調(diào)肝治法方藥對反復(fù)心理應(yīng)激大鼠下丘腦和海馬氨基酸含量的影響

調(diào)肝治法方藥對反復(fù)心理應(yīng)激大鼠下丘腦和海馬氨基酸含量的影響

腦中的一些氨基酸作為神經(jīng)傳統(tǒng)的一個(gè)組成部分，在腦功能和心理行為中起著重要的調(diào)節(jié)作用。谷氨酸(Glutamicacid,Glu)和天冬氨酸(Asparticacid,Asp)是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)最重要的兩種內(nèi)源性興奮性氨基酸。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid,GABA)和?；前彼?Taurine,Tau)均屬于抑制性神經(jīng)遞質(zhì),尤其Tau是一個(gè)新近被確定的抑制性氨基酸,在腦內(nèi)含量相對較高,常與GABA協(xié)同發(fā)揮抑制效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)觀察了反復(fù)心理應(yīng)激反應(yīng)大鼠下丘腦和海馬Glu、Asp、GABA和Tau含量的變化,以及調(diào)肝、健脾、補(bǔ)腎治法方藥和人參總皂甙的影響。1材料和方法1.1中藥、成分配液及成汁配方調(diào)肝方藥組成及劑量:柴胡5g、白芍15g、枳殼6g、枸杞子15g、山梔5g、干地黃18g、石決明30g。腎氣丸組成及劑量:干地黃30g、山藥15g、山茱萸15g、澤瀉10g、茯苓10g、丹皮10g,桂枝4g、附子4g。四君子湯組成以及劑量:黨參20g、白術(shù)15g、茯苓15g、炙甘草6g。藥材由本校第一附屬醫(yī)院藥房提供,經(jīng)藥劑科鑒定均為純正藥材,常規(guī)煎煮取汁后調(diào)肝方藥濃縮至含生藥1.69g/ml,腎氣丸濃縮至含生藥1.76g/ml,四君子湯濃縮至含生藥1.01g/ml(用藥劑量為成年人70kg體重劑量的10倍)。高壓滅菌,4℃冰箱保存?zhèn)溆?。人參總皂甙由長春白求恩醫(yī)科大學(xué)藥劑科提供,配制成水溶液7mg/ml。調(diào)肝組、補(bǔ)腎組、健脾組及人參總皂甙組均于限制制動刺激前1h相應(yīng)給予調(diào)肝方藥、腎氣丸煎劑、四君子湯煎劑及人參總皂甙溶液2ml灌胃,正常組及模型組以2ml生理鹽水灌服。1.2飼養(yǎng)方式及分組Wistar大鼠180~220g,雌雄各半,正常飲食,在光-暗周期為12h、溫度20±2℃、安靜環(huán)境下飼養(yǎng)7d。按體重隨機(jī)分為6組:正常組,不施加任何刺激;模型組,給予制動刺激;調(diào)肝組,制動刺激前給予調(diào)肝方藥;補(bǔ)腎組,制動刺激前給予腎氣丸;健脾組,制動刺激前給予四君子湯;人參總皂甙組,制動刺激前給予人參總皂甙。1.3制動時(shí)間及限制制動次數(shù)大鼠置自制的限制制動筒內(nèi)(由大鼠固定儀改制而成),通過移動插片而逐步縮小大鼠的活動空間,調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度,每日限制制動1次,每日開始時(shí)間及限制制動時(shí)間不同,第1d為4h,其后每次增加30~60min,連續(xù)14d。造模大鼠在制動期間禁食、禁水。造模結(jié)束后在動物清醒、安靜狀態(tài)下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。1.4測試指標(biāo)和方法1.4.1超聲波輔助提取氨基酸稱量大鼠體重,斷頭,迅速取全腦,于冰盤上分離下丘腦和海馬,電子天平分別稱重并記錄。將各組下丘腦和海馬分別置于玻璃漿器內(nèi),加入3ml甲醇,冰浴內(nèi)充分勻漿,用毛細(xì)吸管將提取液轉(zhuǎn)移至25ml離心管中,小心防止提取液損失,每次用2ml甲醇再提取二次,合并三次提取液,總計(jì)約7~8ml,搖勻,置超聲波上處理30min,10000rpm冷凍離心30min,將上清液轉(zhuǎn)入20ml小瓶中,置80℃水溫上水浴至甲醇蒸發(fā)至干,在瓶內(nèi)準(zhǔn)確加入5.0ml/LHCl,置超聲波處理30min,在超聲波處理過程中,小心搖動小瓶,使氨基酸成分溶出,將溶出物轉(zhuǎn)入10ml離心管中,10000rpm冷凍離心30min,取上清液,用于氨基酸分析。1.4.2熒光檢測條件HP-1050型高效液相色譜儀,配HP-1050型四元梯度泵、自動進(jìn)樣器,HP-1046A型熒光檢測器和HPLC-2D色譜工作站。色譜柱:HPHypersilODS5μm125*4mm。流動相:A:8.0mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2),含0.3%四氫呋喃。流動相:B:8.0mmol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.2)+甲醇+乙腈(50+35+15)。流量:1.0ml/min。柱前自動衍生程序:設(shè)置自動進(jìn)樣器程序?yàn)橐来挝?μlOPA試劑,5μl0.1mol/LpH=10.4硼酸鹽緩沖液和1μl樣品,并設(shè)定每次吸取不同的溶液前用蒸餾水洗滌針頭,然后在線混合5次,等待1.5min,進(jìn)樣。梯度洗脫程序:0min,0%B;25min,100%B;35min,100%B;35.1min,100%A;45min,100%A。然后開始下一個(gè)樣品的分析。檢測程序:熒光檢測器波長:EX=340nm,EM=450nm。OPA柱前衍生反相高效液相色譜法。2結(jié)果2.1各組小鼠海馬glu和體重Glu和Asp含量變化下丘腦Glu和Asp:與正常對照組相比,模型組下丘腦Glu和Asp水平均無明顯變化。補(bǔ)腎組下丘腦Glu與正常對照組相比無明顯性差異(P>0.05)。人參總皂甙組下丘腦Glu明顯下降(P<0.05)。調(diào)肝組與補(bǔ)腎組下丘腦Asp與正常對照組相比均無顯著性差異。健脾組與人參總皂甙組下丘腦Asp水平均明顯低于模型組和正常對照組(P<0.01)。海馬Glu和Asp:模型組海馬Glu明顯下降(P<0.05),Asp無明顯變化。調(diào)肝組海馬Glu和Asp無明顯變化(P>0.05)。補(bǔ)腎組、健脾組和人參總皂甙組海馬Glu和Asp均明顯升高(P<0.01)。結(jié)果見表1。2.2各組大鼠體內(nèi)gaba和tau的變化GABA和Tau含量變化下丘腦GABA和Tau:模型組下丘腦GABA和Tau無明顯變化。調(diào)肝組、健脾組和人參總皂甙組下丘腦GABA和Tau均明顯下降(P<0.05或0.01)。補(bǔ)腎組下丘腦GABA明顯下降(P<0.01)。海馬GABA和Tau:模型組海馬Tau明顯下降(P<0.05)。調(diào)肝組GABA和Tau變化不明顯。健脾組、補(bǔ)腎組與人參總皂甙組GABA和Tau均有不同程度地升高(P<0.01)。結(jié)果見表2。3應(yīng)激大鼠海馬glu變化情況Glu廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS),Asp與Glu在分布與功能上有極大的交叉性。在反復(fù)制動心理應(yīng)激狀態(tài)下,糖皮質(zhì)激素(GC)可以刺激中樞引起Glu和Asp含量增加;同時(shí),促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(CRH)等多種激素釋放對Asp反應(yīng)異常強(qiáng)烈,因此,下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPAA)與Glu、Asp之間具有復(fù)雜的相互作用關(guān)系。GABA與Tau生理作用相似,廣泛存在于下丘腦和海馬中,均屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性遞質(zhì)。有文獻(xiàn)推測Tau也能參與應(yīng)激活動。GABA的抑制效應(yīng)在于防止興奮性神經(jīng)元發(fā)放過度,調(diào)整其活動強(qiáng)度,從而可以達(dá)到抗焦慮的作用。反復(fù)制動心理應(yīng)激狀態(tài)下,HPAA的功能活動與GABA含量變化有關(guān),GABA可以發(fā)揮抑制PAA活動亢進(jìn)的效應(yīng)。因此,進(jìn)一步研究抑制性氨基酸在應(yīng)激中的作用同樣十分有必要。本實(shí)驗(yàn)的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)應(yīng)激大鼠海馬Glu明顯下降,海馬Asp具有下降的趨勢;下丘腦Glu與Asp均無明顯變化。海馬Tau明顯下降。結(jié)合國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道分析,應(yīng)激大鼠海馬Glu下降可能的原因有三:1.應(yīng)激源對腦區(qū)氨基酸作用具有選擇性,選擇性受到應(yīng)激源、應(yīng)激時(shí)間、應(yīng)激強(qiáng)度等因素的影響。Moghaddam發(fā)現(xiàn):20min限制性應(yīng)激并不一定導(dǎo)致所有腦區(qū)的Glu和Asp含量升高,認(rèn)為制動應(yīng)激以選擇性的方式增加神經(jīng)元釋放興奮性氨基酸。2.海馬對應(yīng)激的整合作用。海馬是應(yīng)激的整合部位。海馬對HPAA的活動有抑制的作用,這種影響可能通過調(diào)節(jié)下丘腦的室旁核的活動而產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)反復(fù)制動應(yīng)激引起大鼠HPAA興奮,海馬某些整合功能可能通過降低谷氨酸的含量,從而抑制HPAA的進(jìn)一步興奮來調(diào)整機(jī)體的狀態(tài)。3.HPAA自身負(fù)反饋機(jī)制。應(yīng)激狀態(tài)下,CORT、ACTH甚至于CRH自身均可以發(fā)生負(fù)反饋,抑制HPAA的進(jìn)一步興奮。也許是負(fù)反饋機(jī)制參與了海馬Glu含量的降低。由此可見,應(yīng)激狀態(tài)下,中樞興奮性氨基酸變化與HPAA功能活動之間的相互作用是相當(dāng)復(fù)雜的,其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)還觀察到海馬Tau含量明顯下降,其機(jī)制尚難定論。結(jié)合海馬Glu呈明顯下降的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,推測Tau含量的下降可能是海馬整合作用的結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),幾乎所有的中藥對下丘腦Glu和Asp和GABA和Tau均有不同程度的下調(diào)趨勢或者是明顯下調(diào)作用。四君子湯、腎氣丸和人參總皂甙對海馬Glu、Asp、GABA和Tau有明顯上調(diào)作用。調(diào)肝方藥