酵母基因工程

酵母基因工程酵母基因工程的發(fā)展現(xiàn)狀釀酒酵母自身的改造（1） 將葡萄糖淀粉酶基因?qū)脶劸平湍福?） 將外源的蛋白水解酶基因?qū)脶劸平湍福?） 將8—葡聚糖酶基因?qū)虢湍福?） 將ATP硫酸化酶和腺苷酰硫酸激酶基因在釀酒酵母體內(nèi)表達(dá)（5） 將人血清清蛋白（HAS）的基因轉(zhuǎn)化到釀酒酵母2酵母表達(dá)異源蛋白（1）表達(dá)水平（2）表達(dá)質(zhì)量2酵母基因工程的發(fā)展趨勢(shì)（1） 解決酵母基因工程中還存在的缺陷（2） 在人類基因組計(jì)劃中的應(yīng)用研究是一個(gè)重要的發(fā)展方向（3） 利用酵母基因工程篩選更多新藥（4） 改造釀酒酵母自身，降低生產(chǎn)酒精的成本（5） 酵母的生理承受極限研究引起人們的關(guān)注3發(fā)展歷程1974年rlarck—walker和Miklos發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)釀酒酵母中存在質(zhì)粒。1978年Hmnen將來(lái)自一株釀酒酵母的leu2基因?qū)肓硪恢赆劸平湍?，彌補(bǔ)了后者的Leu2缺陷，標(biāo)志著酵母表達(dá)系統(tǒng)的建立。1981年Hinnen等用酵母基因表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了人干擾素。我國(guó)也在1983年首次用酵母菌表達(dá)了乙型肝炎病毒表面抗原基因。1996年在全世界科學(xué)家的通力合作下，完成了第一個(gè)真核生牛一釀酒酵母全基因組的測(cè)序。酵母基因工程的優(yōu)點(diǎn)安全無(wú)毒，不致??；有較清楚的遺傳背景，容易進(jìn)行遺傳操作；容易進(jìn)行載體DNA的導(dǎo)入。DNA轉(zhuǎn)化技術(shù)的不斷發(fā)展優(yōu)化，多數(shù)酵母菌可以取得較高的轉(zhuǎn)化率；培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單，容易進(jìn)行高密度發(fā)酵；能將外源基因表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中；有類似高等真核生物的蛋白質(zhì)翻譯后的修飾功能酵母表達(dá)系統(tǒng)（1）酵母表達(dá)載體①載體的基本構(gòu)架：大腸桿菌和酵母菌的“穿梭”質(zhì)粒。原核部分：大腸桿菌中復(fù)制的起點(diǎn)序列（ori）和抗生素抗性基因序列。酵母部分：1酵母菌中維持復(fù)制的元件：2p質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)；自主復(fù)制序列（ARS）；整合型載體的整合介導(dǎo)區(qū)。2營(yíng)養(yǎng)缺陷型基因序列、抗生素抗性基因序列3基因啟動(dòng)子和終止子序列4信號(hào)肽序列②載體的復(fù)制形式附加型載體：在酵母染色體外自主復(fù)制1釀酒酵母2p質(zhì)粒的DNA的復(fù)制元件所構(gòu)建的2酵母基因組DNA的自主復(fù)制序列ARS所構(gòu)建的整合型載體：隨同酵母染色體一起復(fù)制1含有與受體菌基因組有某種程度同源性的一段DNA序列，介導(dǎo)載體與宿主染色體之間發(fā)生同源重組。2常用的外源基因整合靶位點(diǎn)：rDNA宿主廣泛用于外源基因表達(dá)和研究的酵母菌包括：酵母屬釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)克魯維酵母屬乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)畢赤酵母屬巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)裂殖酵母屬非洲酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)漢遜酵母屬多態(tài)漢遜酵母(Hansenulapolymorpha)其中釀酒酵母的遺傳學(xué)和分子生物學(xué)研究最為詳盡，但巴斯德畢赤酵母表達(dá)外源基因最理想酵母DNA轉(zhuǎn)化原生質(zhì)體法:早期酵母菌的轉(zhuǎn)化都采用在等滲緩沖液中穩(wěn)定的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法，在Ca2+和PEG的存在下，轉(zhuǎn)化細(xì)胞可達(dá)原生質(zhì)體總數(shù)的1-2%離子溶液法:釀酒酵母的完整細(xì)胞經(jīng)堿金屬離子(如Li+等)、PEG、熱休克處理后，也可高效吸收質(zhì)粒DNA。103~104個(gè)轉(zhuǎn)化子々gDNA電穿孔法(electroporation)和粒子轟擊法(particlebombardment):酵母菌原生質(zhì)體和完整細(xì)胞均可在電擊條件下吸收質(zhì)粒DNA。105個(gè)轉(zhuǎn)化子々gDNA酵母分泌外源蛋白的糖基化1釀酒酵母分泌的多數(shù)外源蛋白均是過度糖基化的(>40個(gè)甘露糖殘基)；2巴斯德畢赤酵母分泌表達(dá)糖蛋白的寡糖鏈平均長(zhǎng)度約為8~14個(gè)甘露糖殘基3解脂耶氏酵母外源蛋白金含短的寡糖鏈(8~10個(gè)甘露糖殘基)釀酒酵母分泌的外源糖蛋白不適合作為藥物治療使用。四、釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)(1)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)釀酒酵母是發(fā)酵工業(yè)中的主要生產(chǎn)菌株，是最先建立的酵母表達(dá)系統(tǒng)。應(yīng)用：乙型肝炎疫苗、人胰島素、粒細(xì)胞集落刺激因子酵母表達(dá)系統(tǒng)的不足?較難進(jìn)行高密度發(fā)酵：發(fā)酵時(shí)產(chǎn)生乙醇，影響生長(zhǎng)代謝和基因產(chǎn)物表達(dá)；?蛋白質(zhì)的分泌表達(dá)能力較差；?蛋白質(zhì)的加工過程發(fā)生過度糖基化作用。表達(dá)盒式結(jié)構(gòu)組成:?啟動(dòng)子常用乙醇脫氫酶啟動(dòng)子(Padh1)和半乳糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(Pgal)。?分泌信號(hào)用釀酒酵母自身。-交配因子的分泌信號(hào)?終止子用CYC1基因的轉(zhuǎn)錄終止子(2)、巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)1、 巴斯德畢赤酵母巴斯德畢赤酵母是一種甲基營(yíng)養(yǎng)菌，能在低廉的甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，甲醇可高效誘導(dǎo)甲醇代謝徐徑中各酶編碼基因的表達(dá)，因此生長(zhǎng)迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所屬?gòu)?qiáng)啟動(dòng)子、表達(dá)的可誘導(dǎo)性是巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的三大優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用：乙型肝炎表面抗原、腫瘤壞死因子、表皮生長(zhǎng)因子和鏈激酶2、 巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)啟動(dòng)子強(qiáng)并受甲醇嚴(yán)格誘導(dǎo)，可用于調(diào)控外源基因的表達(dá)；能對(duì)重組蛋白進(jìn)行翻譯后必要的剪接、折疊和修飾，糖基化接近高等真核生物；外源DNA的轉(zhuǎn)化、基因替換、基因敲除等操作簡(jiǎn)單易行，外源蛋白的表達(dá)量比釀酒酵母增加10?100倍；容易進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，高密度培養(yǎng)干細(xì)胞可達(dá)100g/L以上。3、 巴斯德畢赤酵母的整合型載體啟動(dòng)子?基因AOX1的啟動(dòng)子(Paox1)，在它控制下的外源基因在甲醇誘導(dǎo)時(shí)能得到高效表達(dá)；?三磷酸甘油醛脫氫酶啟動(dòng)子(pgap),組成型啟動(dòng)子，不需甲醇誘導(dǎo)，外源基因表達(dá)量高。選擇標(biāo)記?對(duì)應(yīng)于營(yíng)養(yǎng)缺陷型受體的野生型基因：HIS4(組氨醇脫氫酶基因)；ARG4(精氨酸合成酶基因)；TRP1(色氨酸合成酶基因)；URA3(尿嘧啶合成酶基因)。?抗性選擇標(biāo)記：抗生素G418抗性基因和Zeocin抗性基因信號(hào)肽序列?由89個(gè)氨基酸組成的釀酒酵母的分泌信號(hào)a-交配因子4、 巴斯德畢赤酵母受體菌X-33為野生型畢赤酵母。GS115為HIS4突變型，是使用最廣泛的巴斯德畢赤酵母宿主菌，含甲醇利用AOX1和AOX2基因，甲醇利用能力與野生型一樣。KM71為HIS4突變型,A0X1基因缺陷的菌株，在甲醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)緩慢，廣泛用于多種外源基因的表達(dá)。5、 轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)化之前，將表達(dá)載體酶切線性化，使之整合于酵母基因組A0X1或HIS4基因位置，隨酵母生長(zhǎng)穩(wěn)定存在。轉(zhuǎn)化方法：原生質(zhì)體法、電擊法、LiCl2和PEG法6、 整合方式5’AOX1能與染色體發(fā)生同源重組，使受體染色體帶有一個(gè)拷貝的外源基因；染色體A0X1區(qū)與載體質(zhì)粒A0X1區(qū)發(fā)生單位點(diǎn)互換；染色體HIS4基因與載體的HIS4基因發(fā)生置換。7、 獲得高拷貝數(shù)整合轉(zhuǎn)化子的方法不同的轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)致產(chǎn)生天然高拷貝轉(zhuǎn)化子。原生質(zhì)體法轉(zhuǎn)化使細(xì)胞群中產(chǎn)生多拷貝轉(zhuǎn)化子頻率相對(duì)較高；體外在載體上多次插入目的基因片段；將載體中目的基因兩端連上來(lái)自宿主rDNA或其他非必需高重復(fù)的基因片段，通過同源重組而達(dá)到高拷貝整合的目的；利用基因的功能篩選高拷貝整合。8、 巴斯德畢赤酵母菌株的培養(yǎng)條件在甘油作碳源的培養(yǎng)液中，細(xì)胞迅速生長(zhǎng)，菌體密度逐漸增大，但外源