的推動作用。MPSS技術(shù)是對SAGE技術(shù)的改進(jìn)，簡化了測序過程，提高了精度，但二者都是基于昂貴的第一代DNA測序技術(shù)(Sanger測序)，需要大量的測序工作，技術(shù)難度較大，而且涉及酶切、PCR擴(kuò)增、克隆等可能會產(chǎn)生堿基偏向性的操作步驟，因而限制了其推廣。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)28/34一、轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)RNA-seq通過完成對細(xì)胞轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測序工作，對每條序列獲得的每個(gè)具體轉(zhuǎn)錄樣本的表達(dá)水平進(jìn)行分析統(tǒng)計(jì)，完成對表達(dá)譜的精密數(shù)字化分析檢測。RNA-seq的主要流程包括：首先，對細(xì)胞中的全部轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫；然后，對其中的DNA進(jìn)行隨機(jī)剪切，獲得小片段的DNA（依據(jù)所采用測序方法的測序長度決定這些片段的長度）；最后對這些片段進(jìn)行高通量測序，直至得到分析所需的足夠的序列信息。RNA-seq優(yōu)點(diǎn)，可以獲得利用基因芯片技術(shù)難以檢測的序列，如可變轉(zhuǎn)錄剪接序列；可以更加精確地檢測某些低表達(dá)水平的基因，并且可以對其轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行定量；還可以克服某些序列的多態(tài)性核苷酸和G+C含量差異對試驗(yàn)過程的影響，提高檢測轉(zhuǎn)錄本的準(zhǔn)確性和特異性。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)29/34二、代謝組學(xué)技術(shù)1、代謝組學(xué)概念代謝組學(xué)（Metabolomics）是繼基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)后新近發(fā)展起來的一門學(xué)科，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分。之后得到迅速發(fā)展，并滲透到多個(gè)領(lǐng)域，例如疾病診斷、醫(yī)藥研制開發(fā)、營養(yǎng)食品科學(xué)、毒理學(xué)、環(huán)境學(xué)，植物學(xué)等與人類健康護(hù)理密切相關(guān)的領(lǐng)域。細(xì)胞內(nèi)許多生命活動是發(fā)生在代謝物層面的，如細(xì)胞信號釋放(Cellsignaling),能量傳遞、細(xì)胞間通信等都是受代謝物調(diào)控的。代謝組學(xué)正是研究在某一時(shí)刻細(xì)胞內(nèi)所有代謝物的集合一代謝組(Metabolome)的一門學(xué)科。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)30/34二、代謝組學(xué)技術(shù)2、代謝組學(xué)特點(diǎn)代謝組學(xué)是一個(gè)正在快速發(fā)展的技術(shù)平臺，其研究對象包括細(xì)胞提取物、生物體液(如血液、尿液)或者組織提取液中所有的小分子代謝產(chǎn)物。因?yàn)闃悠穪碓春头治瞿康牟煌瑢ζ溥M(jìn)行采集和處理的手段各異，涉及的流程包括樣品的采集和處理制備、代謝產(chǎn)物檢測和分析鑒定、數(shù)據(jù)處理和解釋。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)31/34二、代謝組學(xué)技術(shù)3、代謝組學(xué)研究技術(shù)目前，在代謝組學(xué)中較為常見的分析手段有色譜、質(zhì)譜、核磁共振、紫外吸收、放射性檢測、庫侖分析及紅外光譜等。由于沒有一種分析手段能檢測出所有種類的化合物，所以一個(gè)好的、現(xiàn)實(shí)的代謝組學(xué)分析手段應(yīng)盡可能滿足分析生物體系(如體液和細(xì)胞)中的所有代謝產(chǎn)物這一要求，應(yīng)根據(jù)樣品的性質(zhì)及研究目的來選擇并綜合利用多種技術(shù)平臺。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)32/34二、代謝組學(xué)技術(shù)3、代謝組學(xué)研究技術(shù)核磁共振(Nuclearmagneticresonance，NMR)是應(yīng)用最早、最為常見的技術(shù)之一。NMR技術(shù)對樣品的需求量少、幾乎不需要對樣品進(jìn)行前處理。此外，由于NMR的非破壞性、非侵入性，特別是最近開發(fā)的魔角旋轉(zhuǎn)(MagicAngleSpinning,MAS)磁共振、磁共振成像(MagneticRresonanceimaging,MRI)和活體