2021水質(zhì)細菌總數(shù)的測定平皿計數(shù)法

目 次前 言 ii1 適用范圍 12 規(guī)范性引用文件 13 術(shù)語和定義 14 方法原理 15 干擾和消除 16 試劑和材料 27 儀器和設(shè)備 28 樣品 29 分析步驟 310 結(jié)果計算與表示 4精密度和準確度 512 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制 513 廢物處理 6附錄A（資料性附錄）細菌總數(shù)檢驗記錄及報告推薦格式 7i水質(zhì) 細菌總數(shù)的測定 平皿計數(shù)法1 適用范圍本標準規(guī)定了測定水中細菌總數(shù)的平皿計數(shù)法。本標準適用于地表水、地下水、生活污水和工業(yè)廢水中細菌總數(shù)的測定。2 規(guī)范性引用文件標準。14581 湖泊和水庫采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ494 采樣技術(shù)指導(dǎo)HJ/T91 地表水和污水監(jiān)測技術(shù)規(guī)范3 術(shù)語和定義下列術(shù)語和定義適用于本標準。3.1細菌總數(shù) totalbacteria36℃培養(yǎng)48h，樣品在營養(yǎng)瓊脂上所生長的需氧菌和兼性厭氧菌菌落總數(shù)。3.2菌落形成單位 colony-formingunits（CFU）單位體積樣品中的細菌群落總數(shù)。4 方法原理將樣品接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，在特定的物理條件下（36℃培養(yǎng)48需氧菌和兼性厭氧菌總數(shù)即為樣品中細菌菌落的總數(shù)。5 干擾和消除5.1 時加入硫代硫酸鈉溶液（6.5）消除干擾。5.2 重金屬離子具有細胞毒性，能破壞微生物細胞內(nèi)的酶活性，導(dǎo)致細胞死亡，可在樣品采集（8.1）時加入乙二胺四乙酸二鈉溶液（6.6）消除干擾。16 試劑和材料水或去離子水。6.1 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。成分：蛋白胨 10g牛肉膏 3g氯化鈉 5g15～20g將上述成分或含有上述成分的市售成品溶解于1000玻璃容器中，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，儲存于冷暗處備用。避光、干燥保存，必要時以少量勤配為宜。當培養(yǎng)基顏色變化或脫水明顯時應(yīng)廢棄不用。6.2 無菌水：取適量實驗用水，經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌20min，備用。6.3 硫代硫酸鈉（Na2S2O3·5H2O）。6.4 乙二胺四乙酸二鈉（C10H14N2O8Na2·2H2O）。6.5 g/ml稱取15.7ml，臨用現(xiàn)配。6.6 稱取15d。6.7 玻璃珠：直徑3～8mm。7 儀器和設(shè)備7.1 采樣瓶：250ml帶螺旋帽或磨口塞的廣口玻璃瓶。7.2 高壓蒸汽滅菌器：115℃、121℃可調(diào)。7.3 恒溫培養(yǎng)箱：允許溫度偏差36℃±1℃。7.4 恒溫水浴鍋：47℃可調(diào)。7.5 pH計：準確到0.1pH單位。7.6 放大鏡或菌落計數(shù)器。7.7 一般實驗室常用儀器和設(shè)備。注：玻璃器皿及采樣器具試驗前要按無菌操作要求包扎，121℃高壓蒸汽滅菌20min備用。8 樣品8.1 樣品采集點位布設(shè)及采樣頻次按照GB/T14581、HJ/T494和HJ/T91的相關(guān)規(guī)定執(zhí)行。采集微生物樣品時，采樣瓶（7.1）不得用樣品洗滌，采集樣品于滅菌的采樣瓶中。2面10～15cm處，瓶口朝水流方向，拔瓶塞，使樣品灌入瓶內(nèi)然后蓋上瓶塞，將采樣瓶從水品采集完畢后，迅速扎上無菌包裝紙。3～5min，然后將龍頭關(guān)閉，用火焰灼燒約3min滅菌或用70%～75%的酒精對龍頭進行消毒，開足龍頭，再放水1min，以充分除去水管中的滯留雜質(zhì)。采樣時控制水流速度，小心接入瓶內(nèi)。采集地表水、廢水樣品及一定深度的樣品時，也可使用滅菌過的專用采樣裝置采樣。在同一采樣點進行分層采樣時，應(yīng)自上而下進行，以免不同層次的攪擾。去活性氯對細菌的抑制作用（每125ml容積加入0.1ml擾（每125ml容積加入0.3ml注：15.7mg硫代硫酸鈉（6.3）可去除樣品中1.5mg活性氯，硫代硫酸鈉用量可根據(jù)樣品實際活性氯量調(diào)整。8.2樣品保存采樣后應(yīng)在2h內(nèi)檢測，否則，應(yīng)10℃以下冷藏但不得超過6h。實驗室接樣后，不能立即開展檢測的，將樣品于4℃以下冷藏并在2h內(nèi)檢測。9分析步驟9.1樣品稀釋將樣品用力振搖20～25次，使可能存在的細菌凝團分散。根據(jù)樣品污染程度確定稀釋倍數(shù)。以無菌操作方式吸取10ml充分混勻的樣品，注入盛有90ml瓶中（可放適量的玻璃珠），混勻成1:10稀釋樣品。吸取1:10的稀釋樣品10ml注入盛有90ml無菌水的三角燒瓶中，混勻成1:100稀釋樣品。按同法依次稀釋成1:1000、1:10000稀釋樣品。每個樣品至少應(yīng)稀釋3個適宜濃度。注：吸取不同濃度的稀釋液時，每次必須更換移液管。9.2接種以無菌操作方式用1ml滅菌的移液管吸取充分混勻的樣品或稀釋樣品1ml，注入滅菌平皿中，傾注15～20ml冷卻到品或稀釋樣品與培養(yǎng)基充分混勻。每個樣品或稀釋樣品傾注2個平皿。9.3培養(yǎng)48h±2h后觀察結(jié)果。39.4 空白試驗無效，應(yīng)查明原因后重新測定。10 結(jié)果計算與表示10.1 結(jié)果判讀平皿上有較大片狀菌落且超過平皿的一半時，該平皿不參加計數(shù)。并乘以2代表全皿菌落總數(shù)。菌落的直徑，予以計數(shù)。緊密接觸而外觀相異的菌落，予以計數(shù)。10.2 結(jié)果計算來計算1ml樣品中的細菌總數(shù)。各種不同情況的計算方法如下：優(yōu)先選擇平均菌落數(shù)在30～300數(shù)符合此范圍時，以該平均菌落數(shù)乘以其稀釋倍數(shù)為細菌總數(shù)測定值（見表1例若有兩個稀釋倍數(shù)平均菌落數(shù)在30～3002，以兩者的平均數(shù)為細菌總數(shù)測定值；若大于或等于2，則以稀釋倍數(shù)較小的菌落總數(shù)為細菌總數(shù)測定值（見表1例若所有稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)均大于300，則以稀釋倍數(shù)最大的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為細菌總數(shù)測定值（見表1例若所有稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)均小于30，則以稀釋倍數(shù)最小的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為細菌總數(shù)測定值（見表1例若所有稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)均不在30～300之間，則以最接近300或30的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)為細菌總數(shù)測定值（見表1例表1 稀釋倍數(shù)選擇及菌落總數(shù)測定值示例不同稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)兩個稀釋倍數(shù)菌落數(shù)之比菌落總數(shù)（CFU/ml）1010010001136516420—1640022760295461.63775032890271602.2271004150308215005無法計數(shù)1650513—5130004續(xù)表示例不同稀釋倍數(shù)的平均菌落數(shù)兩個稀釋倍數(shù)菌落數(shù)之比菌落總數(shù)（CFU/ml）101001000627115—2707無法計數(shù)30512—3050010.3結(jié)果表示測定結(jié)果保留至整數(shù)位，最多保留兩位有效數(shù)字，當測定結(jié)果≥100CFU/ml時，以科示。細菌總數(shù)檢驗記錄及報告推薦格式參見附錄A。11精密度和準確度11.1精密度6個實驗室分別對低濃度（地下水，濃度均值為39值為2.5×103CFU/ml）和高濃度（生活污水，濃度均值為1.3×105CFU/ml）三個不同濃度細菌總數(shù)的樣品及有證標準樣品（濃度為95MPN/ml，可接受范圍為22～168MPN/ml）進行了6次重復(fù)測定：實驗室內(nèi)相對標準偏差范圍分別為2.4%～6.2%、0.6%～1.8%、0.3%～1.3%和1.7%～5.6%；實驗室間相對標準偏差分別為18%、4.7%、2.4%和3.7%；實驗室間95%置信區(qū)間見表2。表2 實驗室間95%置信區(qū)間低濃度（CFU/ml）中濃度（CFU/ml）高濃度（CFU/ml）有證標準樣品（CFU/ml）均值95%置信區(qū)間均值95%置信區(qū)間均值95%置信區(qū)間均值95%置信區(qū)間3931～502.5×1031.7×103～3.6×1031.3×1059.8×104～1.8×1056555～7611.2 準確度6個實驗室對含細菌總數(shù)濃度為95MPN/ml的標準樣品進行了6范圍為-13%～-4.6%；相對誤差最終值為-8.7%±6.5%。注：微生物檢測數(shù)據(jù)為偏態(tài)分布，其測定結(jié)果全部經(jīng)以10為底對數(shù)轉(zhuǎn)換后進行計算。12 質(zhì)量保證和質(zhì)量控制12.1 培養(yǎng)基檢驗更換不同批次培養(yǎng)基時要進行陽性菌株檢驗，以確保其符合要求。常用的陽性標準菌株5有大腸埃希氏菌（Escherichia30～300CFU/ml的菌懸液，充分混勻后取1ml菌懸液按接種（9.2）和培養(yǎng)（9.3）進行操作，平皿內(nèi)均勻地產(chǎn)生30～300個菌落，表明該批次培養(yǎng)基合格。12.2空白試驗13廢物處理使用后的廢物及器皿須經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30min或使用液體消毒劑（自制或市售）滅菌。滅菌后，器皿方可清洗，廢物作為一般廢物處置。6附錄A（資料性附錄）細菌總數(shù)檢驗記錄及報告推薦格式表A.1 細菌總數(shù)測定檢驗記錄項目名稱： 檢驗日期： 年 月 日檢驗方法方法依據(jù)滅菌鍋型號出廠編號培養(yǎng)箱型號出廠編號培養(yǎng)基滅菌溫度