健脾法對(duì)非特異性免疫相關(guān)的抗腫瘤作用機(jī)制研究

健脾法對(duì)非特異性免疫相關(guān)的抗腫瘤作用機(jī)制研究

癌癥是嚴(yán)重威脅人類(lèi)生活健康的腫瘤之一，是腫瘤的第四種類(lèi)型。在我國(guó),中醫(yī)中藥被廣泛應(yīng)用于胃癌治療中。近年來(lái)大量的臨床和實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)中醫(yī)健脾法在胃癌的治療中發(fā)揮重要作用,以健脾類(lèi)藥物為基礎(chǔ)組成的復(fù)方治療可糾正胃癌患者脾虛狀態(tài),具有延長(zhǎng)胃癌患者生存期,降低術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移等作用。實(shí)驗(yàn)表明某些健脾類(lèi)中藥復(fù)方不僅對(duì)裸小鼠NK細(xì)胞殺傷活性及紅細(xì)胞免疫功能有調(diào)節(jié)作用,對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)還具有直接的抑制作用,其機(jī)制與下調(diào)Bcl-2、STAT3等基因的表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡有關(guān)。由于臨床上用藥以辨證為原則,復(fù)方的組成常以健脾藥物為基礎(chǔ)結(jié)合清熱解毒、軟堅(jiān)散結(jié)等其它類(lèi)中藥,取得療效往往是整方作用的結(jié)果,對(duì)健脾藥物特有的作用機(jī)制了解并不全面。本研究將以往研究中證實(shí)對(duì)胃癌有效的以健脾為基礎(chǔ)的復(fù)方全方細(xì)化分為健脾組(由全方中的健脾類(lèi)藥物組成)和非健脾組(由全方中非健脾類(lèi)藥物組成),研究健脾類(lèi)藥物對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物非特異性免疫功能的具體作用和可能機(jī)制。中藥組成和分組中藥制備:全方由太子參12.0g,炒白術(shù)12.0g,茯苓12.0g,姜半夏9.0g,青皮4.5g,陳皮4.5g,生牡蠣30.0g,夏枯草9.0g,紅藤30.0g,菝葜30.0g,藤梨根30.0g等組成。健脾組由太子參12.0g,炒白術(shù)12.0g,茯苓12.0g,姜半夏9.0g,青皮4.5g,陳皮4.5g等組成。非健脾組由生牡蠣30.0g,夏枯草9.0g,紅藤30.0g,菝葜30.0g,藤梨根30.0g等組成。單味中藥由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房提供,均按以往方法煎制。各組中藥均調(diào)節(jié)濃度至120mg/mL(即每毫升含生藥量計(jì)),高溫高壓滅菌,備用。5-氟尿嘧啶(5-FU)(上海旭東海普藥業(yè)有限公司,批號(hào):060501),乳酸脫氫酶(LDH)測(cè)試盒(南京建成生物工程研究所第一分所)。2.動(dòng)物分組、藥物代謝和血清ifn2.1瘤種人胃癌細(xì)胞MKN-45瘤種裸小鼠由上海腫瘤研究所饋贈(zèng),經(jīng)體外、體內(nèi)傳代,形成穩(wěn)定的皮下移植瘤模型,傳代至第8代(P8),進(jìn)行第1次實(shí)驗(yàn)后,繼續(xù)傳代,至第13代(P13),進(jìn)行第2次實(shí)驗(yàn)。2.2動(dòng)物BALB/c-nu/nu裸小鼠6周齡,雄性,SPF級(jí),體質(zhì)量(20±2)g,抑瘤動(dòng)物實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。第1次共40只[動(dòng)物合格證:SCXK(滬)2007-0005,No.0044099],第2次共78只[動(dòng)物合格證:SCXK(滬)2007-0005,No.0049570]。2.3造模及分組皮下移植瘤模型造模采用文獻(xiàn)和以往的方法——組織塊套管針?lè)?。造?d后選瘤塊5mm3以上的動(dòng)物進(jìn)行隨機(jī)分組進(jìn)入實(shí)驗(yàn),隨機(jī)分為全方組、健脾組、非健脾組、5-FU組、生理鹽水組及非造模組(第2次實(shí)驗(yàn)),具體動(dòng)物數(shù)見(jiàn)表。治療組分別予相應(yīng)藥物0.5mL/d灌胃,1次/d;5-FU組50mg·kg-1·d-1腹腔注射,1次/周,共4周;生理鹽水組:0.9%氯化鈉溶液0.5mL/d灌胃,1次/d;非造模組予常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)第31天,處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。無(wú)菌剝離瘤塊,稱(chēng)取瘤塊重量;無(wú)菌保存瘤塊標(biāo)本分別液氮凍存和常規(guī)石蠟包埋;摘眼球取血,提取血清。2.4抑瘤率計(jì)算方法腫瘤抑制率按以下公式計(jì)算:抑瘤率(%)=(生理鹽水組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重)/生理鹽水組平均瘤重×100%。2.5自然殺傷細(xì)胞(naturalkillercell,NK)細(xì)胞活性采用LDH釋放法。具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。2.6血清IFN-γ含量采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)方法檢測(cè)血清IFN-γ含量。使用R&D公司小鼠IFN-γElisa試劑盒,具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。DENLEYDRAGONWellscanMK3酶標(biāo)儀檢測(cè)。2.7脾細(xì)胞活化性受體(nature-killergroup2menberD,NKG2D)表達(dá)提取小鼠脾細(xì)胞,裂解液反應(yīng)后離心,BCA法測(cè)定蛋白濃度;WesternBlot檢測(cè)脾細(xì)胞NKG2D受體表達(dá)。采用半干轉(zhuǎn)膜方式。一抗為RatIgG2BantimouseNKG2D,稀釋1:1000。Quantityone軟件進(jìn)行灰度分析比較。使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)用表示,方差齊性檢驗(yàn)后,采用單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,均數(shù)間多重比較采用最小顯著差法(LSD檢驗(yàn)),顯著性水準(zhǔn)為α=0.05。各組小鼠血清nk細(xì)胞殺活性、血清ifn-、非健脾的檢測(cè)比較兩次實(shí)驗(yàn)中,全方組、健脾組、非健脾組和5-FU組平均瘤重均低于生理鹽水組(P<0.01);實(shí)驗(yàn)一抑瘤率分別為34.40%、30.69%、26.98%、36.33%;實(shí)驗(yàn)二抑瘤率分別為23.68%、28.32%、38.28%、38.87%。健脾組平均瘤重與全方組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,非健脾組與全方組相比差異亦無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,健脾組與非健脾組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,全方組、健脾組、非健脾組和5-FU組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生理鹽水組的NK細(xì)胞殺傷活性較非造模組降低(P<0.01);全方組、健脾組、非健脾組均高于生理鹽水組(P<0.01),5-FU組與生理鹽水組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;全方組、健脾組、非健脾組及5-FU組均低于非造模組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);健脾組與全方組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,非健脾組和5-FU組均低于全方組,差異有統(tǒng)計(jì)生理鹽水組血清IFN-γ含量較非造模組降低(P<0.01);全方組、健脾組、非健脾組均高于生理鹽水組(P<0.01),5-FU組與生理鹽水組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;全方組、健脾組與非造模組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,非健脾組和5-FU組均低于非造模組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);健脾組與全方組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,非健脾組和5-FU組均低于全方組(P<0.01)。生理鹽水組NKG2D受體表達(dá)量較非造模組降低(P<0.01);全方組、健脾組、非健脾組均高于生理鹽水組(P<0.01),5-FU組與生理鹽水組對(duì)照相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;全方組、健脾組及非健脾組與非造模組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;5-FU組低于非造模對(duì)照組(P<0.01);健脾組與全方組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,非健脾組與全方組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,5-FU組低于全方組(P<0.01)。增強(qiáng)nk細(xì)胞殺傷活性本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),健脾為主的全方組及其中的健脾組和非健脾組的兩次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的瘤重均明顯低于生理鹽水組,差異具有顯著性(P<0.01),提示以健脾為基礎(chǔ)的復(fù)方全方及方中的健脾和非健脾組分均能抑制裸小鼠皮下移植瘤腫瘤生長(zhǎng),與以往的研究結(jié)果一致。對(duì)各實(shí)驗(yàn)和對(duì)照組皮下移植瘤裸小鼠脾NK細(xì)胞殺傷活性的測(cè)定結(jié)果顯示,生理鹽水組NK細(xì)胞殺傷活性明顯低于非造模組,處于免疫抑制狀態(tài),提示造模后移植腫瘤對(duì)裸小鼠的免疫功能有明顯的抑制作用;而全方組及健脾組均可上調(diào)造模裸小鼠的NK細(xì)胞殺傷活性,使之接近于非造模組的水平,表明實(shí)驗(yàn)中的全方組和健脾組藥物可通過(guò)上調(diào)造模動(dòng)物低下的NK細(xì)胞活性,提高荷瘤機(jī)體的非特異性免疫。相比較而言,非健脾組雖然也顯示了上調(diào)荷瘤機(jī)體的NK細(xì)胞殺傷活性,但效果明顯低于全方組和健脾組,提示健脾類(lèi)中藥在全方中起到上調(diào)NK細(xì)胞活性的主導(dǎo)作用。5-FU組的裸小鼠脾細(xì)胞中NK細(xì)胞殺傷活性較非造模組下降,與生理鹽水組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示化療藥物5-FU無(wú)明顯調(diào)節(jié)NK細(xì)胞殺傷功能的作用。非特異性免疫是機(jī)體免疫的第一道防線,是生物體固有的、對(duì)高危致病因子即時(shí)反應(yīng)的“非特異性”抵御外來(lái)侵襲的第一道防線。非特異性免疫功能的高低,決定了免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤發(fā)揮殺傷功能的水平高低,直接體現(xiàn)著機(jī)體免疫系統(tǒng)的免疫反應(yīng)性,也是諸多學(xué)者討論腫瘤免疫功能變化的重要指標(biāo)。TAdachi等發(fā)現(xiàn),抑制機(jī)體內(nèi)N-乙酰半乳糖氨基轉(zhuǎn)移酶可以上調(diào)胃癌患者體內(nèi)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫反應(yīng)性,提高患者的腫瘤免疫功能。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)健脾扶正類(lèi)藥物能提高正常小鼠以及免疫抑制小鼠的非特異性免疫功能,本研究結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)。在機(jī)體中,應(yīng)激活化的NK細(xì)胞可以產(chǎn)生IFN-γ,這類(lèi)細(xì)胞因子具有很強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用,可以對(duì)NK細(xì)胞具有反饋性的激活作用,增強(qiáng)NK細(xì)胞的活化,從而增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷作用。IFN-γ被認(rèn)為是NK細(xì)胞天然誘導(dǎo)劑,可促進(jìn)NK細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化,增強(qiáng)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒活性,抗原依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞溶解作用(ADCC)和NK細(xì)胞毒因子的釋放。本研究中筆者進(jìn)一步測(cè)定了各實(shí)驗(yàn)組和非造模對(duì)照組荷瘤鼠血清中IFN-γ含量,結(jié)果表明生理鹽水組荷瘤鼠血清IFN-γ含量明顯低于非造模組,提示移植瘤可下調(diào)模型動(dòng)物血清IFN-γ含量;而全方組及健脾藥物組IFN-γ含量高于生理鹽水組,表明全方和健脾藥物均可以上調(diào)荷瘤小鼠血清中下降的IFN-γ含量使之接近于非造模組的正常水平,從而發(fā)揮免疫協(xié)同作用以增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷活性;非健脾組雖然同樣顯示了上調(diào)荷瘤機(jī)體血清中的IFN-γ含量,但仍明顯低于非造模組以及全方組和健脾組,進(jìn)一步提示健脾藥物在調(diào)節(jié)荷瘤小鼠IFN-γ中起主要的作用。而5-FU組IFN-γ含量與生理鹽水組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;同時(shí)明顯低于非造模組和各中藥實(shí)驗(yàn)組,表明化療藥物5-FU對(duì)模型動(dòng)物IFN-γ無(wú)明顯影響作用。NKG2D是NK細(xì)胞表面的C型凝集素活化性受體,NKG2D與腫瘤細(xì)胞表面配體結(jié)合,殺傷腫瘤細(xì)胞。NKG2D廣泛地表達(dá)于多種免疫細(xì)胞,在鼠類(lèi)所有NK細(xì)胞、部分NKT細(xì)胞、部分脾CDT輔助淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞都表達(dá)NKG2D。在人類(lèi)中除表達(dá)于所有NK細(xì)胞外,NKG2D在未受刺激的外周血細(xì)胞、CDT輔助淋巴細(xì)胞及腸上皮內(nèi)CDT輔助淋巴細(xì)胞上都有表達(dá)。NKG2D可作為協(xié)同刺激分子增強(qiáng)或協(xié)同其他活化性受體激活抗原特異性細(xì)胞的抗腫瘤免疫作用。NKG2D是迄今為止被鑒定出相應(yīng)配體的一類(lèi)非常重要的非MHC型活化性受體。在NK細(xì)胞發(fā)揮非特異性免疫功能的過(guò)程中,NKG2D的表達(dá)與相繼誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌IFN-γ的作用被認(rèn)為在其中發(fā)揮了重要的免疫協(xié)同作用。IFN-γ可以繼續(xù)誘導(dǎo)NK細(xì)胞殺傷靶細(xì)胞,發(fā)揮免疫監(jiān)視作用。本研究結(jié)果顯示生理鹽水組裸小鼠脾細(xì)胞NKG2D蛋白表達(dá)明顯低于非造模組,處于免疫抑制狀態(tài);全方組、健脾藥物組和非健脾藥物組均可以上調(diào)NKG2D表達(dá)水平至接近于非造模組的正常水平。而5-FU組的裸小鼠脾細(xì)胞NKG2D受體表達(dá)水平則與生理鹽水組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,提示化療藥物5-FU無(wú)明顯調(diào)節(jié)NKG2D受體表達(dá)作用。結(jié)合上述血清IFN-γ含量測(cè)定和NK細(xì)胞殺傷活性測(cè)定的結(jié)果,表明全方組、健脾藥物組可上調(diào)宿主脾細(xì)胞NKG2D受體表達(dá),并相繼性地誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌IFN-γ,免疫協(xié)同性地刺激NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的作用,而非健脾藥物組分雖可上調(diào)宿主脾細(xì)胞NKG2D受體表達(dá),部分誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌IFN-γ,并部分上調(diào)宿主的NK細(xì)胞殺傷活性,但其誘導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌IFN-γ和上調(diào)宿主的NK細(xì)胞殺傷活性的作用均明顯低于全方組和健脾組,提示健脾藥物組分在上調(diào)荷瘤鼠的非特異性免疫中發(fā)揮了主導(dǎo)作用。本研究