蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)的生物樣品分析方法

蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)的生物樣品分析方法

隨著生物技術(shù)的繁榮和發(fā)展以及互補理論的進(jìn)步，越來越多的蛋白質(zhì)和多媒體藥物已經(jīng)開發(fā)，用于疾病的診斷和治療。目前常見的蛋白多肽類藥物有干擾素類、白細(xì)胞介素、生長因子類、單克隆抗體、細(xì)胞因子、抗凝血劑和血栓溶解劑等。蛋白多肽類藥物的生理活性強、療效高,在維持機體正常功能中發(fā)揮著重要的作用,目前已成為國際藥學(xué)界研究的熱門課題。體內(nèi)動力學(xué)過程的研究是任何藥物研發(fā)過程中必不可少的重要環(huán)節(jié),由于蛋白多肽類藥物具有相對分子質(zhì)量大、不易透過生物膜、易酶解、有多種降解代謝途徑等特點,使其體內(nèi)動力學(xué)研究有著重要意義。蛋白多肽類藥物的用藥劑量小、血藥濃度低、半衰期短,加之易受內(nèi)源性物質(zhì)干擾,對其體內(nèi)動力學(xué)研究的分析方法提出了很高的要求。因此選擇靈敏度高、專屬性強和在操作過程中樣品損失少的藥物分析方法至關(guān)重要。目前,用于蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)研究的常規(guī)分析方法主要有免疫學(xué)分析法、同位素標(biāo)記示蹤法、生物檢定法和理化分析技術(shù)4種。這4種分析方法都有各自的缺點,常常會影響到對藥物體內(nèi)動力學(xué)參數(shù)的解釋。在利用一種以上的分析方法來分析蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)過程時,也會出現(xiàn)不同結(jié)果,并且很難確定哪種分析方法更適合。除同位素示蹤法可以進(jìn)行在位檢測藥物的體內(nèi)分布外,其余方法都需進(jìn)行煩瑣的樣品獲得和處理步驟,卻不能得到藥物在體內(nèi)的實時過程。本文簡介目前這4種常規(guī)分析方法在蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)上的應(yīng)用,并對一種無損在位實時檢測技術(shù)——熒光標(biāo)記近紅外檢測技術(shù)在蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)無損實時在位分析上的應(yīng)用前景和尚待解決的問題進(jìn)行介紹。1傳統(tǒng)分析方法對蛋白質(zhì)丙酸酯中毒的動力學(xué)研究的應(yīng)用1.1elisa法檢測基因的表達(dá)免疫學(xué)分析法(immunoassay)是一種基于抗體-抗原反應(yīng)的分析方法,反應(yīng)信號產(chǎn)生于連接到抗原或抗體上的標(biāo)記物。由于蛋白多肽類藥物是生物大分子,具有免疫原性,因此免疫學(xué)分析法是其藥物動力學(xué)研究所選擇的常用定量分析法,具有快速、靈敏和經(jīng)濟(jì)的特點。免疫學(xué)分析法主要有三大類:酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、放射免疫測定法(RIA)和免疫放射測定法(IRMA)。ELISA具有靈敏度高和非放射性的優(yōu)點,可以批量測定。1971年瑞典學(xué)者Engvall和Perlman通過包被抗原到塑料表面發(fā)展ELISA來分析特異性的抗體。這種方法后來被改為兩點免疫測定系統(tǒng),就是將第一抗體吸附到塑料表面形成固相抗體,加入含相應(yīng)抗原的待測樣本,抗原與固相抗體結(jié)合成復(fù)合物,再加入特異性酶標(biāo)第二抗體,后者與已形成的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合,加入酶的相應(yīng)底物,根據(jù)酶催化底物顯示的顏色深淺對待測物進(jìn)行定性或定量分析。通過第二個酶標(biāo)記抗體的加入,增加了其檢測的靈敏度。如黃青山等自行建立的測定重組溶葡球菌酶的ELISA法檢測限達(dá)到0.98μg/L。Nirmala等利用抗生蛋白鏈菌素-辣根過氧化物酶(HRP)擴增系統(tǒng)作為ELISA法的檢測指標(biāo)來測定大鼠血漿中的粒細(xì)胞集落刺激因子,使其最低定量限能達(dá)到4.88ng/L。ELISA法的高靈敏度使其在蛋白多肽類藥物的體內(nèi)動力學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用。Statler等利用ELISA法研究了腹腔注射和皮下注射重組人紅細(xì)胞生成素(rEpo)在大鼠血漿和腦組織中的動力學(xué),結(jié)果表明rEpo通過循環(huán)系統(tǒng)透過血腦屏障的能力有劑量依賴性。Zhou等用驗證過的ELISA法研究了一個人類抗腫瘤壞死因子α單克隆抗體——golimumab在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中的體內(nèi)動力學(xué)并進(jìn)行了安全性評價。Quesada等采用ELISA法研究了免疫球蛋白抗蛇毒素在正常家兔和肌內(nèi)注射蝰蛇毒液模擬中毒家兔體內(nèi)的動力學(xué)過程,結(jié)果顯示抗蛇毒素在對照家兔和中毒家兔中的體內(nèi)動力學(xué)參數(shù)無明顯差異。Venkatesan等用ELISA法分析了促紅細(xì)胞生成素黏膜粘著劑片劑在大鼠和狗體內(nèi)的動力學(xué)研究,體內(nèi)動力學(xué)參數(shù)顯示黏膜粘著劑片劑有望成為蛋白類藥物口服給藥系統(tǒng)。RIA和IRMA都是利用放射性核素來進(jìn)行定量的測定方法,其測定結(jié)果的優(yōu)劣取決于抗體的選擇。由于這兩種測定方法都用到放射性核素,產(chǎn)生了對人體有傷害的輻射而使其應(yīng)用受到限制,逐漸被別的方法所取代。免疫學(xué)分析法雖廣泛用于蛋白多肽類藥物的定量分析,但也存在一些缺點:(1)缺少特異性,不能分辨出蛋白多肽類藥物的活性和非活性形式;(2)許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)如結(jié)合蛋白、抗體和代謝物會干擾測定;(3)給予蛋白類藥物后引起的抗體形成能導(dǎo)致免疫學(xué)分析法所測得的蛋白多肽類藥物的濃度的降低;(4)免疫分析法有基質(zhì)特異性,如一種適合分析血漿中蛋白類藥物的方法卻不適合測定尿樣中的相同蛋白多肽類藥物。1.2檢測放射性碘檢測方法同位素標(biāo)記示蹤法(isotopelabeltraceassay)是在被測分子上標(biāo)記放射性同位素來區(qū)分內(nèi)源性物質(zhì)與外源性藥物,再借助液閃儀等放射性探測設(shè)備讀取生物樣品的放射性計數(shù),以此推斷標(biāo)記藥物的血藥濃度的分析方法。該法靈敏度較高,并能同時了解標(biāo)記藥物在生物體內(nèi)的吸收、分布、排泄,因此在生物大分子藥物的組織分布分析上有突出優(yōu)勢。Plech等用同位素125I標(biāo)記的-白細(xì)胞焦激肽研究其在大鼠腦部和內(nèi)臟器官中的分布,發(fā)現(xiàn)其在腎上腺、下丘腦和大腦海馬部位有很高的積聚。標(biāo)記法有體內(nèi)摻入法和體外化學(xué)連接法兩種。體內(nèi)摻入法是將標(biāo)記3H、14C或35S等同位素的氨基酸加入到生長細(xì)胞或合成體系中,從而獲得同位素的蛋白多肽分子,但因操作復(fù)雜而很少使用。體外化學(xué)連接法常用的同位素是125I,其因比放射性高,制備簡單,半衰期短而被認(rèn)為是較理想的同位素標(biāo)記元素,應(yīng)用廣泛。125I標(biāo)記主要有氯胺T、Iodogen直接標(biāo)記法和Bolton-Hunter試劑間接標(biāo)記法。Iodogen法適于標(biāo)記含有酪氨酸或賴氨酸的蛋白,標(biāo)記效率高、反應(yīng)溫和;對于不含酪氨酸的蛋白可通過引入酪氨酸甲酯后再進(jìn)行標(biāo)記,但這種方法得到的標(biāo)記物存在體內(nèi)迅速脫碘并使放射性碘被甲狀腺所攝取的問題。Song等利用Bolton-Hunter試劑標(biāo)記血管抑素(angiostatin,AS)得到125I-BH-AS,并與常規(guī)的碘標(biāo)記方法得到的125I-AS進(jìn)行體內(nèi)穩(wěn)定性比較,在小鼠中進(jìn)行的體內(nèi)分布研究顯示,125I-BH-AS在小鼠體內(nèi)比125I-AS更具明顯的穩(wěn)定性,并且改善了AS在體內(nèi)的動力學(xué)特性。同位素示蹤法最大的應(yīng)用瓶頸是由于蛋白多肽類藥物進(jìn)入體內(nèi)會被降解代謝,降解生成的標(biāo)記氨基酸可再重新合成蛋白質(zhì),或與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,所以總的放射性強度不能代表生物大分子藥物的體內(nèi)過程?；谶@個缺點,同位素標(biāo)記示蹤法常與其他分離手段,如十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS)、高效液相色譜法(HPLC)聯(lián)合進(jìn)行。SDS法根據(jù)生物大分子藥物的分子質(zhì)量的大小選擇不同濃度的凝膠電泳,借助于控制電源等條件使原藥與其降解代謝產(chǎn)物分離,然后通過切取相應(yīng)凝膠條直接進(jìn)行放射性計數(shù)或放射自顯影方法分析電泳放射性圖譜。該法設(shè)備簡單,具有高分辨率、高靈敏度和高特異性的優(yōu)點,是一種較好的方法。同位素標(biāo)記示蹤法與HPLC法結(jié)合則以其高度的特異性等特點而成為技術(shù)最成熟、應(yīng)用最廣泛的體內(nèi)藥物分析手段,兩法結(jié)合可增強前者的方法特異性。反相HPLC(RP-HPLC)、排阻HPLC(SE-HPLC)、離子交換HPLC(IE-HPLC)分別根據(jù)保留時間與蛋白多肽的疏水-親水性、相對分子質(zhì)量大小、解離程度等特征分離樣品中待測物質(zhì),可同時測定原藥和降解產(chǎn)物,其中排阻HPLC也可得到有關(guān)結(jié)合物的信息,常采用梯度洗脫或階梯洗脫從而獲得較好的分離效果。Visich等利用排阻HPLC法分離定量125I標(biāo)記重組人凝血酶-內(nèi)源性抑制子復(fù)合物、125I標(biāo)記重組人凝血酶和游離的125I,結(jié)果顯示不管是經(jīng)過靜脈給藥還是皮下給藥,重組人凝血酶都會很快結(jié)合到內(nèi)源性抑制子上,并在肝部積聚后被清除。同位素標(biāo)記示蹤法雖然是蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)研究常用的分析方法,但其缺點也是顯而易見的:首先,其不能進(jìn)行人體藥物動力學(xué)研究,在動物實驗中對實驗人員也常產(chǎn)生輻射傷害;其次,隨著方法的復(fù)雜化,靈敏度、重現(xiàn)性和回收率受到影響,動物實驗前需預(yù)先進(jìn)行藥物的同位素標(biāo)記,試驗操作相對復(fù)雜;再次,同位素標(biāo)記后可能會引起藥物的生物活性及其在生物體內(nèi)的動力學(xué)行為發(fā)生變化。如Sohoel等用125I標(biāo)記門冬胰島素和未標(biāo)記的門冬胰島素進(jìn)行皮下注射吸收速率的比較,通過測定血漿樣品中的門冬胰島素含量顯示碘標(biāo)記明顯影響了門冬胰島素的皮下吸收。1.3體外動力學(xué)研究生物檢定法(bioassay)的基本原理是利用體內(nèi)模型、體外組織、細(xì)胞或酶等體系測定蛋白多肽類藥物的某種特異反應(yīng),通過劑量(或濃度)-效應(yīng)曲線對目標(biāo)蛋白多肽類藥物定量分析(絕對量或比活性單位)。該法一般分體內(nèi)分析和體外分析兩類,體內(nèi)分析法一般通過分析藥物的底物或產(chǎn)物而間接反映藥物的藥效,不能得到真正的藥物在體內(nèi)的動力學(xué)過程,所以蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)的分析一般采用體外分析法。體外分析法通常采用細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù),以細(xì)胞的增殖、分化或細(xì)胞毒性為基礎(chǔ),以細(xì)胞數(shù)目的增減為量效指標(biāo),如Wei等利用兩種新的治療用重組促紅細(xì)胞生成蛋白(EP1和EP2)刺激SD大鼠紅細(xì)胞生成的特性以評價其體內(nèi)動力學(xué)。也可利用體外酶體系進(jìn)行生物檢定法分析,如Han等利用水蛭素對抗凝血酶活性的影響間接分析了N-Ile1-Thr2-63-去硫重組水蛭素(rH)在家兔的體內(nèi)動力學(xué),實驗結(jié)果表明rH在家兔體內(nèi)迅速消除,分布局限于細(xì)胞間隙,在皮下注射點吸收迅速,主要通過腎排泄。生物檢定法也有活性代謝產(chǎn)物、生物基質(zhì)和血清中抑制因子等內(nèi)源性物質(zhì)對分析產(chǎn)生干擾的缺點,使方法的專屬性降低。1.4膜-質(zhì)譜分析技術(shù)的應(yīng)用理化分析技術(shù)(physicochemicalanalysistechniques)主要包括色譜法、毛細(xì)管電泳、質(zhì)譜法以及它們之間的聯(lián)用技術(shù)。色譜法對混合物有良好的分離鑒定能力,這種方法因具有高度的特異性,能精確定量并能同時測定多種成分而在藥物體內(nèi)動力學(xué)分析上占有重要的地位。色譜法中最常用的是HPLC法,包括RP-HPLC、SE-HPLC和IE-HPLC。HPLC法具有分離效率高、分離速度快等優(yōu)點,但對于多數(shù)蛋白多肽類藥物而言,由于尚未建立結(jié)構(gòu)與功能之間確切的對應(yīng)關(guān)系而使HPLC法不能得到廣泛的應(yīng)用,多需與其他方法聯(lián)用才能滿足分析的要求,如前面提到的同位素標(biāo)記、免疫方法,以及后面描述的液質(zhì)在線聯(lián)用。目前采用HPLC法直接進(jìn)行藥物動力學(xué)分析的蛋白多肽類藥物只有胰島素、生長激素等個別品種。毛細(xì)管電泳(CE)具有分辨率高、分析時間短、樣品用量少及操作簡單等諸多優(yōu)點。蛋白多肽類藥物具有擴散系數(shù)小的特點,而毛細(xì)管的柱效與樣品分子的擴散系數(shù)成反比,這正好適合于此類藥物的分析研究。高效毛細(xì)管電泳(HPCE)是電泳技術(shù)與色譜技術(shù)相結(jié)合的一種分析技術(shù),以高壓電場為驅(qū)動力,以類似于色譜柱的毛細(xì)管為分離通道,依樣品中被測組分之間電泳淌度和分配系數(shù)的不同而達(dá)到分離目的。HPCE分離效率高、上樣量少、分析速度快,是一種靈敏的蛋白多肽類藥物的分析方法,但該方法也存在檢測靈敏度不足和重現(xiàn)性差等缺點。質(zhì)譜法(MS)長期以來一直用于小分子化合物的結(jié)構(gòu)分析。直到20世紀(jì)80年代末電噴霧電離(ESI)和基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)兩種“軟電離”技術(shù)的出現(xiàn),才使質(zhì)譜用于分析蛋白多肽類大分子物質(zhì)成為可能。然而生物樣品的處理過程和生物樣品中蛋白多肽類藥物的含量太低都限制了其應(yīng)用。將液相色譜的高分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、強專屬性結(jié)合起來的液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)(LC-MS,LC-MS-MS)是近幾年發(fā)展起來的藥物體內(nèi)動力學(xué)研究分析方法。Becher等采用LC/ESI-MS/MS研究了一個含有56個氨基酸的重組蛋白質(zhì)藥物EPI-hNE4在猴體內(nèi)的藥物動力學(xué),定量限達(dá)到5μg/L,批間和批內(nèi)精密度以及準(zhǔn)確度良好且無基質(zhì)效應(yīng)。這種聯(lián)用技術(shù)能分析生物樣品中的痕量組分,靈敏度高,專屬性強,分析速度快,能同時獲得生物樣品中多種成分可靠的定性和定量結(jié)果。Yang等用LC-ESI-MS-MS分析了DADLE(H2N-Tyr-D-Ala-Gly-Phe-D-Leu-COOH)及其兩個前體藥物,利用內(nèi)標(biāo)法增加方法的精密度和準(zhǔn)確度,結(jié)果DADLE的定量限達(dá)到0.5μg/L,兩個前體藥物分別為2和5μg/L,在定量限至1000μg/L的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。2熒光標(biāo)記近紅外技術(shù)在腫瘤診斷和治療中的應(yīng)用近紅外技術(shù)的原理是近紅外光波段(700～900nm)在生物組織中水和血紅蛋白的吸收都很少,能穿透深度達(dá)幾厘米的組織且無任何副作用,同時激發(fā)的熒光受生物組織本底的影響較少,所以能在深層組織產(chǎn)生信號。利用近紅外光譜的組織穿透力,通過蛋白多肽類藥物的近紅外熒光染料標(biāo)記,再利用熒光技術(shù)的高靈敏度、特異性來定量分析藥物動力學(xué)特征,可實現(xiàn)體內(nèi)藥物的在位實時監(jiān)測。如Ramjiawan等用近紅外染料Cy5.5.18標(biāo)記抗腫瘤抗體片段NovoMab-G2-scFv,對后者在裸鼠體內(nèi)的動力學(xué)進(jìn)行了研究,近紅外成像顯示了標(biāo)記復(fù)合物的組織分布,顯示標(biāo)記復(fù)合物進(jìn)入體內(nèi)后主要分布在腎臟、肝臟和腫瘤組織中,另外,實驗得到了抗體片段在腫瘤組織內(nèi)的動力學(xué)參數(shù)和在腫瘤組織中的消除半衰期。在研究藥物或藥物載體在體內(nèi)的傳輸機制時,近紅外熒光成像技術(shù)成為一個有力的監(jiān)測手段,可研究跟蹤藥物或藥物載體在體內(nèi)的途徑,以確定藥物是否成功地傳輸?shù)阶饔冒形缓推鞴?。該技術(shù)可從分子、細(xì)胞水平上進(jìn)行分析,是一種分辨率相當(dāng)高的活體研究手段,只要藥物標(biāo)記上一定的熒光,這個分子就可以被跟蹤進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)運過程。多肽類藥物的體內(nèi)轉(zhuǎn)運和代謝途徑的研究適合使用近紅外顯影技術(shù)。如Camphausen等用Cy5.5標(biāo)記血管內(nèi)皮抑素研究了它在體內(nèi)對腫瘤附著的情況,熒光信號顯示它能在短時間內(nèi)錨定腫瘤,42小時后腫瘤區(qū)域藥物達(dá)到最大濃度。還有一些藥物可以連接在發(fā)射峰位于近紅外區(qū)的無機量子點上,通過近紅外熒光顯影對其分布代謝情況進(jìn)行考察。如Ren等通過11-巰基十一酸(MUA)將順鉑和金納米粒子結(jié)合,分析了這一抗癌藥物在體內(nèi)的傳遞過程。目前熒光標(biāo)記近紅外技術(shù)多應(yīng)用在腫瘤的診斷領(lǐng)域,應(yīng)用于蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)過程的研究還只是一個開端。而且,這項技術(shù)尚存在許多亟待解決的問題,如熒光染料自身的光漂白現(xiàn)象,標(biāo)記物質(zhì)體內(nèi)的熒光染料脫落,這些都會影響到定量、半定量分析的準(zhǔn)確性。蛋白多肽類物質(zhì)由于標(biāo)記了熒光物質(zhì)而導(dǎo)致其在體內(nèi)的處置發(fā)生變化。熒光標(biāo)記蛋白多肽類藥物進(jìn)入體內(nèi)后分布在不同的組織,由于這些組織深度不同、光學(xué)性質(zhì)也有差異,導(dǎo)致相同組織或不同組織相同濃度產(chǎn)生的表面熒光強度常常差別很大,給在位定量或半定量分析帶來困難。Patwardhan等設(shè)計了一種快速掃描熒光成像近紅外裝置,其利用多點矩陣掃描光學(xué)成像后,通過建立數(shù)學(xué)模型計算得出在不同深度的組織中熒光強度的大小,能夠?qū)崿F(xiàn)定量分析。但數(shù)學(xué)模型的建立過于煩瑣且可信度也不高。熒光標(biāo)記近紅外技術(shù)應(yīng)用到蛋白多肽類藥物體內(nèi)動力學(xué)的研究雖然面臨著很多困難,但其無損的實時的在位檢測優(yōu)點使這類藥物的研發(fā)有著誘人的前景。隨著水溶性更好、熒光效率更高的近紅外染料的不斷開發(fā)和近紅外檢測儀器的不斷完善,應(yīng)用熒光標(biāo)記近紅外技術(shù)建立蛋白多肽類藥物無損實時在位的檢測方法平臺一定能夠?qū)崿F(xiàn)并加速此類藥物的研究步伐。3蛋白多肽類藥物動