四種提取方法對(duì)油用酵母提取效果的比較

四種提取方法對(duì)油用酵母提取效果的比較

自1985年以來，日本首次使用微生物發(fā)酵生產(chǎn)-甲酰胺，真菌已成為生產(chǎn)多甲基脂肪酸的重要新資源。野生型菌株油脂及多不飽和脂肪酸含量均較低,必須經(jīng)誘變育種,才能篩選到高產(chǎn)菌株。由于菌株篩選是一種大量而繁重的工作,采用一種簡便、快速、有效的真菌油脂提取方法無疑會(huì)事半功倍。我們?cè)诙嗖伙柡椭舅岣弋a(chǎn)菌株的篩選工作中,建立了一種新的真菌油脂提取方法——酸熱法,本文將其與油脂提取常用的索氏提取法、有機(jī)溶劑法及超臨界CO2萃取法進(jìn)行了比較研究。1材料和方法1.1菌株來源及保藏中心1.1.1菌株:雅致枝霉(Thamnidiumelegans)、拉曼被孢霉(Mortierellaramanninace)、少根根霉(Rhizopusarrhizus)、畸雌腐霉(Pythiumirregulare)、橙黃紅酵母(Rhodotorullaaurantiaca),均購自中國科學(xué)院微生物研究所國家菌種保藏中心。1.1.2試劑及標(biāo)準(zhǔn)品:各種化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純;15種脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。1.2油脂、脂肪酸的萃取1.2.1酸熱法:發(fā)酵液離心集菌,菌體沉淀按每克菌6mL的比例加入4mol/L鹽酸,振蕩混勻,室溫放置30min后,沸水浴3min,-20℃速冷,加入2倍體積氯仿:甲醇(1∶1)提取液,充分振蕩后,5000r/min離心5min,取氯仿層,加等體積0.1%氯化鈉溶液,混勻,5000r/min離心5min,取氯仿層,揮發(fā)除去氯仿即得油脂。1.2.2索氏提取法:發(fā)酵液離心集菌,菌體沉淀于100℃烘干,研成粉末后裝入索氏提取器,石油醚加熱回流提取6h,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除石油醚即得油脂。1.2.3超臨界CO2萃取法(SCF-CO2法):美國DIONEX公司SFE——723型超臨界萃取儀。發(fā)酵液離心集菌,菌體沉淀于100℃烘干,研成粉末后裝入萃取管,萃取壓為40MPa,選用250mL/min限流管。萃取室溫度45℃,分離室溫度5℃。萃取時(shí)間50min。1.2.4有機(jī)溶劑法:發(fā)酵液離心集菌,菌體沉淀按每克菌體3mL的比例加入氯仿:甲醇(1∶2)提取液,充分振蕩2min,再加入1mL氯仿,振蕩混勻,加1.5mLH2O,振蕩混勻后5000r/min離心5min,取氯仿層,加等體積0.1%氯化鈉溶液,混勻,5000r/min離心5min,取氯仿層,揮發(fā)除去氯仿即得油脂。1.2.5油脂中脂肪酸的氣相色譜分析:0.2g油脂加入皂化液(0.5mol/LKOH-甲醇)2mL,混勻,于60℃水浴皂化至油珠消失,冷卻后加入甲酯化液(14%三氟化硼-甲醇)2mL,于60℃水浴甲酯化30min,冷卻后加入正己烷1mL,飽和氯化鈉1mL,離心后取上清夜,即可用AutosystemXL氣相色譜儀(美國Perkin-Elmer公司)分析油脂組成。FAMEwax石英毛細(xì)管色譜柱(30×0.32×0.25)。檢測器為氫火焰離子檢測器(FID)。進(jìn)樣口溫度225℃,檢測器溫度250℃,分流比10:1,線速30cm/min,衰減16。程序升溫條件為:柱溫190℃,維持1min,以0.3℃/min升至191℃,再以4℃/min升至225℃,維持15min。2結(jié)果2.14脂肪酸的組成及含量我們以雅致枝霉為材料,對(duì)4種方法提取油脂的綜合情況進(jìn)行了比較研究。從表1的結(jié)果可以看出,索氏法提取油脂的得油率最高,但其耗時(shí)最長,樣品需要量也較大;酸熱法與SCF-CO2法油脂得率相近,但酸熱法單位時(shí)間內(nèi)處理樣品的能力遠(yuǎn)高于SCF-CO2法,且樣品無需烘干處理;有機(jī)溶劑法雖簡便、快速,但油脂得率較低。2.2索氏法、酸熱法及SCF-CO2法提取的油脂的脂肪酸組成分析采用氣相色譜對(duì)油脂得率較高的索氏法、酸熱法及SCF-CO2法提取的油脂的脂肪酸組成進(jìn)行分析,3種方法獲得的油脂的脂肪酸組成及含量差別不大,結(jié)果見表2。經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲酯的保留時(shí)間比較,索氏法及SCF-CO2法提取的油脂含12種已知脂肪酸,且均含少量未知成分;酸熱法提取的油脂含11種已知脂肪酸,缺少C20∶3,且無未知成分。索氏法及SCF-CO2法提取的油脂中,C18∶∶1含量較酸熱法提取的油脂高,但酸熱法提取的油脂中營養(yǎng)必需脂肪酸(C18::2、C18::3(γ)、C18::3(α))含量(41.98%)較索氏法(36.36%)及SCF-CO2法(35.96%)提取的油脂明顯偏高。2.34不同真菌油脂得率的比較為更好地評(píng)價(jià)4種方法提取真菌油脂的效果,我們又分別采用4種方法提取了拉曼被孢霉、少根根霉、畸雌腐霉和橙黃紅酵母的油脂。從表3的油脂得率結(jié)果看,索氏法提取任何一種真菌油脂的油脂得率都最高;酸熱法和SCF-CO2法的效果相近,較索氏法的效果稍差;有機(jī)溶劑法僅在提取橙黃紅酵母的油脂時(shí)接近酸熱法的效果,對(duì)霉菌的提取效果很差。3提取高產(chǎn)菌株的方法4種真菌油脂提取方法中,有機(jī)溶劑法最為簡便易行,但油脂提取效果最差,原因是細(xì)胞破碎能力差,故而不能有效提取細(xì)胞內(nèi)油脂。酵母菌的細(xì)胞壁較霉菌脆弱,易于被破壞,故有機(jī)溶劑法提取酵母菌油脂的效果較提取霉菌好。在多不飽和脂肪酸高產(chǎn)菌株的誘變篩選中,菌株油脂含量是菌株取舍的重要指標(biāo)之一,有機(jī)溶劑法顯然不適合菌株篩選之用。在工業(yè)大生產(chǎn)中,經(jīng)球磨機(jī)或高壓勻漿處理后的破碎菌體,可以考慮采用有機(jī)溶劑浸提油脂。索氏法是油脂提取中最常用的方法。該方法油脂得率最高,但耗時(shí)也最長,樣品需先經(jīng)烘干處理,樣品的需要量也大。高產(chǎn)菌株的誘變篩選中,多采用搖瓶小量發(fā)酵,每批樣品處理量很大,索氏法難于滿足菌株初篩的要求。如在高產(chǎn)菌株的復(fù)篩及培養(yǎng)條件的優(yōu)化時(shí),索氏法因其準(zhǔn)確高效的特點(diǎn),可考慮作為首選方法。SCF-CO2法是新一代化工分離技術(shù),因其可在常溫下操作,有效防止提取物氧化分解,無溶劑殘留,安全性高等特點(diǎn)在生理活性物質(zhì)的提取、分離上獲得廣泛應(yīng)用。在真菌油脂的提取中,已有不少采用SCF-CO2法的報(bào)道。我們的研究結(jié)果表明,SCF-CO2法提取真菌油脂的效果雖較索氏法略差,但油脂的脂肪酸組成及含量相近,且樣品需要量小,樣品處理能力較索氏法大為提高。采用該方法的主要限制因素是需具有專門的儀器設(shè)備,但對(duì)具有儀器設(shè)備的單位,在菌株的篩選中,SCF-CO2法不失為一種較理想的油脂提取方法。酸熱法是我們參考胡蘿卜素提取的方法建立的一種新的油脂提取方法。該方法處理菌體,主要是利用鹽酸對(duì)細(xì)胞壁中糖及蛋白質(zhì)等成分的作用,使原來結(jié)構(gòu)緊密的細(xì)胞壁變得疏松,再經(jīng)沸水浴及速凍處理,使細(xì)胞壁進(jìn)一步被破壞,有機(jī)溶劑可有效地浸提出細(xì)胞中的油脂。酸熱法將細(xì)胞破碎與油脂提取結(jié)合在一起,提取能力大大加強(qiáng),油脂提取效果與SCF-CO2法相近。該方法操作簡便、快速,樣品不需任何處理,單位時(shí)間內(nèi)可處理大量樣品,極為適合菌株篩選之用。該方