蜜蜂蜂毒蛋白研究進展

蜜蜂蜂毒蛋白研究進展

蜜蜂蜂蜜是蜜蜂和副病毒分泌的一種淡黃色透明液體，沉積在中毒的中后期，并從中毒的口袋中排出，這是中毒的一部分。工蜂的毒液主要用于防御其它動物對其本身或其巢穴的侵犯,蜂王的毒液則主要用于為取得蜂群內(nèi)的統(tǒng)治地位而與其它蜂王之間的爭斗(Xinetal.,2009)。蜂毒包含多種分子量大小不一的多肽和蛋白,具有多種藥理和生物學(xué)活性(Gauldieetal.,1976;Banksetal.,1979;ArgiolasandPisano,1985;Kreil,1995;SixandDennis,2000;BukuandPrice,2001;Favreauetal.2006),其組分主要包括活性酶類、多肽類、糖類、脂類、氨基酸類和胺類物質(zhì)等。目前,科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)許多蜂毒的毒蛋白在抗炎(Yoonetal.,2008)、抗癌(Sonetal.,2007)、抗菌(Ribeiroetal.,2004)、抗輻射和殺蟲(Rossetal.,1987)等方面具有很好效果;且蜂毒主要酶類的高級結(jié)構(gòu)已獲得解析,成為其它蛋白高級結(jié)構(gòu)預(yù)測的模體。由于蜂毒具有特殊的生物學(xué)功能,近年來,國內(nèi)外科學(xué)家已對蜂毒的主要成分磷脂酶A2、透明質(zhì)酸酶、蜂毒肽、蜂毒明肽、肥大細胞脫粒肽和鎮(zhèn)靜肽等開展大量研究,并取得重要進展。本文綜述了蜂毒的主要成分和功能研究方面的進展,旨在為進一步開展蜂毒領(lǐng)域的研究提供參考。1主要組成和功能1.1意大利蜜蜂pla2基因PLA2約占蜂毒干重的12%,按其來源和生化特性,隸屬于胞外分泌型PLA2堿性糖蛋白,是蜜蜂蜂毒的主要活性成分和過敏原。PLA2普遍存在于動物各組織的細胞膜及線粒體膜,水解位點是甘油磷脂分子中第2位酯酰鍵,可將其分解為溶血磷脂和脂肪酸。PLA2被稱為“間接的溶血毒素”,因為它與蜂毒肽協(xié)同作用,產(chǎn)生強溶血活性,促使紅細胞的溶解(Schmidt,1982;Owenetal.,1990;Kelleyetal.,1992)。目前科家學(xué)已對PLA2的基因結(jié)構(gòu)、生化特性和蛋白晶體結(jié)構(gòu)等進行了研究,獲得了一系列研究進展。1954年,Neumann和Habermann首次鑒定出意大利蜜蜂蜂毒中存在PLA2。Shipolini等(1974)測定了意大利蜜蜂PLA2的氨基酸序列,共有128個氨基酸,而Kuchler等(1989)從構(gòu)建的意大利蜜蜂工蜂毒腺cDNA文庫推斷出PLA2基因具有134個氨基酸殘基,Li等(2005)用RT-PCR方法克隆了意大利蜜蜂PLA2基因,測序結(jié)果表明其核苷酸序列全長為405bp,編碼134個氨基酸殘基,并得出該基因包含4個外顯子和3個內(nèi)含子,分子量為14.7kD,其后兩者的結(jié)果是一致的,修正了Shipolini等(1974)的意大利蜜蜂PLA2具有128個氨基酸的結(jié)論。Shipolini等(1974)推測PLA2基因共形成4對二硫鍵,并確定了其二硫鍵的位置,然而Scott等(1990)應(yīng)用X衍射方法獲得了意大利蜜蜂PLA2的晶體結(jié)構(gòu),并與牛胰PLA2的結(jié)構(gòu)進行比較,確定了意大利蜜蜂PLA2的5個二硫鍵位置,并確定了其Ca2+結(jié)合位點和酶活性中心,修正了Shipolini等(1974)提出的4對二硫鍵的理論。Dudler等(1992)成功地將人工合成的意大利蜜蜂PLA2基因轉(zhuǎn)入到大腸桿菌中進行表達,又進一步用養(yǎng)蜂人的血清作為第一抗體進行初步的Elisa分析,結(jié)果表明重組蛋白與天然意大利蜜蜂PLA2基因具有相同的酶活性和免疫活性。沈立榮等(2002;2004)克隆了中華蜜蜂和意大利蜜蜂的PLA2序列后,采用大腸桿菌表達系統(tǒng)將意大利蜜蜂PLA2基因進行表達和制備多克隆抗體,多克隆抗體對表達產(chǎn)物Westernblot分析結(jié)果表明表達產(chǎn)物與天然純意大利蜜蜂PLA2具有相同的活性。Hoffman等(2001)利用親和層析及離子交換層析的方法從歐洲熊蜂種(Bombusterrestris)的蜂毒中分離出PLA2,并且氨基酸測序表明熊蜂蜂毒PLA2與蜜蜂相似性僅有52.9%。Xin等(2009)通過對紅光熊蜂(Bombusignitus)毒腺cDNA文庫的ESTs分析,克隆分析了蜂毒PLA2的完整序列特征,并用蜂毒PLA2處理昆蟲Sf9細胞,免疫熒光染色表明其結(jié)合在細胞膜上,同時水解細胞膜上的磷脂并誘導(dǎo)細胞凋亡。在醫(yī)學(xué)研究中,PLA2具有與治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和心肌梗死等疾病相關(guān)的活性成分,因此具有重要的醫(yī)藥應(yīng)用價值(Mukherjeeetal.,1994;Eckeyetal.,1997;Nakashimaetal.,2004)。在分子生物學(xué)研究中,PLA2可以作為研究脂蛋白中磷脂結(jié)構(gòu)和生物膜的工具酶,同時,已獲得的PLA2晶體結(jié)構(gòu)可以作為一種模體,而應(yīng)用于其它相似毒蛋白高級結(jié)構(gòu)的預(yù)測(Hariprasadetal.,2012);其次由于蜂毒PLA2作為蜜蜂的防衛(wèi)性毒素成分,具有一定的殺蟲活性,在生物農(nóng)藥開發(fā)方面具有重要的應(yīng)用價值(Quistad,1988)。綜上所述,蜂毒中的PLA2在基因結(jié)構(gòu)、生化特性、高級結(jié)構(gòu)和應(yīng)用研究等方面已經(jīng)獲得了重要研究進展,這不但為開展其它動物毒素的研究提供了技術(shù)指導(dǎo),也為蜂毒過敏的診斷治療和蜂療新藥研制提供了理論基礎(chǔ)。1.2蜂毒中hraHya約占蜂毒干重的2%~3%,按其來源和生化特性,隸屬于糖蛋白,是蜜蜂蜂毒中主要過敏原之一(Kemenyetal.,1983;1984;Kettneretal.,1999),其主要功能是催化透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素及動物結(jié)締組織粘多糖聚合物長鏈中的N-乙酰葡糖胺與D-葡糖醛酸間的β-1,4糖苷鍵水解,生成透明質(zhì)酸氨基己糖苷酶(Henrissat,1991;Housleyetal.,2000)。成熟的蜂毒Hya包含349個氨基酸殘基,其分子量為40.746kD(GmachlandKreil,1993)。Hya為蜂毒進入動物組織以及為蜂毒的滲透和擴散打開了通道,因其具有很強的生物活性,故被稱為蜂毒的“擴散因子”(Habermann,1972)。Hya不同于其它的主要毒蛋白,其在蜜蜂毒囊內(nèi)的含量從蛹期的后期一直到整個成蟲期,Hya都基本上維持在一個相對恒定的水平,其含量不隨成年工蜂日齡的增長而變化(Owen,1979)。1940年Chain和Duthie(1940)首次報道了蜜蜂蜂毒中存在Hya,國外的一些科學(xué)家相繼詳細研究了蜜蜂Hya的基因結(jié)構(gòu)、生理生化特性和蛋白晶體結(jié)構(gòu)(Beard,1963;Habermann,1972;Schmidt,1982)。Gmachl和Kreil(1993)構(gòu)建了毒腺cDNA文庫,獲得了含有編碼Hya完整的基因序列,共1149bp,其編碼382個氨基酸殘基中編碼成熟肽的有349個氨基酸殘基,從而確定了意大利蜜蜂的Hya的氨基酸序列;沈立榮等(2002)利用RT-PCR方法成功克隆意大利蜜蜂Hya基因的全長并對其序列進行分析,其結(jié)果與Gmachl和Kreil(1993)結(jié)果一致。Soldatova和Mueller(1998)將意大利蜜蜂Hya在桿狀病毒和昆蟲細胞中進行了表達,結(jié)果表明其表達產(chǎn)物的活性比在大腸桿菌中表達的活性高。Housley等(2000)也利用桿狀病毒和昆蟲細胞表達的意大利蜜蜂Hya,獲得其晶體結(jié)構(gòu),并確定了其二硫鍵位置、糖基化位點、酶活性位點和三維立體構(gòu)象。Hya可以促進皮下輸液、局部積聚的滲出液或血液等的加速擴散而有利于吸收,也有消除水腫和血腫的作用,故其在臨床上可作為一種重要的藥物擴散劑。Hya常與其它注射液(如生理鹽水,腎上腺素和抗生素等)合用以促使皮下注射液被迅速吸收,還可以治療腸粘連和青光眼、白內(nèi)障及其并發(fā)癥、玻璃體視網(wǎng)膜等疾病(MenzelandFarr,1998),并可作為溶栓劑以減輕心肌梗塞及缺血損傷,近年來Hya在治療腫瘤方面所產(chǎn)生的良好效果,使其在臨床上的應(yīng)用日益普遍(Guedanetal.,2010;Whatcottetal.,2011)。1.3蜂毒肽前體蛋白及誘導(dǎo)活性化合物蜂毒肽又稱溶血肽,約占蜂毒干重的50%,是蜂毒中最主要的成分(RaghuramanandChattopadhyay,2007)。蜂毒肽由26個氨基酸殘基組成,中間區(qū)域具有19個疏水性氨基酸殘基,因其分子中存在2個脯氨酸殘基和3個精氨酸殘基,使其成為一個強堿性肽,其分子量約為2.84kD。蜂毒肽的一級結(jié)構(gòu)具有種間特異性,不同蜂種的蜂毒中獲得的蜂毒肽氨基酸長度相同,但序列存在差異。上世紀70年代,國外開始對蜂毒肽分子生物學(xué)研究,Kindas-Mugge等(1974)將從蜂王毒腺中提取的mRNA注入青蛙卵中,合成了蜂毒肽前體蛋白(promelittin)。Vlasak等(1983)利用質(zhì)粒pBR322構(gòu)建了蜂王毒腺cDNA文庫,并以蜂王毒腺總mRNA制作探針進行雜交,獲得了蜂毒肽的cDNA,而王關(guān)林等(2000)通過RT-PCR方法擴增得到了蜂毒肽前體蛋白的cDNA,測得序列長度為155bp,與Vlasak等(1983)發(fā)表的序列完全相同;另外再通過在蜂毒肽序列前引入羥胺裂解位點,以定點誘變的方式構(gòu)建了誘變蛋白表達載體,該載體與β-半乳糖苷酶部分序列相融合,結(jié)果在大腸桿菌中成功地表達了誘變蛋白,為基因工程生產(chǎn)蜂毒肽提供了新途徑。朱文赫等(2010)通過GST融合表達系統(tǒng),高效表達了蜂毒肽基因,解決了蜂毒肽對工程菌的致死問題,并證明人工表達的蜂毒肽與天然蜂毒具有相同的溶血活性,為通過基因工程技術(shù)生產(chǎn)蜂毒肽奠定了基礎(chǔ)。蜂毒肽具有很廣泛的生理功能,可以與生物膜相互作用,引起生物膜性能的一系列生物物理變化,表現(xiàn)出強溶血活性(Lavialleetal.,1980;HinchaandCrowe,1996;PapoandShai,2003),其透過混合脂膜和卵磷脂膜的速度超過任何表面活性劑,故其已經(jīng)作為一種模型肽,被廣泛用于鈣調(diào)蛋白作用機理、膜的作用機制等方面的研究(Schmidt,1982)。此外,蜂毒肽在抗癌(Winderetal.,1998)、抗菌(Fennelletal.,1968)和抗輻射(Ginsbergetal.,1968)方面也具有很好的效果。1.4蜂毒明肽基因生物活性成分序列的擴增和生物生態(tài)學(xué)檢測蜂毒明肽是蜂毒中第二個重要多肽,約占蜂毒干重的1%~2%。1967年,Haux等(1967)報道了其一級結(jié)構(gòu),確定其成熟肽是由18個氨基酸殘基組成,其分子量為2.035kD,二硫鍵位置為Cys1~Cys11(第1個半胱氨酸和第11個半胱氨酸)和Cys3~Cys15(第3個半胱氨酸和第15個半胱氨酸)(Schmidt,1982)。1995年,Gmachl和Kleil(1995)克隆了意大利蜜蜂蜂毒明肽的編碼基因,其報道的成熟肽序列與Haux等(1967)的研究結(jié)果相同。1995年,Gmachl和Kreil(1995)構(gòu)建了意大利蜜蜂工蜂毒腺的cDNA文庫,從其中篩選出前明肽原基因的cDNA序列,并從cDNA推導(dǎo)的氨基酸序列得到意大利蜜蜂工蜂前明肽原共由46個氨基酸殘基組成,其中前19個氨基酸殘基為信號肽,中間8個氨基酸殘基為前肽原,緊接著的18個氨基酸殘基為成熟肽,最后一個氨基酸殘基為酰胺化所必需的甘氨酸;另外,從意大利蜜蜂基因組中擴增獲得了前明肽原基因的全長序列,該基因由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成。張素方(2003)和浦升磊(2008)均采用RT-PCR方法克隆了意大利蜜蜂的前明肽原基因cDNA序列,全長均為141bp,其蛋白都是由46個氨基酸組成,預(yù)測的分子量都為5.1kD,與Gmachl和Kreil(1995)的結(jié)果一致;浦升磊(2008)對意大利蜜蜂蜂毒明肽的原核表達進行了研究,結(jié)果表明,大腸桿菌表達產(chǎn)物超聲破碎后SDS檢測到所表達蛋白質(zhì)為可溶性融合蛋白。張素方等(2003)和張愛提等(2011)均采用RT-PCR方法對中華蜜蜂明肽基因的cDNA序列進行了克隆,全長均為141bp,其蛋白也是由46個氨基酸組成,表明意大利蜜蜂與中華蜜蜂的蜂毒明肽的cDNA序列是一致的;張愛提等(2011)對其序列進行了生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明蜂毒明肽存在較明顯的信號肽序列和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu),具有生物抗菌肽的典型特性。綜上所述,多種蜜蜂的蜂毒明肽基因編碼序列已被克隆出來,其序列相對保守,在不同蜂種間其相似性大。蜂毒明肽可以通過血腦屏障,直接作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),它是一種很強的神經(jīng)毒素(Harbmann,1972;Banksetal.,1976)。低濃度蜂毒明肽可以通過調(diào)節(jié)腎上腺素的釋放,增加學(xué)習(xí)和記憶功能,并能增加下丘腦的去甲腎上腺素、5-輕色胺和多巴胺的含量,改善心功能,進而能預(yù)防全身性心血管衰竭等疾病。另外,由于該毒素能夠阻斷鈣離子通道和激活鉀離子通道,對一些受體具有高度的親和力和選擇性,故蜂毒明肽還被用作藥理學(xué)探針以純化離子通道蛋白和鑒定離子電流等(Huguesetal.,1982)。1.5肥大細胞脫粒肽原基因的生物學(xué)活性MCDP又稱401肽,約占蜂毒干重的1%~2%,由22個氨基酸殘基組成,分子量為2.48kD(Banksetal.,1976),二硫鍵位置為Cys3~Cys15(第3個半胱氨酸和第15個半胱氨酸)和Cys5~Cys19(第5個半胱氨酸和第19個半胱氨酸)(Schmidt,1982)。Kummar等(1988)用高分辨率的二維1H-NMR對MCDP進行了分析,其研究表明MCDP的氨基酸序列,二硫鍵的排列和三維結(jié)構(gòu)同蜂毒明肽類似,但其它研究結(jié)果表明它們具有完全不同的生物學(xué)活性(Gauldieetal.,1978;RomeyandLazdunsk,1984;Hider,1988)。1995年,Gmachl和Kreil(1995)構(gòu)建了意大利工蜂毒腺cDNA文庫,并從中篩選出了肥大細胞脫粒肽原基因的cDNA序列。張素芳等(2003)首次利用RT-PCR方法克隆了中華蜜蜂和意大利蜜蜂的肥大細胞脫粒肽原基因,序列長度均為341bp,都是由50個氨基酸組成,預(yù)測的分子量為5.5kD,并利用桿狀病毒和昆蟲細胞表達系統(tǒng)成功地表達了該基因。劉軍甫(2008)同樣利用RT-PCR方法克隆了意大利蜜蜂肥大細胞脫粒肽原基因,與張素芳等(2003)的結(jié)果一致,并利用GST基因融合表達系統(tǒng)在大腸桿菌內(nèi)表達,通過GST親和層析系統(tǒng)成功地純化出融合蛋白。MCDP具有兩種相互拮抗的生物學(xué)效應(yīng),一方面,MCDP能使細胞脫顆粒沉淀,釋放出組胺和5-羥色胺,具有明顯的抗炎作用;另一方面,低濃度的MCDP又可以促使肥大細胞脫粒,進而引起炎性反應(yīng);另外,MCDP對中樞神經(jīng)也有一定的活性(Schmidt,1982)。MCDP具有多種藥理學(xué)和免疫學(xué)效應(yīng),特別是其類似于過敏原,因此利用MCDP可用來研究炎癥細胞、白細胞以及嗜堿性粒細胞的分泌機制(Buku,1999)。1.6復(fù)配的氨基酸序列鎮(zhèn)靜肽約占蜂毒干重的1%,是蜂毒的主要多肽之一(Gauldieetal.,1976),由25個氨基酸殘基組成,其分子量為27.5kD,呈強堿性,二硫鍵位置為Cys9~Cys20(第9個半胱氨酸和第20個半胱氨酸)。鎮(zhèn)靜肽的生物活性類似于蜂毒肽,具有鎮(zhèn)靜、降壓、消炎、降體溫等藥理學(xué)活性作用(Gauldieetal.,1976)。Gauldie等(1976;1978)首次從大量的粗蜂毒中分離純化出鎮(zhèn)靜肽,隨后對鎮(zhèn)靜肽進行了氨基酸序列測定,結(jié)果表明其由24個氨基酸組成。Liu和Vernon(1984)也進行了鎮(zhèn)靜肽的氨基酸序列測序,在其結(jié)果中鎮(zhèn)靜肽為25個氨基酸,這比Gauldie等測得的鎮(zhèn)靜肽氨基酸序列末端多了一個脯氨酸。而1984年Vlasak和Kreil(1984)成功克隆了意大利蜜蜂鎮(zhèn)靜肽原基因cDNA序列,氨基酸推導(dǎo)表明,該基因共由77個氨基酸組成,相對分子量為8.7kD,從cD-NA推斷出的成熟肽序列,其結(jié)果也是25個氨基酸,與Liu和Vernon結(jié)果一致,從而確定了其氨基酸的組成。Zhang等(2003)也克隆了中華蜜蜂和意大利蜜蜂的蜂毒鎮(zhèn)靜肽原基因的cDNA,全長均為234bp,并利用GST融合表達系統(tǒng)在大腸桿菌