不同加工工藝對(duì)梅花松茸活性多肽的影響

不同加工工藝對(duì)梅花松茸活性多肽的影響

鹿毛是一種古老的中國(guó)中藥。它含有多種生理活性物質(zhì)，可以促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育和身體體力的發(fā)育。國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者對(duì)鹿茸進(jìn)行了大量研究。傳統(tǒng)的熱加工提取方法使鹿茸中的熱敏感性活性組分損失較大,因此,尋找一種新的鹿茸有效成分的提取方法,將會(huì)大大提高鹿茸多肽的提取效率,既節(jié)約原材料,又可以保證提取物的高活性。本研究以不同加工方法處理的鹿茸為原料,采用分子排阻層析和離子交換層析的方法提取鹿茸多肽,建立了高效的提取方法,并對(duì)提取效果好的產(chǎn)品的免疫功效進(jìn)行了初步研究,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用鹿茸奠定了基礎(chǔ)。材料和方法1.魯克斯梅花鹿二杠鮮茸,由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所鹿茸試驗(yàn)基地提供。2.試驗(yàn)動(dòng)物SPFBALB/c小鼠,8～10周齡,購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所。3.培養(yǎng)基和試劑SephadexG-50和CM-SepharoseFastFlow購(gòu)自PharmaciaBiotch公司;牛血清白蛋白和MTT購(gòu)自Sigma公司;蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海應(yīng)用化學(xué)研究所;其他試劑(均為分析純)均購(gòu)自北京化工廠;90-型磁力攪拌器為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品;LB-20切片機(jī)為上?？频蟽x器有限公司產(chǎn)品;膠體磨為溫州輕工設(shè)備廠產(chǎn)品;ER-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品;HD-3紫外檢測(cè)儀和DBS-20M電腦部分收集器為上海滬西分析儀器廠產(chǎn)品。4.鹿加工以不同的加工工藝處理鹿茸。4.1凍干、、加工鹿茸留血密封后冷藏運(yùn)輸2h以?xún)?nèi),置-80℃冷凍保存,轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行凍干加工,制成凍干茸。凍干茸在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)低溫快速粉碎,分裝,置-20℃保存。4.2冷凍保存鹿茸留血密封后冷藏運(yùn)輸2h以?xún)?nèi),置-80℃冷凍保存。用球磨粉碎機(jī)粉碎,加入無(wú)菌蒸餾水配制的60%乙醇,經(jīng)膠體磨研磨成勻漿,冷凍干燥制成茸粉,分裝,置-20℃保存。4.3熱爆跑鹿茸留血經(jīng)傳統(tǒng)熱加工(煮炸、澆炸、烘烤、風(fēng)干和干燥等)處理,低溫快速粉碎,分裝,置-20℃保存。5.制備牡丹花松茸的制備分別稱(chēng)取凍干鹿茸粉、冷凍鮮茸和熱炸茸粉各200g,用蒸餾水沖洗至無(wú)血色后,各加入3000ml預(yù)冷的200μmol/LpH3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液,用膠體磨勻漿,勻漿過(guò)程中不斷添加預(yù)冷的pH3.5的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液2000ml。將所得的勻漿液于層析柜內(nèi)放置過(guò)夜,7000g離心15min,取上清液,加入無(wú)水乙醇至終濃度為60%,4℃層析柜內(nèi)放置,每20～30min攪拌一次,4h后7000g離心15min,將上清液置50℃水浴中,真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收乙醇,最終濃縮體積約為500ml,將其凍干,得梅花鹿鹿茸粗提物,-18℃保存?zhèn)溆?。以上操作除減壓回收乙醇外,均在4℃低溫條件下進(jìn)行。6.冷卻、干燥、稱(chēng)重分別稱(chēng)取凍干鹿茸粉、冷凍鮮茸和熱炸茸粗提物各10g,平鋪于干燥至恒重的扁形稱(chēng)量瓶中,厚度不超過(guò)5mm,精密稱(chēng)量。打開(kāi)瓶蓋,于100～105℃干燥5h,將瓶蓋蓋好,移置干燥器中,冷卻30min,精密稱(chēng)量重量。再于100～105℃干燥1h,冷卻,稱(chēng)重,至連續(xù)2次稱(chēng)重的差異不超過(guò)5mg為止。根據(jù)減失的重量,計(jì)算各樣品中的水分含量。7.蛋白濃度測(cè)定采用Lowry法。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,精密定容,梯度稀釋,在270nm處測(cè)吸光度值,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得各樣品蛋白濃度。8.純度試驗(yàn)采用SDS系統(tǒng)檢測(cè)粗提產(chǎn)物的純度。9.去離子水平衡層析柱的安裝稱(chēng)取10gSephadexG-50,分別浸泡在200ml重蒸水中,充分溶脹,傾去漂浮的細(xì)顆粒,再將SephadexG-50分裝入處理好的層析柱,用5倍柱體積以上的去離子水平衡層析柱。取上述粗提物含量高的凍干鹿茸的凍干品1.0g,溶解于5ml去離子水中,用0.45μm膜過(guò)濾除去雜質(zhì),將樣品加入柱內(nèi)(上樣量為150mg/ml,5ml),用去離子水洗脫,洗脫液流速1.0ml/min,紫外檢測(cè)儀280nm檢測(cè)活性峰,部分收集器收集活性峰處液體,-18℃分別保存?zhèn)溆?MTT法檢測(cè)多肽活性,Lowry法檢測(cè)蛋白含量。10.洗脫和活性檢測(cè)分別取活性峰收集液100ml,以醋酸-醋酸鈉緩沖溶液調(diào)整pH值和離子強(qiáng)度至pH值3.5,以CM-SepharoseFastFlow為介質(zhì)裝填層析柱,層析柱充分平衡后,以1.5ml/min流速將樣品注入柱內(nèi),加樣后以10ml/min流速,分別用5mmol/LpH3.5醋酸-醋酸鈉緩沖溶液和0.5mol/LpH4.0醋酸-醋酸鈉緩沖溶液洗脫,紫外檢測(cè)儀280nm檢測(cè)活性峰,部分收集器收集活性峰,透析除鹽凍干,-18℃保存?zhèn)溆?MTT法檢測(cè)多肽活性,Lowry法檢測(cè)蛋白含量,還原型SDS分析純度。11.pap組的篩選取BALB/c小鼠20只,隨機(jī)分為2組,每組10只,即空白對(duì)照組和PAP組(從上述3種提取方法中選取蛋白純度、含量高的1組作為PAP組)?？瞻讓?duì)照組每日腹腔注射生理鹽水1次,PAP組每日腹腔注射PAP1次(按10ml/kg體重計(jì)算,濃度為40mg/ml),連續(xù)20d。12.免疫活動(dòng)的檢測(cè)12.1對(duì)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響小鼠引頸處死,75%乙醇消毒,無(wú)菌條件下取出脾臟,經(jīng)200目篩網(wǎng)和淋巴細(xì)胞分離液分離出單個(gè)核細(xì)胞(MNC),按常規(guī)方法制備小鼠脾細(xì)胞懸液,用RPMI1640完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/ml,分種96孔板,每孔200μl,每次做3個(gè)重復(fù)孔,37℃,5%CO2全濕潤(rùn)培養(yǎng)68～72h,以MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。每隔7d測(cè)1次,并計(jì)算刺激指數(shù)。刺激指數(shù)SI=實(shí)驗(yàn)孔A/對(duì)照孔A。12.2低通插裝細(xì)胞懸液的制備試驗(yàn)前3d,腹腔注射1ml4%可溶性淀粉肉湯,3d后引頸處死小鼠,75%乙醇消毒,以冷灌洗液灌洗腹腔,收集腹腔滲出細(xì)胞懸液,用冷的RPMI1640培養(yǎng)基洗2次,再以完全培養(yǎng)基重懸,調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/ml,分種24孔培養(yǎng)板,37℃,5%CO2全濕潤(rùn)培養(yǎng)3h,棄去未貼壁細(xì)胞,以37℃預(yù)溫的RPMI1640培養(yǎng)基洗2次,再以完全培養(yǎng)基重懸,即得巨噬細(xì)胞懸液。用小鼠IL-12p40ELISA試劑盒(BD)檢測(cè)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12的水平。結(jié)果1.相對(duì)分子質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果表明,凍干鹿茸的含水量最低;可溶性多肽和蛋白含量最高,分別是冷凍鮮茸的9.48和7.08倍,是熱炸茸的14.20和8.36倍,見(jiàn)表1。從SDS圖可見(jiàn),凍干鹿茸抽提液蛋白帶濃度高,相對(duì)分子質(zhì)量分布廣,在相對(duì)分子質(zhì)量50000～60000之間有一條粗而濃的電泳帶。相比之下,冷凍鮮茸、熱炸茸抽提液的電泳帶濃度和數(shù)量明顯減少,均在相對(duì)分子質(zhì)量50000～60000之間有一條電泳帶,熱炸茸濃度最高的蛋白電泳帶在相對(duì)分子質(zhì)量十幾萬(wàn)處,見(jiàn)圖1。表明凍干鹿茸的可溶性多肽提取效果最好。2.mtt法檢測(cè)分離質(zhì)中各多肽峰的活性將凍干鹿茸粗提物的凍干品經(jīng)SephadexG-50分子排阻層析,洗脫圖譜見(jiàn)圖2,得到組分為A、B、C的3個(gè)多肽峰,MTT法檢測(cè)結(jié)果表明,組分B的活性較強(qiáng),組分A、C的活性較弱。收集組分B并凍干,凍干品呈白色粉末狀,易溶于水,其蛋白含量為21.3mg/ml。3.mtt法檢測(cè)分離分離中分離的活性成分將SephadexG-50分子排阻層析得到的組分B經(jīng)調(diào)整pH值及離子強(qiáng)度后,再經(jīng)CM-SepharoseFastFlow柱層析,洗脫圖譜見(jiàn)圖3,得到組分B1和B2,MTT法檢測(cè)結(jié)果表明,組分B2的生物活性較強(qiáng),B1的活性較弱,收集組分B2并凍干,凍干品呈白色粉末狀,易溶于水,其蛋白含量為82.8mg/ml。4.ef過(guò)濾層析分離SephadexG-50柱層析和CM-SepharoseFastFlow層析分離純化得到的多肽,經(jīng)還原型SDS檢測(cè),顯示為單一條帶,表明分離得到的鹿茸多肽純度較高。經(jīng)計(jì)算,PAP的相對(duì)分子質(zhì)量為3200,見(jiàn)圖4。5.免疫活動(dòng)的檢測(cè)5.1app對(duì)大鼠t和b細(xì)胞的克隆影響PAP組SI值均比對(duì)照組高,差異均有顯著意義(t≥1.645,P<0.05),表明PAP能明顯增強(qiáng)T、B淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng),見(jiàn)表2。5.2pap刺激腹部肝細(xì)胞產(chǎn)生il-12等級(jí)經(jīng)檢測(cè),PAP能明顯刺激腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-12,與對(duì)照組相比差異有顯著意義(t≥1.96,P<0.05),見(jiàn)表3。含紡加工對(duì)材料的提取對(duì)鹿茸的研究均證實(shí)鹿茸具有強(qiáng)大的生理功效,但對(duì)其藥理機(jī)制的研究尚處于初級(jí)階段。鹿茸的促生長(zhǎng)、促代謝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、健腦益智、抗衰老、生血、促進(jìn)傷口及骨折愈合的藥理作用是目前已知化學(xué)成分所無(wú)法解釋的。這一方面是因?yàn)槁谷资撬胁溉閯?dòng)物中生長(zhǎng)最迅速的可再生器官,在90d內(nèi)能迅速生長(zhǎng)發(fā)育成骨、血管、表皮、毛發(fā)和神經(jīng)等俱全綜合器官。這實(shí)際上是在大量細(xì)胞生長(zhǎng)因子調(diào)控下進(jìn)行的細(xì)胞生長(zhǎng)和分化過(guò)程。因此,鹿茸富含調(diào)控上述各器官組織發(fā)育成長(zhǎng)的各類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)因子,是一個(gè)高濃度多種類(lèi)的天然細(xì)胞生長(zhǎng)因子庫(kù)。另一方面,鹿茸的加工方法對(duì)其成分的收集有很大影響。傳統(tǒng)的加工方法是熱加工,其目的是使鹿茸脫水干燥,防腐消毒并最大限度保持其有效成分,使其既便于保存,又不影響療效。但這種加工方法會(huì)破壞鹿茸里所含有的活性肽、酶類(lèi)以及細(xì)胞因子。雖然近幾年加工方法有所改進(jìn),如采用水煮-遠(yuǎn)紅外線加工、雙電子自控遠(yuǎn)紅外箱技術(shù)加工等,但仍以熱加工為基礎(chǔ)。目前多數(shù)對(duì)鹿茸的化學(xué)、藥理研究的報(bào)告中所用的鹿茸均為熱加工飲片提取物(包括醇及其他有機(jī)溶酶提取),因此大部分不耐熱的活性成分被忽略,而所用的分離提取方法、條件及溶媒(常用有機(jī)相)也不能發(fā)現(xiàn)大分子活性物質(zhì),代表鹿茸藥理及臨床效果的主要成分依然不清,使得鹿茸藥理研究處于停滯不前的狀況。研究開(kāi)發(fā)冷凍干燥鹿茸粉提取工藝,可為分離提取鹿茸中活性物質(zhì)并進(jìn)一步研究鹿茸的藥理和臨床應(yīng)用提供原料保證。本實(shí)驗(yàn)采用的低溫提取環(huán)境,盡可能降低了鹿茸中活性物質(zhì)的損失,提高了提取物中有效成分的含量。國(guó)內(nèi)外學(xué)者相繼報(bào)道在鹿茸中發(fā)現(xiàn)各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子。Suttie等、江潤(rùn)祥等發(fā)現(xiàn)具有調(diào)節(jié)軟骨組織生長(zhǎng)的胰島素樣生長(zhǎng)因子;Gray等、Huo等分離得到具有刺激神經(jīng)纖維生長(zhǎng)活性的神經(jīng)生長(zhǎng)因子;Garcia等研究神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子基因;江潤(rùn)祥等分離使上皮細(xì)胞增生的