2024版高考生物總復(fù)習(xí)：基因工程生物技術(shù)的安全性與倫理問題熱點(diǎn)專題13PCR技術(shù)及其應(yīng)用課件

熱點(diǎn)專題13

PCR技術(shù)及其應(yīng)用[熱點(diǎn)歸納]1.概念PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的縮寫，它是一項(xiàng)根據(jù)DNA半保留復(fù)制原理，在體外提供參與DNA復(fù)制的各種組分與反應(yīng)條件，迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少量的DNA為模板，在短時(shí)間內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA。2.PCR的原理(1)DNA分子的熱變性原理。當(dāng)溫度超過90℃時(shí)，DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)將解體，雙鏈分開，這個(gè)過程稱為變性。溫度緩慢降低到50℃左右時(shí)，兩條彼此分離的DNA鏈重新結(jié)合成雙鏈，這個(gè)過程稱為復(fù)性。DNA雙鏈DNA單鏈(2)耐高溫的DNA聚合酶。高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動(dòng)化。(3)關(guān)于引物。①概念：引物是一小段能與DNA母鏈的一段堿基序列互補(bǔ)配對(duì)的短單鏈核酸。用于PCR的引物長(zhǎng)度一般為20~30個(gè)核苷酸。②作用：使DNA聚合酶能夠從引物的3'端開始連接接脫氧核苷酸，見下圖：(4)PCR(體外的DNA復(fù)制)的條件。①控制溫度，但不需解旋酶。②DNA模板。③原料：dNTP，包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP，除提供原料外，還提供能量。④耐高溫的DNA聚合酶。⑤分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物。⑥需要在一定的緩沖液中進(jìn)行。3.PCR的過程

(1)一般情況下，DNA模板鏈較長(zhǎng)，需要PCR擴(kuò)增的基因只是DNA模板鏈的一段。(2)第一輪循環(huán)，兩引物與模板鏈互補(bǔ)，DNA分子模板鏈最長(zhǎng)，新合成的DNA單鏈(含有引物的鏈)較短。(3)第二輪循環(huán)，以含有引物的母鏈為模板合成的DNA分子，會(huì)出現(xiàn)含有引物的DNA，其中新合成的單鏈b會(huì)比母鏈量更短，其實(shí)b就是我們所需擴(kuò)增的目的基因的長(zhǎng)度，只是b為單鏈。(4)第三輪循環(huán)，以b為模板合成的DNA片段就是目的基因片段的長(zhǎng)度。(5)結(jié)果分析。①兩條單鏈等長(zhǎng)DNA(目的基因)從第三輪循環(huán)開始出現(xiàn)(甲、乙)。隨循環(huán)次數(shù)的增加，目的基因含量會(huì)不斷增加。②通過以上分析可知，PCR反應(yīng)的產(chǎn)物不都是所需的目的基因片段，除目的基因外，還會(huì)存在四種類型的DNA分子(這四種類型同第二輪循環(huán)產(chǎn)生的4個(gè)DNA分子)。③DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列，等長(zhǎng)DNA(目的基因)從第三輪循環(huán)開始出現(xiàn)，隨著循環(huán)次數(shù)的增多，呈指數(shù)擴(kuò)增。4.PCR的應(yīng)用現(xiàn)在PCR技術(shù)已廣泛應(yīng)用于遺傳病的診斷、刑偵破案、古生物學(xué)、基因克隆和基因測(cè)序等。【典例】如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，簡(jiǎn)捷地分析出已知序列兩側(cè)的序列，具體流程如圖(以EcoRⅠ酶切為例)：請(qǐng)據(jù)圖回答問題：(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ主要存在于________生物中，限制酶存在于該類生物中的主要作用是____________________________。

(2)步驟Ⅱ用的DNA連接酶催化相鄰核苷酸之間的3'—羥基與5'—磷酸間形成____________；PCR每次循環(huán)一般可分為__________________(按順序書寫)三步，其中第二步的目的是____________________________。原核切割外源DNA，保證自身安全磷酸二酯鍵變性、復(fù)性、延伸引物與兩條模板DNA單鏈結(jié)合(3)若下表所列為已知的DNA序列和設(shè)計(jì)的一些PCR引物，步驟Ⅲ選用的PCR引物必須是________(從引物①②③④中選擇，填編號(hào))。

項(xiàng)目DNA序列(虛線處省略了部分核苷酸序列)已知序列

PCR引物①5'－AACTATGCGCTCATGA－3'②5'－AGAGGCTACGCATTGC－3'③5'－GCAATGCGTAGCCTCT－3'④5'－TCATGAGCGCATAGTT－3'③④(4)對(duì)PCR產(chǎn)物測(cè)序，經(jīng)分析得到了片段F的完整序列。下列DNA單鏈序列中(虛線處省略了部分核苷酸序列)，結(jié)果正確的是____________。

A.5'－AACTATGCG…………..AGCCCTT－3'B.5'－TTGATACGC…………..CGAGTAC－3'C.5'－GCAATGCGT…………..TCGGGAA－3'D.5'－AATTCCATG…………..CTGAATT－3'D【解析】(1)步驟Ⅰ用的EcoRⅠ是一種限制酶，主要存在于原核生物中，它能夠識(shí)別雙鏈DNA分子的某種特定核苷酸序列，進(jìn)而在特定部位將雙鏈DNA切開，顯然限制酶在原核生物中能切割外源DNA，保證自身安全。(2)步驟Ⅱ用的是

DNA

連接酶，DNA連接酶催化形成的是磷酸二酯鍵，即催化相鄰核苷酸之間的

3'—羥基與

5'－磷酸間形成磷酸二酯鍵；PCR循環(huán)包括變性、復(fù)性和延伸三步，該過程中升溫到95

℃是為了使DNA變性解旋，進(jìn)而獲得DNA單鏈，其中第二步復(fù)性是指引物與兩條模板DNA單鏈結(jié)合，進(jìn)而為后續(xù)的延伸做準(zhǔn)備。(3)由于DNA聚合酶只能從5'→3'方向催化子鏈延伸，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則可知，引物①是以目的基因下邊一條鏈的左端為模板向右側(cè)延伸，引物②是以目的基因上邊一條鏈為模板的右端向左側(cè)延伸，引物③是以目的基因下邊那條鏈的右端為模板向右側(cè)延伸，引物④是以目的基因上邊那條鏈的左端為模板向左側(cè)延伸，本題的目的是要擴(kuò)增已知序列兩側(cè)的未知序列，因此，應(yīng)該選擇引物③和④。(4)以下選項(xiàng)中，A、B、C都是已知序列，只有D是未知序列，而要測(cè)定的是未知序列，故選D。解題指導(dǎo)熟知PCR擴(kuò)增技術(shù)的原理、步驟和相關(guān)的技術(shù)流程是解答本題的關(guān)鍵，正確分析圖示的信息是解答本題的前提，明確題意是解答本題的基礎(chǔ)，掌握堿基互補(bǔ)配對(duì)原則是解答本題的法寶。[高考試練]1.(2021年廣東深圳模擬)基因工程中，需要用PCR技術(shù)獲取大量目的基因，通常是利用質(zhì)粒作為載體，將目的基因送入細(xì)胞中，PCR技術(shù)和對(duì)質(zhì)粒的改造是基因工程中重要的技術(shù)過程。回答下列相關(guān)問題：(1)PCR過程中加熱至90~95℃以后，需要冷卻到55~60℃，目的是______________________，在PCR反應(yīng)體系中需要加入引物，加入引物的原因是_______________________________________________________。(2)一個(gè)DNA分子上有多個(gè)基因，現(xiàn)需要獲取其中某一個(gè)基因作為目的基因，在引物設(shè)計(jì)時(shí)，要將2種引物設(shè)計(jì)在__________________，此時(shí)____________(酶)只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列。

使得引物和模板結(jié)合DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3'端延伸DNA鏈目的基因的上下游DNA聚合酶(3)通常用質(zhì)粒作為基因工程的載體，作為基因工程載體的質(zhì)粒需要滿足一些條件，現(xiàn)有兩種質(zhì)粒：①質(zhì)粒容易在物種之間轉(zhuǎn)移，②質(zhì)粒不能在物種之間轉(zhuǎn)移，應(yīng)該選擇________(填序號(hào))作為基因工程的載體。

(4)載體需要在受體細(xì)胞內(nèi)能進(jìn)行復(fù)制，同時(shí)能夠控制自身復(fù)制，闡述控制自身復(fù)制的目的：__________________________________________。

使目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)適宜的水平①【解析】(1)PCR由變性、復(fù)性、延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成，PCR中冷卻到55~60

℃，這一步叫復(fù)性，目的是使得引物和模板結(jié)合。引物是指在核苷酸聚合作用起始時(shí)，刺激合成的一種具有特定核苷酸序列的大分子，DNA聚合酶不能從頭合成DNA，只能從引物的3'端延伸DNA鏈，因此在PCR反應(yīng)體系中需要加入引物。(2)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因時(shí)，由于DNA聚合酶只能從3'端延伸DNA鏈，因此要用兩種引物才能確保DNA兩條鏈同時(shí)被擴(kuò)增，一個(gè)DNA分子上有多個(gè)基因，現(xiàn)需要獲取其中某一個(gè)基因作為目的基因，在引物設(shè)計(jì)時(shí)，要將2種引物設(shè)計(jì)在目的基因的上下游，此時(shí)DNA聚合酶只能特異性地復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的DNA序列。(3)質(zhì)粒作為基因工程常用載體必須具備的三個(gè)條件：①能在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制并穩(wěn)定保存，②具有多個(gè)限制酶酶切位點(diǎn)方便剪切，③具有標(biāo)記基因，有利于檢測(cè)?；蚬こ淌侵笇⒁环N生物體(供體)的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體(受體)內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的DNA體外操作程序，因此載體需要容易在物種之間轉(zhuǎn)移，因此應(yīng)該選擇①作為基因工程的載體。(4)載體需要在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定地保存下來并大量復(fù)制，以便提供大量的目的基因，同時(shí)能夠控制自身復(fù)制，不能使目的基因過度復(fù)制，也不能讓目的基因過少，因此控制自身復(fù)制的目的是使目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)保持相對(duì)適宜的水平。2.(2022年河北秦皇島檢測(cè))常見的新冠病毒的檢測(cè)方法是新冠病毒核酸檢測(cè)，原理為實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT－PCR)檢測(cè)法，技術(shù)流程如下圖所示，①②③表示相關(guān)步驟。請(qǐng)回答：(1)PCR技術(shù)與DNA體內(nèi)復(fù)制過程相比，兩者的復(fù)制方式都是______________。

RT－PCR過程中，需先以RNA為模板合成cDNA，故裝置中需添加____________酶。

(2)過程①中，RNA提取裂解液可同時(shí)滅活病毒，原因是____________________________。采集到的樣本要迅速進(jìn)行病毒滅活處理，其目的是________________________________。步驟③需要的酶是______________，引物F和引物R是根據(jù)____________________________序列合成的。

半保留復(fù)制逆轉(zhuǎn)錄蛋白酶K能催化病毒蛋白質(zhì)水解提高樣本轉(zhuǎn)運(yùn)和檢測(cè)階段的安全性TaqDNA聚合酶一段已知的新冠病毒RNA的堿基(3)在進(jìn)行新冠病毒核酸檢測(cè)時(shí)，通常以病毒的ORF1b基因?yàn)闄z測(cè)的目標(biāo)基因，是因?yàn)镺RF1b基因具有____________________________________的特點(diǎn)。

特異性強(qiáng)、基因結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定(變異小)【解析】(1)PCR技術(shù)與DNA體內(nèi)復(fù)制的復(fù)制方式都是半保留復(fù)制。RT－PCR過程中cDNA的合成為逆轉(zhuǎn)錄過程，