氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿對血管內皮細胞m受體基因表達調節(jié)作用的比較

氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿對血管內皮細胞m受體基因表達調節(jié)作用的比較

血管內皮細胞具有重要的功能作用。乙酰膽堿（ach）可誘導表皮內皮細胞擴張反應，是評估血管內皮細胞功能是否正常的經典指標。Khurana等在M3基因敲除小鼠主動脈上研究發(fā)現:ACh誘發(fā)的內皮依賴性血管舒張反應大大減弱,因此認為主動脈內皮依賴性血管舒張反應主要是由M3介導的。Yamamada等采用同樣的方法研究認為腦微動脈內皮依賴性血管舒張反應主要是由M5介導的。本實驗室研究發(fā)現M受體亞型非選擇性激動劑毛果蕓香堿在濃度高達100μmol·L-1時仍不能誘發(fā)內皮依賴性血管舒張反應,而其他M受體亞型非選擇性激動劑如氨甲酰膽堿等均可誘發(fā)內皮依賴性血管舒張反應,這一現象在其他實驗室已經得到證實。由此推論氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿對血管內皮細胞M受體作用不同,氨甲酰膽堿可以激活血管內皮細胞M受體,誘發(fā)內皮依賴性血管舒張反應,而毛果蕓香堿則不可。本文以氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿為工具藥,觀察二者對M受體各亞型基因表達的影響,在基因水平分析二者對內皮依賴性血管舒張反應產生不同效應的原因。1材料和方法1.1其他coearol和osti合酶產品DMEM培養(yǎng)基、小牛血清、,TRlzol、SuperScriptTM為GibcoBRL公司產品;膠原酶、氨甲酰膽堿、毛果蕓香堿為Sigma公司產品;Oligo(dT)15、dNTP、RnasinⅠ、DNaseⅠ、TaqDNA聚合酶為Promega公司產品。GDS-8000凝膠成像儀為UVP公司產品。1.2em培養(yǎng)基急性分離牛主動脈,0.1%膠原酶消化內皮細胞,接種于培養(yǎng)瓶內,加入含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基。取3～5代生長良好無雜細胞污染的內皮細胞,換入含0.5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)12h,分別加入DMEM培養(yǎng)基、氨甲酰膽堿(carbachol)、毛果蕓香堿(pilocarpine),藥物終濃度為10-4mol·L-1,給藥后10h提取細胞總RNA。1.3總rna表達按TRIzol試劑盒操作方法提取細胞總RNA,加入DNaseⅠ以防止DNA污染,取少量做總RNA定量,調整濃度為1μg·μl-1,-70℃凍存。1.4go-dtdtpcr擴增按SuperScriptTMⅡ推薦方法進行,終體積20μl,其中總RNA5μl,500μg·μl-1Oligo(dT)151μl,10mnmol·L-1dNTP1μl,5×buffer4μl,0.1mol·L-1DTT2μl,RNasinⅠ1μl,SuperScriptTMⅡ1μl,Nucleasefreewater5μl。PCR擴增儀上運行:65℃5min,42℃50min,70℃15min;4℃保存。1.5-actin-mM受體各亞型和作為內參照的β-actinPCR反應寡核苷酸引物由上海博亞公司合成,引物序列見表1。PCR反應終體積為25μl,其中50pmol·μl-1上下游引物、10mmol·L-1dNTP、5U·μl-1Taq酶各0.5μl,上述方法合成的第一鏈cDNA2μl,10×buffer2.5μl,ddH2O18.5μl。PCR反應條件:94℃5min;94℃30s,61℃(M1、M3、M4、M5)/56℃(M2、β-actin)30s,72℃60s,35個循環(huán);72℃10min。β-actin和M受體各亞型用同一模板進行擴增。以模板為不經過反轉錄的總RNA作為陰性對照,擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳,UVPGDS-8000凝膠成像儀進行圖像分析,P<0.05表示差異有顯著性。1.6統(tǒng)計處理采用SAS統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數據以均數±標準差()表示,組間比較采用Dunnettu分析。2結果2.1雙鏈生物酶質量比b細胞總RNA的OD260/OD280均大于1.8,說明RNA中蛋白質和DNA殘量極少,RNA質量可靠。將RNA反轉錄合成雙鏈cDNA,1.2%瓊脂糖凝膠電泳顯示雙鏈cDNA呈現為大小介于0.5kb到5kb之間的彌散條帶,說明制備的雙鏈cDNA質量較好。以未經反轉錄的總RNA進行RT-PCR,未擴增出特異條帶,作為陰性對照,以排除樣品中DNA污染。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳顯示M受體5個亞型均出現了與預期長度相匹配的特異性條帶,部分基因擴增產物進行了測序,符合相應GenBank數據(圖1)。用GDS-8000Labworks軟件對電泳結果進行圖像分析,以各基因條帶灰度值與相同模板β-actin條帶灰度值的比值作為mRNA表達的相對值,M,～M5的相對表達值分別為0.20±0.11、0.20±0.02、0.12±0.06、0.31±0.02、0.28±0.08(圖2)。2.2m受體的亞型氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿10-4mol·L-1分別作用于牛主動脈血管內皮細胞10h后,M受體5個亞型mRNA表達量均顯著增加,與給藥前相比有顯著性差異(P<0.01,n=6),氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿之間無差異(圖3、4)。3民間海因基因激活氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿均為M受體非選擇性激動劑,能激活不同部位的M受體,但對血管內皮上存在的M受體作用不同,具體表現為氨甲酰膽堿可以激活M受體,誘發(fā)內皮依賴性血管舒張反應,而毛果蕓香堿則不可。本研究發(fā)現氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿均能上調M受體5種亞型基因表達,即二者均可激活血管內皮細胞上表達的M受體。氨甲酰膽堿和毛果蕓香堿雖然均可激活血管內皮細胞上表達的M受體,但激活后信號轉導途徑可能不同,造成對血管張力影響的不同。Akam等利用免疫共沉淀技術研究發(fā)現毛果蕓香堿不能激活Gq蛋白