大豆多肽分離純化技術(shù)研究進(jìn)展

大豆多肽分離純化技術(shù)研究進(jìn)展

大豆氨基酸對外部環(huán)境非常敏感。如果酸、堿、高溫和沉重的振動，它們可能會導(dǎo)致無序。它們原始液組成復(fù)雜，目標(biāo)產(chǎn)物濃度較低(一般<5%)，還含有大量其他雜質(zhì)，其中有些雜質(zhì)的物理化學(xué)性質(zhì)和目標(biāo)產(chǎn)物接近，這就給大豆肽的分離純化帶來很大困難。傳統(tǒng)多肽的分離方法有吸附沉淀、溶媒、萃取、離子交換法等，這些工藝往往繁雜，提取時間長，消耗大量原料，能耗高，產(chǎn)品回收率低。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和對大豆肽結(jié)構(gòu)和功能研究的深入，對大豆肽分離檢測研究也有了迅速發(fā)展，出現(xiàn)了許多高效的分離純化技術(shù)和手段，主要包括高效液相色譜，毛細(xì)管電泳、膜分離等。本文針對這些儀器的基本原理及分離模式，對用于大豆多肽分離純化的研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。1.1膜離離法1.1.1超濾技術(shù)的應(yīng)用潘巧明探討了大豆蛋白濃縮的工業(yè)化生產(chǎn)中，各種條件對聚砜中空纖維膜性能的影響。袁其明用分離技術(shù)處理大豆乳清廢水，截流分子量為8000Da的超濾膜，幾乎可以回收所有多肽和蛋白質(zhì)，再用納濾膜進(jìn)行濃縮，回收了蛋白質(zhì)、低聚糖，又大大降低了廢水排放量，取到了滿意效果。Turgeon等利用超濾膜技術(shù)，在線透析改變緩沖液的條件，縮短了分離純化的時間。沈蓓英運用不同種類的蛋白酶，控制酶解溫度、水解時間、水解pH及底物濃度，利用中空纖維超濾，實現(xiàn)對大豆蛋白抗氧性多肽的提取回收。1.1.3、納濾、微濾技術(shù)聯(lián)用目前，多種類型膜分離技術(shù)在生化產(chǎn)品應(yīng)用中協(xié)同發(fā)展，超濾、納濾、微濾技術(shù)聯(lián)用，取長補(bǔ)短，實行多級分離是大豆多肽分離純化的發(fā)展趨勢。PerMunkNielsend等采用超濾和納濾對大豆水解物進(jìn)行分離純化，獲得滿意效果。1.2分離純化和制備條件的確定高效液相色譜(HPLC)因其分離柱效高，選擇性好，已成為大豆多肽類物質(zhì)快速分離純化和分析的強(qiáng)有力手段，利用HPLC不僅可以在短時間內(nèi)完成分離的目的，而且還可制備生物活性多肽，因此分離純化和制備條件的選擇目前已成為學(xué)者研究的熱點。Wilce等利用HPLC，采用線性回歸方法對2106種肽保留性質(zhì)與結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，得出不同氨基酸組成對保留系統(tǒng)影響的關(guān)系。Henderson等報道了肽鏈長度、氨基酸組成、溫度等條件對保留值的影響，得出了每種多肽分離純化的最佳條件。Tisso等利用HPLC，采用多次分離的方法，分離純化出一種能夠提高免疫力和抗球菌等細(xì)菌侵襲的三肽。此分析方法快速簡便，非常利于大豆多肽的分離純化。1.2.1可溶性蛋白質(zhì)的活性物質(zhì)及活性Krusa等用RPLC對大豆蛋白進(jìn)行了純化和定量分析，Chen等結(jié)合離子交換、凝膠過濾和RP-HPLC用反相色譜梯度洗脫法分離了6種標(biāo)準(zhǔn)肽。鄧亦峰等采用HCl水解，反相高效液相色譜柱前衍生方法，測定了堿性蛋白酶處理可溶性蛋白質(zhì)中的AA含量。結(jié)果表明，所選方法準(zhǔn)確，結(jié)果不受蛋白質(zhì)中AA組成變化的影響。大量的科學(xué)實踐表明，低pH流動相，室溫或較高溫度及使用乙腈或異丙醇作為有機(jī)部分，最常用的添加劑三氟乙酸(TFA)作為RPLC離子對，是大豆肽較好的分離條件。目前RPLC分離柱為硅膠基質(zhì)的鍵合相填料為主體，對鍵合C18、C8烷基和苯基填料的研究，進(jìn)一步提高了柱效和選擇性,因而高分子基質(zhì)的RPLC填料的改性是當(dāng)今研究的熱點。白泉等利用德國的Nucleosil4000-7C18反相色譜填料，成功地對兩種化學(xué)合成多肽32肽、21肽進(jìn)行了分離，并制備純肽各100g。1.2.2iec的洗脫Wu等報道了利用離子交換色譜法，分離了三種蛋白質(zhì)的酶，并探討了分離提取條件，為分離此類物質(zhì)提供了有價值的數(shù)據(jù)。線性離子濃度梯度洗脫是IEC最基本的洗脫方式，通常大豆多肽濃度洗脫采用磷酸鹽。Kostel報道了用Tris或檸檬酸緩沖溶液的流動相中改變NaCl或KCl濃度以達(dá)到洗脫目的。韓香等報道了多肽分子分離純化的正負(fù)吸附離子交換色譜及各自的優(yōu)點。在制備純化中，使用離子交換柱十分方便，效率高，已成為大豆多肽一個重要的分離方法。1.2.3抗菌肽的提取馮杰龍等報道了利用SephadexG100凝膠柱分離，再用CM-SephadexpH等于5和pH等于6.5兩次離子交換柱成功地分離提取35～39肽的抗菌肽。Ljevakovic等選用凝膠過濾色譜SephadexG25和SP-SepadexC-25離子交換色譜，分離了肽聚糖單體衍生物。1.3離的液相分離技術(shù)毛細(xì)管電泳是繼高效液相色譜之后，將電泳技術(shù)和色譜技術(shù)相結(jié)合的一種新的分離技術(shù)，它是以高壓電場為驅(qū)動力，以毛細(xì)管為分離通道，依據(jù)樣品中各組分之間淌度和分配行為上的差異而實現(xiàn)分離的一類液相分離技術(shù)。在高壓作用下，帶電粒子在毛細(xì)管內(nèi)的溶液中遷移，遷移速度等于電泳和電滲流的矢量和。各種粒子因遷移速度不同而實現(xiàn)分離。具有分離率高、快速、用量少等優(yōu)點，是分離大豆多肽物質(zhì)的有效工具。隨著電泳技術(shù)的發(fā)展，以毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE)、膠束電場毛細(xì)管電泳(MECC)、毛細(xì)管等速電泳(CITP)、毛細(xì)管凝膠電泳(CGE)、毛細(xì)管等點聚焦(CIEF)等為代表的HPCE分離模式大大拓展了大豆多肽分離純化的運用范圍，加之與紫外吸收、激光誘導(dǎo)熒光電化學(xué)及質(zhì)譜等檢測手段相結(jié)合，更加確定了其在多肽研究領(lǐng)域的重要地位。1.3.1帶正電荷多肽MeCormick通過選用低pH緩沖液和降低電滲流，減少帶正電荷多肽與帶負(fù)電荷的解離硅羥基間相互作用，而使分離效率大大提高。林柄承等利用CZE成功將九個多肽組合分離。Issaq等利用CZE方法研究分離了5個9肽，分離速度快速準(zhǔn)確。1.3.2無膠：顆粒結(jié)構(gòu)的mecc分離據(jù)報道，環(huán)糊精加入，可使峰形變窄，熒光強(qiáng)度增加，更利于大豆多肽的分離純化。Liu等報道了加入環(huán)糊精，可使含疏水結(jié)構(gòu)的大豆多肽選擇性與環(huán)糊精的環(huán)孔作用而得到分離,同時其熒光強(qiáng)度明顯增加。最近在無膠篩分毛細(xì)管電泳中，使用不同結(jié)構(gòu)特性的混合表面活性劑或加入篩分介質(zhì)來控制溶質(zhì)——膠束間的相互作用，從而提高M(jìn)ECC的選擇性和分離度引起人們的探討。陳等利用PEO和SDS與Tris等表面活性劑，成功將大豆蛋白酶水解液中大豆多肽進(jìn)行了分離和檢測。1.3.3毛細(xì)管凝脈電泳CaoillaryGelElectrophoresisCGE1.4hplc-ms-ce聯(lián)用技術(shù)分離大豆多肽物質(zhì)大豆多肽的種類很多，大多具有相似性，使用單一的分離純化手段已經(jīng)不能達(dá)到理想的效果。毛細(xì)管電泳分離純化效果好，但也存在處理樣品少、不能進(jìn)行制備等缺點，而HPLC可以進(jìn)行大規(guī)模制備，特別是反相高效色譜RPLC具有分離效果好，分辨率高，回收率高，但費時、價高等特點，因此聯(lián)用技術(shù)在大豆多肽分離純化中已顯示出巨大的優(yōu)越性。HPLC-MS聯(lián)用已成為大豆多肽物質(zhì)快速分離鑒定的有力工具，通過質(zhì)譜可實現(xiàn)對大豆多肽物質(zhì)自動分離檢測。我國科學(xué)家谷勝人利用HPLC-MS聯(lián)用技術(shù)與電噴霧離子化質(zhì)譜，成功地對多肽混合物進(jìn)行了分離檢測。Hoffmann用HPLC-MS分離技術(shù)在3.5min內(nèi)完成了多肽分離鑒定。在大豆多肽物質(zhì)分離中，HPLC-CE聯(lián)用技術(shù)具有獨特優(yōu)點：選擇性高、靈敏度高、快速簡便，可用于梯度洗脫，特別適合大豆多肽的分離純化。把混合物先采用GC-MS進(jìn)行分離分析，再用CE進(jìn)一步分離純化，可以提高大豆多肽分離檢測效果。Pedro等應(yīng)用HPLC-MS-CE聯(lián)用技術(shù)，分離了多組分肽混合物。另外，高效毛細(xì)管電泳與毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）等聯(lián)用可以很好的分離一些復(fù)雜的大豆多肽物質(zhì)。2大豆多肽物質(zhì)分離純化的技術(shù)隨著大豆多肽分離純化技術(shù)的進(jìn)展，大大加快了新活性大豆肽的發(fā)現(xiàn)和合成速度，在大豆多肽合成中，許多雜質(zhì)顯示出與目標(biāo)產(chǎn)物相類似的性質(zhì)。隨著肽鏈的增長，分離難度也增大，需要方便、快速、靈敏準(zhǔn)確、通用性好的分離純化方法來支持。同時對大豆多肽物質(zhì)分離純化給蛋白質(zhì)組學(xué)和分析化學(xué)研究人員提供了一個廣闊的前沿領(lǐng)域。因此，建立一套完整的大豆多肽物質(zhì)分離純化技術(shù)具有十分重要的意義。隨著科學(xué)技術(shù)和蛋白質(zhì)組學(xué)的不斷發(fā)展，將有更多的化學(xué)研究人員熱衷于大豆多肽的分離純化，也將會涌現(xiàn)出更多的分離純化技術(shù)，這一領(lǐng)域的研究具有廣闊的前景。1分離純度1.1.2色譜分離技術(shù)gfc超濾在大豆多肽物質(zhì)濃縮應(yīng)用上越來越引人關(guān)注。目前超濾方法研究工作主要集中在膜材料選取方面。大豆多肽物質(zhì)具有熱敏性，受熱易被破環(huán)，采用傳統(tǒng)的提純方法不易除去低分子量的鹽分，從而影響產(chǎn)品的純度。采用納濾濃縮，既可降低能耗，還能將有機(jī)污染物和鹽分除去，達(dá)到提高產(chǎn)品質(zhì)量的目的。Pouliot用荷電超濾-納濾進(jìn)行了由胰蛋白酶水解乳清蛋白，分離得到多肽的實驗。Timmer使用各種聚合物超濾-納濾膜測試了分離氨基酸的效果，并應(yīng)用于混合氨基酸的分離。在大豆多肽分離純化中，微濾與其他技術(shù)聯(lián)用，以達(dá)到分離提純的目的。劉國慶等采用微濾和絮凝離心技術(shù)聯(lián)用，回收大豆蛋白中的生物活性大豆肽，分離效果好，將懸浮固體完全除去，脂肪去除率高，達(dá)99%。反相高效液相色譜利用非極性的反相介質(zhì)為固定相，極性有機(jī)溶劑(甲醇、乙腈等)或水溶液作流動相，根據(jù)流動相中被分離溶質(zhì)極性(疏水性)的差別發(fā)生強(qiáng)弱不同作用，使其在兩相中分配不同，進(jìn)行分離純化的色譜洗脫法。疏水性較弱的大豆多肽分子和固定相間的相互作用較弱，因此較快流出；反之，疏水性相對較強(qiáng)的大豆多肽分子較后流出。由于使用揮發(fā)性沖洗劑(三氟乙酸-乙腈)作為流動相，純化產(chǎn)品不必脫鹽，所以大大簡化了操作步驟，尤其對1000Da以下小分子大豆肽類物質(zhì)分離純化更為重要。RP-HPLC分離多采用降低流動相極性(水含量)的線性梯度洗脫法及窄梯度并延長洗脫時間方法：在初始洗脫條件下，洗脫液中有機(jī)成分濃度較低，大豆肽分子與固定相疏水作用較強(qiáng)，幾乎完全被固定相吸附。而一旦洗脫液中有機(jī)成分達(dá)到特定濃度，使得大豆多肽與固定相間作用小于流動相與固定相間的作用時，分子便可從固定相上洗脫下來，幾乎不再與固定相發(fā)生作用。洗脫液成分極微小改變就會大大影響大豆肽的保留行為，從而保證疏水特征相近的小分子大豆肽得以充分分離。離子交換色譜廣泛用于大豆多肽的分離純化。由于大豆多肽在一定pH和離子強(qiáng)度條件下帶電有微弱的差異，和離子交換劑靠靜電力結(jié)合在一起時，進(jìn)入介質(zhì)表面的可交換離子與帶相同電荷的蛋白質(zhì)分子就會發(fā)生交換的差異而分離。離子交換劑分為陰離子交換劑和陽離子交換劑兩大類，目前大豆多肽類物質(zhì)的分離所選用的離子交換介質(zhì)主要是親水性共聚物，如一些新型樹脂：離子交換纖維素、葡萄糖凝膠、大孔型樹脂、瓊脂糖凝膠樹脂等。由于洗脫劑的離子強(qiáng)度、鹽濃度等對分離純化影響顯著，故研究主要集中在分離純化大豆多肽物質(zhì)性質(zhì)、洗脫劑、洗脫條件等方面。GFC也叫凝膠色譜分子篩法，是利用凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，根據(jù)分子大小和形狀差異進(jìn)行分離的一種方法。當(dāng)樣品進(jìn)入凝膠柱后，較大分子不能通過孔道進(jìn)入凝膠柱體內(nèi)，而與流動相一起流出層析柱，而小分子則滲入凝膠內(nèi)。它具有分離條件溫和，產(chǎn)品收率高，生物活性好，分離面寬等優(yōu)點，廣泛用于大豆多肽物質(zhì)的分離純化中。凝膠色譜主要有Sephadex系列、Sephacry系列、Sepharose系列等。毛細(xì)管區(qū)帶電泳分離大豆多肽的原理是依據(jù)不同組分中化合物所帶質(zhì)荷比不同將其分離。分離效率只取決于物質(zhì)帶電性，因而分離準(zhǔn)確度高，效果好。但由于大豆多肽易被吸附到毛細(xì)管電泳內(nèi)壁上，而使峰形和電泳時間受到影響，因而根據(jù)分離大豆肽的性質(zhì)，選擇不同的分離條件（如柱材料組成、調(diào)整電泳液的pH、改變?nèi)苜|(zhì)電荷和淌度等）減少吸附，是目前主要研究方向。MECC