補(bǔ)脾益氣方對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織lr4表達(dá)的影響

補(bǔ)脾益氣方對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織lr4表達(dá)的影響

哮喘是臨床上常見的慢性呼吸道疾病之一，具有復(fù)發(fā)的特點(diǎn)。這是一種由各種細(xì)胞和炎癥因素引起的過敏性疾病。Toll樣受體(Toll-likereceptors,TLRs)是介導(dǎo)連接天然免疫和獲得性免疫的受體,能夠促使多種細(xì)胞因子和炎性因子的釋放,誘發(fā)并加重炎癥反應(yīng),在調(diào)節(jié)氣道炎癥中起著重要的作用,TLR4是屬于I型跨膜受體蛋白,在激活天然免疫及入侵的病原體而誘發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)中起主導(dǎo)作用。TLR4主要分布于巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及肺、脾、肝和胎盤等組織中。本研究通過觀察補(bǔ)脾益氣方對(duì)脾虛哮喘大鼠模型肺組織TLR4表達(dá)的影響,探討脾虛對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥影響機(jī)制及補(bǔ)脾益氣方對(duì)其的調(diào)控作用。藥模和模型的建立健康雄性Wistar大鼠36只,SPF級(jí),北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供,體質(zhì)量(200±20)g,周齡6-8周。許可證編號(hào):SCXK(京)2007-0001。卵蛋白(GradeⅡ,批號(hào):A5253,美國Sigma公司);滅活百日咳疫苗(批號(hào):20080501-5,武漢生物制品研究所);氫氧化鋁干粉(批號(hào):Sigma-A4682,規(guī)格:25g,美國Sigma公司);兔抗大鼠TLR4多克隆抗體(BA1717,武漢博士德生物工程有限公司);RT-PCR試劑盒(DRR019A,大連寶生物工程有限公司)。36只Wistar大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分成3組:對(duì)照組、脾虛哮喘組、脾虛哮喘治療組,每組12只。脾虛哮喘組和脾虛哮喘治療組先參考文獻(xiàn)方法,進(jìn)一步改進(jìn)建立脾虛模型。然后依據(jù)文獻(xiàn)方法建立哮喘模型。脾虛哮喘組和脾虛哮喘治療組連續(xù)10d采用飲食不節(jié)、苦寒泄下和過度疲勞等方法共同作用建立脾虛大鼠模型。當(dāng)動(dòng)物出現(xiàn)體質(zhì)量下降;飲水增多,食量減少;肛溫升高;排便次數(shù)增多,便溏;倦怠少動(dòng),游泳耐力下降;愛聚堆等變化,提示脾虛造模成功。在脾虛造模成功后,采用卵蛋白致敏和激發(fā)的方法建立哮喘模型。在實(shí)驗(yàn)的第11、13和15天,腹腔注射抗原液1mL致敏(由卵蛋白100mg、滅活百日咳桿菌疫苗5×109個(gè)、氫氧化鋁干粉100mg的0.9%氯化鈉溶液配制而成)。致敏后第15天開始,將大鼠放入封閉的霧化箱內(nèi),1次/d,將1%卵蛋白溶液用超聲霧化器噴霧激發(fā),每次30min,連續(xù)7d。當(dāng)激發(fā)時(shí)大鼠出現(xiàn)呼吸喘促、點(diǎn)頭、腹肌抽動(dòng)等呼吸困難癥狀提示哮喘模型造模成功。對(duì)照組采用等量0.9%氯化鈉溶液代替抗原液腹腔注射致敏,激發(fā)時(shí)以等量的0.9%氯化鈉溶液代替卵蛋白溶液進(jìn)行霧化吸入。造模成功后用補(bǔ)脾益氣方藥,由補(bǔ)中益氣湯合并玉屏風(fēng)散化裁而成,由黃芪、人參、防風(fēng)、白術(shù)、大棗等9味中藥按比例組成,常規(guī)煎煮2次,將藥液濃縮為1g/mL生藥。按照體表面積換算法,折合人的等效劑量的10倍。實(shí)驗(yàn)第11天開始對(duì)脾虛哮喘治療組進(jìn)行灌胃,劑量為1mL/100g體質(zhì)量,2次/d,共計(jì)21d。在給藥21d后取材。肺組織標(biāo)本:20%烏拉坦腹腔注射麻醉大鼠,開胸后結(jié)扎右主氣管,取出右肺上葉,用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液洗去血液,濾紙吸干肺組織表面的水分,稱取100mg肺組織,放入液氮中冷凍,轉(zhuǎn)移至-70℃保存,用于逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測TLR4mRNA的表達(dá);取出右肺下葉,用上述同樣的方法處理好后,放入4%多聚甲醛中固定,用于免疫組化測定TLR4的蛋白表達(dá)。采用Trizol進(jìn)行肺組織總RNA提取,采用RT-PCR試劑盒分兩步進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。TLR4的引物序列和內(nèi)參照β-actin序列見表1。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2min;94℃變性30s;65℃退火30s;72℃延伸1min,共30個(gè)循環(huán),最后72℃延伸5min,4℃冷卻終止反應(yīng);瓊脂糖凝膠電泳;利用WD-9413B凝膠成像分析儀進(jìn)行圖像分析:用Gelpro32軟件測量目的基因和內(nèi)參的平均光密度值,并計(jì)算兩者的比值,以該比值反應(yīng)目的基因的mRNA表達(dá)水平。載玻片防脫片處理,切片常規(guī)脫蠟至水,按照試劑說明書的步驟進(jìn)行操作;蘇木素輕度復(fù)染,脫水,透明,封片;顯微鏡觀察,拍照;采用BI2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析,選取200倍圖像,觀察肺內(nèi)支氣管部位,細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為TLR4陽性表達(dá)細(xì)胞,每張切片隨機(jī)選取至少5個(gè)高倍視野進(jìn)行積分光密度測定,取其平均值作為該切片的代表值。采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,采用單因素方差分析,用LDS法進(jìn)行均數(shù)兩兩比較,結(jié)果以u(píng)e0af±s表示。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)大鼠肺組織tlr4mrna表達(dá)的影響在飼養(yǎng)、造模和治療過程中各組大鼠均有死亡,每組取8只進(jìn)行RT-PCR和免疫組化實(shí)驗(yàn)。見表2。與對(duì)照組相比,脾虛哮喘組大鼠肺組織中TLR4mRNA的表達(dá)顯著升高(P<0.01),與脾虛哮喘組相比,脾虛哮喘治療組大鼠肺組織中TLR4mRNA的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。見表3,圖1。脾虛哮喘組大鼠肺組織切片免疫組化顯示陽性細(xì)胞漿呈棕黃色,TLR4蛋白陽性主要表達(dá)于各級(jí)支氣管上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等。與對(duì)照組相比,脾虛哮喘組大鼠肺組織中TLR4蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.01),與脾虛哮喘組相比,脾虛哮喘治療組大鼠肺組織中TLR4蛋白的表達(dá)顯著降低(P<0.01)。tlr4影響呼吸道炎性及炎性哮喘是氣道的慢性炎癥性疾病,哮喘患者的氣道內(nèi)存在著不同程度的多種炎性細(xì)胞的浸潤和炎性因子的聚集,經(jīng)過一系列炎性反應(yīng),導(dǎo)致氣道的炎性滲出、氣道高反應(yīng)性及氣道的重構(gòu)。氣道高反應(yīng)是哮喘的重要特征,而氣道炎癥是哮喘主要的病理變化。現(xiàn)在研究證明,在大鼠的肺組織中TLR4表達(dá)于胞漿,主要分布于氣道上皮細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞等。TLR4識(shí)別入侵的病原體,在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中通過誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和化學(xué)因子的生成與釋放,形成以中性粒細(xì)胞浸潤、微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及蛋白液體滲漏為特征的炎癥反應(yīng)。TLR4還可介導(dǎo)肺部損傷的后期修復(fù)性炎癥反應(yīng),引起并加重氣道的改造與重構(gòu)。因此,深入研究TLR4已成為近年來介導(dǎo)形成氣道炎癥反應(yīng)的研究熱點(diǎn)。哮喘在中醫(yī)學(xué)屬于“哮病”的范疇,脾虛為哮喘之宿根,脾虛則周身氣機(jī)轉(zhuǎn)輸失常,影響肺之宣肅則致咳喘;脾虛則生氣無源,衛(wèi)外失固而易感外邪誘發(fā)哮喘,故認(rèn)為脾虛是哮喘的關(guān)鍵,補(bǔ)脾益氣方即所謂肺病不愈,求治于脾。通過補(bǔ)脾達(dá)到療肺的目的。劉仁慧等實(shí)驗(yàn)研究表明,健脾益氣可改善哮喘患者的過敏體質(zhì),增強(qiáng)機(jī)體免疫力及氣道的防御能力,以消除氣道炎癥。哮喘的本質(zhì)是氣道的慢性炎癥,脾虛能加重哮喘的炎性反應(yīng)以及炎性細(xì)胞和介質(zhì)的合成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:HE染色觀察,脾虛哮喘組肺組織和支氣管上皮細(xì)胞損傷脫落嚴(yán)重,嗜酸性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤和聚集增加;脾虛哮喘組大鼠TLR4mRNA和蛋白的表達(dá)較對(duì)照組均明顯增加,說明脾虛可以通過TLR4信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑影響炎癥細(xì)胞及因子的表達(dá)和釋放,進(jìn)而加重哮喘的氣道炎癥反應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)通過研究探索出補(bǔ)脾益氣方對(duì)哮喘中TLR4介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的影響。選用補(bǔ)脾益氣方作為處理因素,通過補(bǔ)脾肺之氣,使身體產(chǎn)生抵御外邪之正氣。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:補(bǔ)脾益氣方能夠明顯降低脾虛哮喘組大鼠肺組織中TLR4mRNA和蛋白的表達(dá),說明補(bǔ)脾益氣方主要通過影響TLR4的翻譯進(jìn)而調(diào)控炎癥因子。本實(shí)驗(yàn)為臨床治療哮喘提供了一定的理論依據(jù),也為臨床防治哮喘提供新的辦法,即通過抑制這條途徑上的主要介質(zhì)來防治哮喘,可以研發(fā)