生物物理技術(shù)論文(新)

磁性納米顆粒的體外細(xì)胞毒性評價(jià)方

法摘要：納米顆粒能夠滲透到膜細(xì)胞中，并沿神經(jīng)細(xì)胞突觸、血管和淋巴血管傳播。與此同時(shí)，納米顆粒有選擇性地積累在不同的細(xì)胞和一定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中。納米顆粒的強(qiáng)滲透性為藥物的使用提供了有效性，因此納米材料在醫(yī)學(xué)成像、疾病診斷、藥物傳輸、癌癥治療、基因治療等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，同時(shí)，納米顆粒對人體健康的潛在威脅也備受關(guān)注，納米毒理學(xué)研究由此應(yīng)運(yùn)而生。納米材料往往影響細(xì)胞的代謝活動，細(xì)胞膜的完整性，細(xì)胞凋亡和增殖。本文就細(xì)胞經(jīng)磁性納米顆粒處理后出現(xiàn)的特征，總結(jié)了幾種常用的毒性評價(jià)方法。關(guān)鍵詞：磁性納米顆粒；細(xì)胞毒性；檢測方法目錄TOC\o"1-5"\h\z引言1.針對線粒體功能障礙的檢測21.1MTT法21.2CCK-8試劑盒法31.3AlamarBlue法42.針對乳酸脫氫酶泄露的檢測（LDH法）43.針對細(xì)胞凋亡的檢測（形態(tài)學(xué)觀察）54.針對細(xì)胞壞死的檢測（細(xì)胞膜不完整）54.1中性紅染色54.2臺盼藍(lán)染色64.3乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠65.針對DNA損傷的檢測（彗星電泳法）6結(jié)論7.參考文獻(xiàn)7引言隨著科技的快速發(fā)展，納米材料因其特殊物理化學(xué)特性而被廣泛應(yīng)用于化妝品、電學(xué)器件、染料、涂料及醫(yī)藥診斷等各個領(lǐng)域［1-3］，尤其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的作用及其顯著，因此而備受關(guān)注，而人們對于納米材料對環(huán)境安全和人體健康所潛在的影響卻知之甚少。因此,納米毒理學(xué)應(yīng)運(yùn)而生。納米毒理學(xué)是專門研究納米顆?；虿牧隙拘缘膶W(xué)科,運(yùn)用一系列方法來分析納米材料在體內(nèi)和體外所產(chǎn)生的影響［4］。一般利用體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行納米材料的細(xì)胞毒性評價(jià),與動物活體實(shí)驗(yàn)相比，體外細(xì)胞檢測不會受道德上的束縛，更容易控制和復(fù)制，且花費(fèi)不高。在研究納米顆粒對細(xì)胞的毒性時(shí)，值得注意的是，細(xì)胞除了對被測試的潛在毒性劑的濃度波動敏感外，它們對所處環(huán)境中溫度、PH、營養(yǎng)物和廢棄物的濃度等的變化也很敏感。因此，為了確保檢測的細(xì)胞死亡相對于不穩(wěn)定的培養(yǎng)的條件，與加入的納米粒子的作用相關(guān)，控制實(shí)驗(yàn)條件是非常重要的。此外，由于納米顆?？梢晕饺玖喜⒕哂醒趸€原活性，采用合適的細(xì)胞毒性檢測方法也很重要。所以需要進(jìn)行重復(fù)檢測，以確保得出正確的結(jié)論［5］。磁性納米顆粒對細(xì)胞產(chǎn)生毒性影響導(dǎo)致細(xì)胞的變化有：炎癥、凋亡小體的產(chǎn)生、線粒體功能障礙、膜破裂導(dǎo)致乳酸脫氫酶的泄露、活性氧的產(chǎn)生、DNA損傷、染色體的濃縮等［6］(圖1)，本文就如何檢測這些毒性作用導(dǎo)致出現(xiàn)的特征對磁性納米顆粒的毒性檢測方法作一簡要綜述,以供大家對納米材料的細(xì)胞毒性進(jìn)行評價(jià)時(shí)作為參考。OXhufkinniahciiSPIONGeoeratLOiiofR.OSJ「OHQJDNAdmageMembraneleakagebictaleOXhufkinniahciiSPIONGeoeratLOiiofR.OSJ「OHQJDNAdmageMembraneleakagebictale血hydro驢冶uChnamcficnnecotkki^LioiiLmpatreclimtoehondfialfiiucticnApaptoticbodies圖1.納米顆粒的細(xì)胞毒性反應(yīng)針對線粒體功能障礙的檢測1.1MTT法MTT比色分析法由Mosmann在1983年首創(chuàng)。MTT全稱為3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學(xué)名為3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽，商品名：噻唑藍(lán)。是一種黃顏色的染料。其檢測原理為活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜(Formazan)并沉積在細(xì)胞中(圖2),而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜(DMS0)能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比［7］。MTT法被廣泛用于評價(jià)多種納米材料的體外細(xì)胞毒性。Morteza

等用此法檢測到不同濃度SPION處理下心臟細(xì)胞，腦細(xì)胞，腎細(xì)胞數(shù)量的變化（圖3）[8]這種方法有很多優(yōu)點(diǎn)，靈敏度高，簡單，快速又簡單，但是同時(shí)也有諸多缺點(diǎn)：由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，需被溶解后才能檢測。生成的甲瓚不易充分溶解。測試后的細(xì)胞不能繼續(xù)培養(yǎng)。圖2.線粒體中的琥珀酸脫氫酶使MTT還原為藍(lán)紫色結(jié)晶甲臜1.2CCK-8試劑盒法CellCountingKit-8簡稱CCK-8,是一種基于WST-8的廣泛應(yīng)用于細(xì)胞毒性的快速高靈敏度檢測試劑盒。WST-8是一種類似MTT的化合物，在電子耦合試劑存在的情況下，可以被線粒體的脫氫酶還原成橙黃色的formazan，用酶聯(lián)免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，不需要裂解細(xì)胞，可直接進(jìn)行比色。細(xì)胞毒性越大，則顏色越淺。顏色的深淺和細(xì)胞數(shù)目呈線性關(guān)系。此方法與MTT相比有明顯的優(yōu)點(diǎn)，首先，MTT被線粒體內(nèi)的脫氫酶還原生成的formazan不是水溶性的，需要特定的溶解液來溶解，細(xì)胞不可以重復(fù)使用，而WST-8和MTT類產(chǎn)品如XTT、MTS等產(chǎn)生的formazan都是水溶性的，可以省去后續(xù)的溶解步驟。其次，WST-8產(chǎn)生的formazan比XTT和MTS產(chǎn)生的更易溶解。用CCK一8法檢測后細(xì)胞可重復(fù)利用，將細(xì)胞用生理鹽水洗2遍，加入培養(yǎng)液可繼續(xù)培養(yǎng)進(jìn)行傳代，還可進(jìn)行染色和組化實(shí)驗(yàn)等，而MTT法不具備這一功能［9］?？傊?，CCK一8法顯色時(shí)間短、操作簡便、靈敏度高、重復(fù)性好，而且檢測后的細(xì)胞可重復(fù)利用，具有一定的實(shí)用性，可以替代MTT法并廣泛應(yīng)用。1.3AlamarBlue法Alamar-Blue檢測試劑為細(xì)胞毒性檢測提供了一種簡便、快速、可靠、安全的方法，適用于高通量檢測實(shí)驗(yàn)。此試劑的主要成分是一種氧化還原指示劑其在氧化狀態(tài)下呈現(xiàn)紫藍(lán)色無熒光性，而在還原狀態(tài)下，轉(zhuǎn)變?yōu)槌史奂t或紅色熒光的還原產(chǎn)物，其吸收峰為530—560nm。在細(xì)胞增殖過程中，細(xì)胞內(nèi)NADPH/NADP、FADH/FAD、FMNH/FMN和NADH/NAD的比值升高，處于還原環(huán)境。攝入細(xì)胞內(nèi)的染料被這些線粒體酶還原后釋放到細(xì)胞外并溶于培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基從無熒光的靛青藍(lán)變成有熒光的粉紅色。最后用普通分光光度計(jì)或熒光光度計(jì)進(jìn)行檢測吸光度和熒光強(qiáng)度與活性細(xì)胞數(shù)成正比。Alamarblue法對細(xì)胞的毒性小，對樣品破壞小、試劑用量少、操作簡單，特異性高、靈敏度高、重復(fù)性好。具有加入培養(yǎng)液里的細(xì)胞生存力不受影響而使培養(yǎng)可以持續(xù)進(jìn)行等優(yōu)點(diǎn)。Alamarblue法比傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)法和MTT可更準(zhǔn)確地測定細(xì)胞的增殖反應(yīng)，且能避免人為操作造成的試驗(yàn)誤差，提高了試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，方法安全、簡單、快速［10］。針對乳酸脫氫酶泄露的檢測（LDH法）LDH（乳酸脫氫酶）是一種穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，存在于正常細(xì)胞的胞質(zhì)中，正常情況下,LDH不能透過細(xì)胞膜，一旦細(xì)胞膜受損，LDH即被釋放到細(xì)胞外。此時(shí)培養(yǎng)液中LDH活性與細(xì)胞死亡數(shù)目成正比。LDH可使乳酸脫氫，進(jìn)而使NAD還原成NADH，后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT）,INT接受H+被還原成紫紅色甲臜類化合物。在酶標(biāo)儀上用490nm比色測定u。用此法檢測了超順磁性納米顆粒等不同納米顆粒對PC12細(xì)胞后細(xì)胞活力的變化［12］（圖4）。此法測定迅速,并且能夠進(jìn)行定量分析。但是乳酸脫氫酶是大分子,只有靶細(xì)胞膜完全被破壞后才能釋放出來，不能較早的反映細(xì)胞的存活狀況。影響因素較多，例如，培養(yǎng)基、測定環(huán)境的溫度、pH、反應(yīng)時(shí)間等［13］。

(農(nóng)一卻二(農(nóng)一卻二s?>EMVtBa;工0JEndoVSOPVSOP(25DM9F撫ml)[250陽Fe/ml)HOOpgFe/ml)圖.4不同納米顆粒對PC12細(xì)胞處理后的細(xì)胞活力變化針對細(xì)胞凋亡的檢測（形態(tài)學(xué)觀察）納米顆粒的細(xì)胞毒性可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，細(xì)胞凋亡后細(xì)胞膜仍完整，通過普通光學(xué)顯微鏡下可觀察到貼壁生長的凋亡細(xì)胞皺縮、圓化，細(xì)胞的體積變小?？梢姲ぐl(fā)泡的現(xiàn)象，細(xì)胞凋亡晚期可見凋亡小體。在熒光顯微鏡下，吖啶橙染色后，活細(xì)胞核染色質(zhì)呈現(xiàn)均勻分布的黃綠色熒光,胞質(zhì)呈橘紅色熒光，而凋亡細(xì)胞核染色質(zhì)的黃綠色熒光濃聚在核膜內(nèi)側(cè)（圖5）。透射電鏡下可觀察到細(xì)胞凋亡時(shí)特征性的超微結(jié)構(gòu)改變，如凋亡細(xì)胞體積變小，細(xì)胞質(zhì)濃縮，表面微絨毛消，核染色質(zhì)凝聚、邊緣化，呈新月形［14。］圖.5凋亡細(xì)胞的熒光顯微圖像針對細(xì)胞壞死的檢測（細(xì)胞膜不完整）4.1中性紅染色中性紅的攝入能力可以用來檢測細(xì)胞增殖或細(xì)胞毒性。中性紅不帶電荷，可以被活細(xì)胞所攝入，并在溶酶體中積累。在細(xì)胞增殖加快時(shí)，細(xì)胞數(shù)量增多，可以攝入的中性紅的量就會增加。在細(xì)胞受到損傷時(shí)，中性紅的攝入能力會下降。這樣通過對于中性紅攝入量的不同就可以確定細(xì)胞的增殖或毒性情況，它在540nm出有較高的吸收值。中性紅同時(shí)也是一種pH指示劑，在酸性時(shí)呈紅色，在pH6.8升至pH8.0時(shí)由紅色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。細(xì)胞核中的核酸呈酸性，因此細(xì)胞核會被染成紅色。由于溶酶體(lysome)中也是酸性環(huán)境，因此溶酶體也可以被中性紅染色液染成紅色。臺盼藍(lán)染色臺盼藍(lán)是帶電荷的分子，不能進(jìn)入正常的胞膜結(jié)構(gòu)完整的活細(xì)胞；而喪失活性或細(xì)胞膜不完整的細(xì)胞，胞膜的通透性增加，臺盼藍(lán)就會進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞染成藍(lán)色，并且在605nm波長處有較強(qiáng)的吸收。通過顯微鏡下直接計(jì)數(shù)或顯微鏡下拍照后計(jì)數(shù)，就可以對細(xì)胞存活率進(jìn)行比較精確的定量。通常認(rèn)為細(xì)胞膜完整性喪失，即可認(rèn)為細(xì)胞已經(jīng)死亡，這與中性紅作用相反。因此，借助臺盼藍(lán)染色可以非常簡便、快速地區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞。用此方法檢測細(xì)胞毒性，可重復(fù)性好。乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠該法包含兩種化學(xué)物質(zhì)，乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠。乙酰氧甲基鈣黃綠素，是電中性的酯分子，可以通過擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，一旦進(jìn)入細(xì)胞就會被酯酶轉(zhuǎn)化為帶綠色熒光的鈣黃綠素分子。相反，若細(xì)胞損壞或死亡，本身不能滲透進(jìn)入細(xì)胞的溴化乙錠與核酸結(jié)合，可激發(fā)發(fā)紅色熒光，在495nm出激發(fā)，乙酰氧甲基鈣黃綠素和溴化乙錠分別在515nm、635nm熒光信號最明顯。針對DNA損傷的檢測(彗星電泳法)彗星電泳技術(shù),即單細(xì)胞凝膠電泳(Singlecellgelelectrophoresis,SCGE),可用于觀察單個細(xì)胞DNA的損傷。比技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于放射生物學(xué)、DNA斷裂與修復(fù)、毒理學(xué)、腫瘤治療評價(jià)、細(xì)胞凋亡等領(lǐng)域的研究。將單個細(xì)胞懸浮于瓊脂糖凝膠中，經(jīng)裂解、堿化處理后，再在電場中進(jìn)行短時(shí)間的電泳，并用熒光染料染色，凋亡細(xì)胞中形成的DNA降解片段，在電場中泳動速度較快，使細(xì)胞核呈現(xiàn)出一種彗星式的圖案，而正常的無DNA斷裂的核在泳動時(shí)保持圓球形，彗星尾部即為遷移出類核的DNA片段。此時(shí)彗星尾部有可能還與頭部以單鏈或雙鏈的形式相連。DNA損傷越嚴(yán)重，導(dǎo)致DNA超螺旋結(jié)構(gòu)越松散，產(chǎn)生的斷裂點(diǎn)越多，DNA片段越小，從而在彗星尾部出現(xiàn)的DNA斷片越多，則慧尾的長度、面積和熒光強(qiáng)度越大(圖6)。通過測量彗星尾部的長度、面積或熒光強(qiáng)度等指標(biāo)，可以對DNA的損傷程度進(jìn)行定量分析，這是一種快速簡便的毒性檢測法［15。］?HMdDMA97.54%?HmJDNA83.25%HeadDMA6S.59%HeadOMa23,36^*圖6.熒光顯微圖像結(jié)論大量研究表明，多種納米顆粒顯示其細(xì)胞生物毒性效應(yīng)，因而納米材料的細(xì)胞生物毒性效應(yīng)研究工作廣泛開展，但是其細(xì)胞毒性評價(jià)方法仍有缺陷，對于納米材料的安全性評估還很不完善。納米顆粒的毒性效應(yīng)與納米顆粒的粒徑、比表面積、晶體構(gòu)象、暴露計(jì)量以及暴露方式有關(guān)，因此在完善納米材料毒性評估方法的同時(shí)，研究重點(diǎn)還要放在如何通過化學(xué)修飾保持納米材料的優(yōu)越性又避免其毒性效應(yīng)，使其更為安全、廣泛地應(yīng)用于各個領(lǐng)域。參考文獻(xiàn)1.Han,J.Y.,Z.T.Yu,L.Zhou.TheEffectsofDifferentHydroxyapatite/TiO2CompositeCoatingsonProteinExpressionofOsteoblast.inMaterialsScienceForum.2009.TransTechPubl.Lee,Y.J.,D.S.Ruby,D.W.Peters,B.B.McKenzie,J.W.P.Hsu,ZnOnanostructuresasefficientantireflectionlayersinsolarcells.Nanoletters,2008.8(5):p.1501-1505.Oberd6rster,G.,A.Maynard,K.Donaldson,V.Castranova,J.Fitzpatrick,K.Ausman,J.Carter,B.Karn,W.Kreyling,D.Lai,Principlesforcharacterizingthepotentialhumanhealtheffectsfromexposuretonanomaterials:elementsofascreeningstrategy.ParticleandFibreToxicology,2005.2(1):p.8.Marquis,B.J.,S.A.Love,K.L.Braun,C.L.Haynes,Analyticalmethodstoassessnanoparticletoxicity.Analyst,2009.134(3):p.425-439.Lewinski,N.,V.Colvin,R.Drezek,Cytotoxicityofnanoparticles.Small,2007.4(1):p.26-49.Singh,N.,G.J.Jenkins,R.Asadi,S.H.Doak,Potentialtoxicityofsuperparamagneticironoxidenanoparticles(SPION).NanoRev,2010.1.Mosmann,T.,Rapidcolorimetricassayforcellulargrowthandsurvival:applicationtoproliferationandcytotoxicityassays.JImmunolmethods,1983.65(1-2):p.55-63.Mahmo