野木瓜多糖中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的研究

野木瓜多糖中蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法的研究

野生黃瓜是貴州省遵義正安縣獨(dú)特的野生自然資源。它是薔薇科和秋海棠灌木的一種附著。正安縣野木瓜品質(zhì)獨(dú)具特色,具有果大、皮薄、肉厚、肉質(zhì)細(xì)嫩、味甘酸、氣香等特點(diǎn)。木瓜在中醫(yī)藥學(xué)中用途廣泛,《中醫(yī)大辭典》、《本草綱目》、《本草拾遺》等著名醫(yī)著都記載了木瓜具有舒筋活絡(luò),解渴生津、平肝和胃、祛風(fēng)除濕等功效,能治療腰膝疼痛,腳氣水腫,痢疾霍亂,心痛腹痛等疾病,另外,還有鎮(zhèn)咳、清暑利尿、解酒祛痰等作用?，F(xiàn)代研究表明,野木瓜含有豐富的有機(jī)酸、果膠、蛋白質(zhì)、多種氨基酸、多種維生素和多種礦物質(zhì)。多糖是野木瓜中有效成分之一,野木瓜粗多糖中含有多種雜質(zhì),影響其多糖純度最主要的物質(zhì)為雜蛋白。如何快速,簡(jiǎn)單,準(zhǔn)確地對(duì)其中的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢出,無疑將直接影響著野木瓜多糖的純化效率和開發(fā)應(yīng)用。蛋白質(zhì)作為一項(xiàng)質(zhì)量和資源評(píng)價(jià)的重要指標(biāo),其含量必需明確,故探索測(cè)定野木瓜多糖的蛋白質(zhì)含量方法有重要的意義。目前關(guān)于野木瓜多糖中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定方法還鮮有報(bào)道,本實(shí)驗(yàn)采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法對(duì)野木瓜多糖中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定,與其它方法相比,該法簡(jiǎn)單、迅速,且相對(duì)較為準(zhǔn)確,是測(cè)定野木瓜多糖中蛋白質(zhì)含量的有效方法。1主要材料、設(shè)備和原則1.1實(shí)驗(yàn)試劑和試劑野木瓜:貴州遵義天樓野木瓜有限公司提供;野木瓜多糖:本實(shí)驗(yàn)室自制;牛血清白蛋白:進(jìn)口分裝,Sigma公司;考馬斯亮藍(lán)G-250:進(jìn)口分裝,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司;其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.2儀器、儀器和儀器HH·SH-Z型電熱恒溫水浴鍋:北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器廠;ZK-828型電熱真空干燥箱:上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;DWF-180型電動(dòng)植物粉碎機(jī):河北省黃驊市科研器材廠;SL2000電子天平:澳豪斯公司;UV2550紫外可見分光光度計(jì):島津公司;N-1000V-WB旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:日本東京理化器械株式會(huì)社;DL-5型離心機(jī):上海安亭科學(xué)儀器廠。1.3蛋白質(zhì)含量測(cè)定蛋白質(zhì)分子均具有酰胺基團(tuán),棕紅色的考馬斯亮蘭G-250染料上的陰離子與蛋白質(zhì)的酰胺結(jié)合,使溶液變?yōu)樗{(lán)色,其最大吸收峰也由465nm變?yōu)?95nm,蛋白質(zhì)在1μg~1000μg范圍內(nèi),蛋白質(zhì)與色素物質(zhì)結(jié)合物在595nm波長(zhǎng)下的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比,故可用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量。2方法2.1蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的制備精確稱取牛血清白蛋白10.00mg,用少量蒸餾水溶解定容至100mL,即為0.1mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液,4℃~5℃冰箱中保存。2.2試劑制備考馬斯亮藍(lán)g-200精密稱取考馬斯亮藍(lán)G-250100.00mg加入95%乙醇50mL,再加入85%磷酸100mL,最后用蒸餾水定容至1000mL,最終試劑含0.01%考馬斯亮藍(lán)G-250,4.7%乙醇,8.5%磷酸,置于棕色瓶中備用。2.3試驗(yàn)溶液的制備精確稱取野木瓜多糖100.00mg,加蒸餾水溶解定容至100mL,即為1mg/mL供試品溶液。2.4測(cè)試程序和方法:考馬斯亮藍(lán)g-200學(xué)生,10.10.8、10.8、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.9、10.8、10.9、10.9、10.9、10.8、10.8、10.9、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.9、10.9、10.9、10.9.9、10.9.9、10.9.9、10.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9.9,10.9.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8、10.8分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.5、0.7、0.8、0.9、1.0mL于10mL具塞試管中,各管加水至1mL,加入考馬斯亮藍(lán)G-250溶液5mL,混勻,放置10min,于595nm處測(cè)定其吸光度。2.5樣品中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定取供試品溶液各1mL,同時(shí)做三個(gè)重復(fù),以空白試劑為參比,按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定法,分別測(cè)定其吸光度值,計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)的含量。3結(jié)果3.1繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用紫外分光光度計(jì),以試劑空白參比,在595nm波長(zhǎng)處測(cè)定對(duì)照品溶液吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo),蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。得其線性回歸方程式Y(jié)=0.00635X+0.15735,R2=0.99859,相關(guān)系數(shù)r=0.9993,表明蛋白質(zhì)在1.67μg/mL~16.67μg/mL范圍內(nèi)很好地符合郎伯-比爾(LamberBeer)定律。3.2蛋白質(zhì)含量測(cè)定按上述蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法,同時(shí)做三個(gè)重復(fù),經(jīng)測(cè)定吸光度值分別為0.290、0.282、0.286,計(jì)算得野木瓜多糖中蛋白質(zhì)含量分別為12.57%、11.77%、12.17%平均含量為12.17%。3.3穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)取同一供試品溶液1mL,每隔10min測(cè)定1次,觀測(cè)其穩(wěn)定性,結(jié)果表明在顯色60min時(shí)間內(nèi)吸光度穩(wěn)定性較好,結(jié)果見表1。3.4精密度試驗(yàn)精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL)0.5mL進(jìn)行精密度試驗(yàn),連續(xù)進(jìn)行6次測(cè)定其吸光度,得RSD=0.58%小于5%,表明精密度好,結(jié)果見表2。3.5測(cè)定重現(xiàn)性檢驗(yàn)精密吸取來自同一批原料的試樣,按樣品測(cè)定方法,分別測(cè)定其吸光度,檢驗(yàn)該測(cè)定方法的重現(xiàn)性,得RSD=2.37%,小于5%,表明重復(fù)性較好,結(jié)果見表3。3.6加標(biāo)回收率的測(cè)定精密吸取已配制的1mg/mL供試品溶液0.5mL,分別加入0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液,按樣品測(cè)定方法,分別測(cè)定其吸光度,計(jì)算回收率,結(jié)果見表4,樣品平均回收率均為100.99%,RSD為2