糖尿病視網(wǎng)膜mller細胞的病理改變

糖尿病視網(wǎng)膜mller細胞的病理改變

糖尿病性視網(wǎng)膜病變（iii）是糖尿病的嚴重并發(fā)癥。人們普遍認為，針灸主要是視網(wǎng)膜。微血管病變,但目前許多臨床及實驗性糖尿病動物模型研究發(fā)現(xiàn):在DR微血管病變發(fā)生以前,神經(jīng)視網(wǎng)膜已有病理改變。本實驗通過觀察3個月糖尿病鼠視網(wǎng)膜Müller細胞超微結構的變化,GFAP、VEGF表達的改變,以及AGEs對體外純化培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜Müller細胞活性的影響,旨在研究糖尿病視網(wǎng)膜Müller細胞的病理改變及其機制,初步探討Müller細胞損傷在DR中的作用,從而更好地了解DR的發(fā)病機制。1材料和方法1.1實驗動物雄性成年SD大鼠20只(復旦大學放射醫(yī)學研究所動物部),體重(200±20)g,隨機分為正常對照組6只,糖尿病組14只。1.2實驗細胞和培養(yǎng)基抗兔IgG-FITC二抗、抗鼠IgG-Cy3二抗(華美生物工程公司),鏈脲菌素(STZ)、小鼠抗大鼠GFAPIgG抗體、兔抗大鼠VEGFIgG抗體(Sigma公司),DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(Gibco公司),JEB-1200EX透射電鏡。1.3糖尿病大鼠成模試驗糖尿病組14只雄性大鼠腹腔注射STZ(65mg/kg,0.1mmol/L檸檬酸鈉緩沖液,pH4.0),對照組注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液,72h后,血糖大于17mmol/L為糖尿病鼠,有10只大鼠成模,其中1只糖尿病鼠在飼養(yǎng)期間死亡。3個月后麻醉下處死,摘除眼球,3只糖尿病鼠及1只正常對照組視網(wǎng)膜組織作電鏡觀察,其余6只糖尿病鼠及5只對照組,左眼球作冰凍切片(10μm)。1.4蛋白質質量濃度檢測AGE-BSA的制備將質量分數(shù)為5%的無球蛋白的牛血清白蛋白與0.5mol/LD-葡萄糖和1.0mol/L苯甲基磺酰氟共同溶解于0.2mol/L磷酸緩沖液中,過濾除菌后置37℃孵箱內孵化90d。然后在4℃PBS溶液中透析72h,測定葡萄糖濃度為零,考馬斯亮藍方法定量蛋白質質量濃度,熒光分光光度計鑒定AGE-BSA。AGE-BSA對照物的制備:除不加葡萄糖外,其他材料及方法同上。1.5gfapg抗體檢測糖尿病鼠眼球冰凍切片用VEGFIgG抗體、GFAPIgG抗體雙標染色,二抗用抗兔IgG-FITC及抗鼠IgG-Cy3,染色程序同常規(guī)免疫組織化學染色。激光共聚焦顯微鏡下觀察照相。1.6視網(wǎng)膜組織電鏡觀察取視網(wǎng)膜組織,2.5%戊二醛、1%鋨酸固定,JEB-1200EX透射電鏡觀察照相。1.7視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞內皮細胞的制備出生5～7dSD乳鼠無菌條件下斷頭處死,鈍性分離視網(wǎng)膜,0.125%胰蛋白酶37℃條件下消化20min,含血清的培養(yǎng)液終止消化,1000r/min離心5min,除去上清液,加入培養(yǎng)液(80%DMEM,20%胎牛血清)吹打使之成為細胞懸液,調整培養(yǎng)液量使細胞密度為3×105/mL,接種于包被鼠尾膠的40mL培養(yǎng)瓶,于37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。24h后反復吹打除去漂浮的視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞及血管內皮細胞。細胞融合后傳代,選取2～4代細胞進行鑒定和實驗。1.8視網(wǎng)膜中的最小細胞免疫組織化學預先在24孔培養(yǎng)板中置入蓋玻片,細胞貼壁融合后PBS沖洗,4%多聚甲醛固定,用ABC法進行GFAP免疫組織化學鑒定。1.9最大od值的測定細胞以4×103/孔接種于96孔培養(yǎng)板,實驗組與對照組各4孔,2h后分別在實驗組、對照組加入AGEs及其對照物2500μg/mL,培養(yǎng)20h后加入MTT(1.5mg/mL,PBS配制)20μL/孔,4h后在ELISA儀上測OD值。組間差異的顯著性用t檢驗完成。2結果2.1女性評估AGE-BSA溶液作掃描檢測,激發(fā)光波長峰值為370nm,發(fā)射光波長峰值為440nm,以此波長,AGE-BSA產(chǎn)生最強熒光。2.2vegf陽性染色正常大鼠視網(wǎng)膜內界膜下、神經(jīng)節(jié)細胞層見GFAP陽性染色,但整個視網(wǎng)膜未見VEGF陽性染色(圖1)。糖尿病鼠除視網(wǎng)膜內界膜下、神經(jīng)節(jié)細胞層有GFAP陽性染色外,其余各層也可見絲條狀貫穿于內外界膜之間的GFAP陽性染色,并且在上述部位有GFAP和VEGF的共表達(圖2～4)。2.3視網(wǎng)膜組織電鏡觀察與對照組相比,3個月糖尿病鼠視網(wǎng)膜Müller細胞有明顯的病理改變(圖5,6)。2.4視網(wǎng)膜成像中的細胞培養(yǎng)和鑒定培養(yǎng)的細胞90%表達GFAP(圖7)。第2代純化培養(yǎng)的視網(wǎng)膜müller細胞呈融合狀態(tài)(圖8)。2.5體外細胞活性檢測對照組的OD值為0.225±0.009,實驗組的OD值為0.262±0.007,細胞活性增加,與對照組相比,差異有顯著性意義(P<0.01),并且Müller細胞在活性增加的同時,其突起大部分消失。3dr微血管病變與視網(wǎng)膜屏障結構相關關系探討DR是糖尿病引起的嚴重并發(fā)癥,以往人們研究最多也最為深入的是其微血管病變,但目前越來越多的臨床及動物實驗研究表明:神經(jīng)視網(wǎng)膜在DR的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)研究發(fā)現(xiàn)膠質細胞參與許多疾病的病理生理過程,如中風、Alzheimer病等。Müller細胞是視網(wǎng)膜主要膠質細胞,其突起除包繞神經(jīng)元及軸突外,還附著在血管外作為支架構成血-視網(wǎng)膜屏障的一部分,具有維持血-視網(wǎng)膜屏障以及神經(jīng)元正常生理功能的作用。在DR發(fā)生發(fā)展中,作為視網(wǎng)膜主要膠質細胞的Müller細胞表現(xiàn)如何?它和微血管病變之間又有哪些關系?目前這方面的研究受到越來越多的關注。本實驗對3個月糖尿病鼠視網(wǎng)膜超微結構進行觀察,發(fā)現(xiàn)Müller細胞的突起大部分消失,但微血管內皮細胞、周細胞卻未見明顯的病理改變。本實驗同時發(fā)現(xiàn)3個月糖尿病鼠視網(wǎng)膜Müller細胞有GFAP表達,而正常鼠體內視網(wǎng)膜中僅有分布于神經(jīng)節(jié)細胞層及神經(jīng)纖維層的星型膠質細胞表達GFAP,而Müller細胞并不表達。盡管體內Müller細胞表達GFAP的作用機制尚不清楚,但其意義在于:它被公認為視網(wǎng)膜受損后,Müller細胞產(chǎn)生反應性膠質化增生的重要標志,如機械性損傷、視網(wǎng)膜脫離、青光眼等,Müller細胞在產(chǎn)生反應性膠質化增生的同時,均有GFAP表達。以上實驗結果說明:在DR微血管病變前,Müller細胞可能已有反應性膠質化增生以及突起消失等病理改變。血-視網(wǎng)膜屏障破壞也是糖尿病早期的一個重要特征,Qaum等研究發(fā)現(xiàn):糖尿病早期血-視網(wǎng)膜屏障破壞呈VEGF依賴性,其機制可能是通過打開內皮細胞的緊密連接和增加細胞內囊泡運輸完成,因微血管內皮細胞及周細胞未見明顯的病理改變。3個月糖尿病鼠視網(wǎng)膜有GFAP及VEGF的共表達,說明在糖尿病早期,不僅已有Müller細胞反應性增生等病理改變,而且反應性增生的Müller細胞還可分泌VEGF,進而促進DR微血管病變的發(fā)生發(fā)展,但是Müller細胞在糖尿病血-視網(wǎng)膜屏障破壞中的確切機制,如是否影響內皮細胞緊密連接蛋白的表達等,有待進一步研究。為探索其發(fā)病機制,本實驗在體外純化培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜Müller細胞,觀察AGEs對其活性的影響。AGEs是由還原糖(如葡萄糖、果糖)和蛋白質的氨基末端經(jīng)非酶促反應形成的終末產(chǎn)物之一,近年來研究認為:體內AGEs的形成和沉積是DR微血管病變的重要發(fā)病機制。本實驗在研究AGEs對體外純化培養(yǎng)鼠視網(wǎng)膜Müller細胞活性的影響時,發(fā)現(xiàn)AGEs可引起Müller細胞的活性明顯增加,并且Müller細胞在活性增加的同時,其突起大部分消失,這就可解釋上述糖尿病體內實驗所觀察的現(xiàn)象,由于細胞活性能反映其增殖狀態(tài),所以糖尿病鼠體內Müller細胞突起消失這一現(xiàn)象可能是其反應性增生的結果。由此推測:(1)反應性膠質化增生可能是糖尿病早期Müller細胞的主要病理改變,導致其作為視網(wǎng)膜支架結構的破壞。(2)AGEs可能是DR中視網(wǎng)膜Müller細胞反應性膠質化增生的重要致病因素,但AGEs能否促進Müller細胞表達GFAP及VEGF有待進一步研究。正常情況下,Müller細胞在體內不表達GFAP,但在體外培養(yǎng)Müller細胞時,2周后絕大部分細胞表達GFAP,本實驗用GFAPIgG抗體鑒定體外培養(yǎng)的鼠視網(wǎng)膜Müller細胞,陽性率為90%。本實驗結果表明反應性膠質化增