原代神經(jīng)元培養(yǎng)

........ .神經(jīng)細(xì)胞原代培育從動物〔大鼠或小鼠等的胚胎或生動物的腦組織取下某一局部區(qū)域，分別細(xì)胞，培育在培育容器后不再移植，常稱為原代神經(jīng)細(xì)胞培育。一、培育前預(yù)備器械和器皿器械：外科剪、鑷子、虹膜剪等、小剪刀、細(xì)鑷子和虹膜小刀等60℃烘干，以防生銹。由于濕熱消毒對手術(shù)器械簡潔可用70－80％1器皿：玻璃瓶及相應(yīng)的膠塞或膠木螺旋蓋，用于分裝血清、多聚賴氨酸、解剖液、各種鹽溶液和培育液等。培育瓶、蓋玻片0.2N1021010210烘干待消毒。凡組織學(xué)用過的舊蓋玻片一般不用。移液管、吸管、燒杯、離心管和培育皿。塑料培育皿35m、塑料培育板、2、96孔關(guān)心工具：放置試管、吸管和玻璃瓶等的架子。培育基和培育用液的配制培育基質(zhì)：有多聚賴氨酸、牛皮膠原和鼠尾膠原。本室目前常用分子量為7-140000多聚賴氨酸〔Poly-L-lysine0.1mg/ml。平衡鹽溶液：主要以無機(jī)鹽和葡萄糖配制而成。各種平衡鹽溶液主要的不同點(diǎn)在于NaCl培育液：目前已有現(xiàn)成的干粉出售，按說明書進(jìn)展配制即可。神經(jīng)細(xì)胞培育需高糖，6g/L。目前培育海馬神經(jīng)元可選用B274℃〔分裝前需56℃30。補(bǔ)水至2.5%濃度，振蕩搖勻，4℃過夜，待完全溶解后用濾器過濾滅菌，并分裝成1-2ml凍D-Hanks0.25%或0.12537℃20-30解剖溶液：由平衡鹽水〔D1-無鈣鎂離子的Puck氏液、HEPES緩沖液和蔗糖－葡萄糖溶液組成稱為D1-SGH。D1NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HPO4.7H2O0.045g、KH2PO40.03g、酚紅0.0012g、50ml。蔗糖－葡萄糖SG：蔗糖7.5、葡萄糖3、三蒸水50m。HEPE〔H0.352m：用25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl調(diào)7.3-7.428ml。D1SG和H1000ml5ml4℃?zhèn)溆?。二、培育?xì)胞操作涂培育基一般在細(xì)胞培育前1-2天，將使用的塑料培育皿35m2496片涂上一層Poly-L-Llisine，置于超凈臺中備用。試驗(yàn)動物預(yù)備胞培育，以184811-1316-21進(jìn)入培育室操作穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。污物盤。解剖動物以生大鼠取海馬組織為例：將生大鼠投入80％的酒精中，消毒5-10分鐘。用解剖剪斷頭，并移入玻璃器皿中，沿中間骨縫將頭骨剪開〔頭骨外側(cè)下沿也剪開，然織。用彎頭鑷子輕輕夾起，放入解剖液〔培育皿可置于冰袋上。待數(shù)個(gè)動物均解剖后，將培育皿的海馬組織移至解剖鏡下，認(rèn)真去除血管、膜及非海馬構(gòu)造〔取材干凈格外重要〕后，再移至小培育皿中，加數(shù)滴D1-SGH0.251ml37℃培育箱消化25-302ml2ml10〔全培育液成80％DMEM、10％胎牛血清、10％馬血清或小牛血清，胎牛血清有助于細(xì)胞貼壁。用口徑較小的、在火焰上光滑過的玻璃吸管吸取細(xì)胞團(tuán)，移入另一離心管，參加2ml培育液并吹打205-10分鐘后，吸取上層細(xì)胞溶液約1ml。離心管中再參加培育液1ml，同上吹打并吸取細(xì)胞，與第1次吸取的細(xì)胞混合一起后計(jì)數(shù)。按所需的細(xì)胞濃度接種在事先預(yù)備的塑料培育皿375％CO2112三、細(xì)胞識別立體感強(qiáng)，常見“暈培育細(xì)胞中可包括幾種神經(jīng)元的類型和非神經(jīng)元的“背景細(xì)胞胞和幾種膠質(zhì)細(xì)胞。成纖維細(xì)胞貼壁最快，呈扁平狀，胞核卵園形，有并列的兩粒小核仁毯”上生長遷移和分化。培育的神經(jīng)細(xì)胞可按一般Nissl法染色或免疫細(xì)胞化學(xué)特異性染色加以鑒別。無菌操作留意事項(xiàng)設(shè)備完善的試驗(yàn)室。假設(shè)試驗(yàn)者馬虎大意，技術(shù)操作不規(guī)?也會導(dǎo)致污染。因而．為在一切操作中為最大可能的保證無菌．每一項(xiàng)工作都必需做到有條不紊和完全靠?！九嘤邦A(yù)備】在開頭試驗(yàn)前要制定好試驗(yàn)打算和操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算要事先做好。然后開頭消毒。這可以避開開頭試驗(yàn)后．囚物品不全來回拿取而增加污染時(shí)機(jī)。【操作野消毒】無菌培育室每天都要用0.2%的潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)．紫外線照耀消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次試驗(yàn)前要用75％酒精擦洗。然后紫外線淌毒30min。在工作臺面消毒時(shí)切勿將培育細(xì)胞和培育用液同時(shí)照耀紫外線，消毒時(shí)工作臺面上用品不要過多或重疊放置75%酒精擦洗后置于臺同時(shí)紫外線消毒。紫外線照耀30min清潔工作服，并于開頭操作前要用75％酒精消毒手。假照試驗(yàn)過程中手觸及可能污染的物帽?！净鹧嫦尽吭跓o菌環(huán)境進(jìn)展培育或做其它無菌工作時(shí)，首先要點(diǎn)燃酒精燈或煤氣燈。以生有毒氣體，危害培育細(xì)胞?！静僮鳌窟M(jìn)展培育時(shí)，動作要準(zhǔn)確靈敏，但又不必太快，以防空氣流淌，增加污染時(shí)機(jī)。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。為拿取便利臺面上的用品要有合理的布局，原則上應(yīng)是右手使用的東西放置在右側(cè)，左手用品在左側(cè)，露在空氣中。同樣，培育液在未用前，不要過早開瓶；用過之后如不再重復(fù)使用，應(yīng)馬上封閉瓶口直立可增加落菌時(shí)機(jī)。吸取養(yǎng)分液、PBS、細(xì)胞懸液及其它各種用液時(shí)，均應(yīng)分別使將吸管丟掉。細(xì)胞計(jì)數(shù)清、藥物等物質(zhì)生物學(xué)作用的重要手段。下面介紹常用的血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法。一、用品血球計(jì)數(shù)板，巴氏吸管0.25％胰蛋白酶溶液，無血清培育液顯微鏡二、步驟預(yù)備計(jì)數(shù)板：用酒精清潔計(jì)數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。制備細(xì)胞懸液；用消化液分散單層培育細(xì)胞或直接收集懸浮培育細(xì)胞，制成單個(gè)細(xì)胞懸液。本法要求細(xì)胞密度不低于 10000個(gè)細(xì)胞／m1，假設(shè)細(xì)胞數(shù)很少，應(yīng)將懸液離心(1000rpm，2min)，重懸浮于少量培育液中。加樣：用吸管輕吹打細(xì)胞懸液，取少許細(xì)胞懸液，在計(jì)數(shù)板上蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液，加樣量不要溢出蓋玻片，也不要過少或帶氣泡。10X只計(jì)左測和上方者，不計(jì)右側(cè)和下方者。計(jì)算：將計(jì)算結(jié)果代入下式，得出計(jì)數(shù)結(jié)果：細(xì)胞數(shù)／毫升原液＝(44)X104細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為細(xì)胞密度。細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即為細(xì)胞密度。三、留意事項(xiàng)(1)(2)取樣計(jì)數(shù)前．應(yīng)