神經(jīng)軸突再生抑制因子nogo基因的研究進(jìn)展

神經(jīng)軸突再生抑制因子nogo基因的研究進(jìn)展

成年后，中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生能力顯著降低，外耳神經(jīng)仍有一定的再生能力，這表明人們認(rèn)識到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的再生能力。除了形成骨腫瘤是轉(zhuǎn)化的物理障礙外，由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏神經(jīng)生長因子，因此存在神經(jīng)生長抑制因素?？茖W(xué)家們還找到了證據(jù)來證明這一假設(shè)。目前人們發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)軸突再生抑制因子包括可溶性髓磷脂相關(guān)糖蛋白(myelinassociatedglycoprotein,MAG)、少突細(xì)胞髓磷脂糖蛋白(oligodendrocytemyelinglycoprotein,OMgp)和Nogo蛋白。Nogo有3種同源異構(gòu)體:Nogo-A、Nogo-B、Nogo-C,它們均通過Nogo受體(neuronalglycosylphosphatidylinositol-anchoredreceptors,NgR)發(fā)揮軸突生長抑制作用。1氨基酸的檢測2000年,瑞士、美國和英國的3個(gè)科研小組同時(shí)發(fā)現(xiàn)一種能抑制中樞神經(jīng)損傷后再生的基因,將其命名為Nogo基因,它所編碼的蛋白質(zhì)命名為Nogo蛋白,是網(wǎng)狀蛋白家族的成員。Nogo基因序列上的不同啟動(dòng)子和不同拼接使之可形成3個(gè)mRNA的轉(zhuǎn)錄體,它們所編碼的蛋白質(zhì)分別稱為Nogo-A、Nogo-B和Nogo-C,長度分別為1163、360、199個(gè)氨基酸。Nogo-A中間的173-975個(gè)氨基酸為特異性氨基酸序列,Nogo-B沒有特異性氨基酸序列,Nogo-C氨基端的1-11個(gè)氨基酸為特異性氨基酸序列。Nogo-A和Nogo-B在氨基端有相同的172個(gè)氨基酸序列;這3種蛋白質(zhì)在近羧基端都有相同的188個(gè)氨基酸序列,且都有2個(gè)長度分別為35和36個(gè)氨基酸的疏水跨膜區(qū)。Nogo分子的氨基端和羧基端都位于細(xì)胞漿,3種Nogo分子的羧基端2個(gè)跨膜區(qū)之間均存在一個(gè)66個(gè)氨基酸的結(jié)構(gòu)域Nogo-66,它位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔或細(xì)胞膜外,是Nogo分子的功能區(qū),可抑制中樞神經(jīng)細(xì)胞軸突生長并能誘導(dǎo)細(xì)胞生長錐塌陷。目前已知Nogo-A是突觸再生抑制物,Nogo-B是血管重塑調(diào)節(jié)物,Nogo-C在骨骼肌高表達(dá),在肝臟、腎臟低表達(dá),通過JNK-c-Jun-依賴的通路由細(xì)胞凋亡蛋白3和p53誘導(dǎo),與細(xì)胞凋亡相關(guān)。2arg118不同的機(jī)制MAG是最早被鑒定的中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突生長髓鞘抑制因子,是免疫球蛋白超家族唾液酸結(jié)合亞組成員,其相對分子質(zhì)量約為100kD,約含600個(gè)氨基酸,包括1個(gè)較長的胞外區(qū),1個(gè)跨膜區(qū)和2個(gè)胞內(nèi)區(qū),胞外結(jié)構(gòu)域含有5個(gè)Ig樣結(jié)構(gòu)域,氨基序列中的Arg118影響MAG與軸突結(jié)合,當(dāng)Arg突變?yōu)锳la、Asp時(shí)與軸突結(jié)合的作用消失。MAG不但存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng),外周神經(jīng)系統(tǒng)中也有MAG的存在,MAG在新生動(dòng)物有促進(jìn)神經(jīng)纖維生長的作用,但在成年動(dòng)物則為抑制作用。它既是維持有髓軸突受體的配體,又是促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞分化、維持和存活的軸突信號的受體,主要表達(dá)在少突膠質(zhì)細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)有2個(gè)功能:維持髓鞘的完整性和抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生。MAG與其他糖蛋白結(jié)合,是周圍神經(jīng)髓鞘上自主免疫的靶抗原,已證明在多發(fā)性硬化患者中與突觸的病理損傷有關(guān)。盡管均通過NgR起作用,但MAG與Nogo-66作用明顯不同,MAG可能是結(jié)合在與Nogo-66不同的NgR的結(jié)合部位。MAG有幾個(gè)神經(jīng)結(jié)合配體,其中幾個(gè)可與NgR復(fù)合物或其下游信號相互作用。3糖基磷脂酰肌醇OMgp是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)內(nèi)多肽合成的特異性糖蛋白,大約只占髓磷脂蛋白的0.05%,位于髓鞘及少突膠質(zhì)細(xì)胞的外表面。它是少突膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定蛋白,含有433個(gè)氨基酸殘基,有4個(gè)結(jié)構(gòu)域,N末端有一個(gè)富含半胱氨酸的短基序,富含亮氨酸的區(qū)段(LRR)可能在與NgR結(jié)合中起作用,與O-糖基位點(diǎn)結(jié)合的富含絲/蘇氨酸的區(qū)段以及疏水的C-末端,其LRR區(qū)高度保守,可能與其功能作用有關(guān)。在發(fā)育期,它的出現(xiàn)比其他髓磷脂蛋白出現(xiàn)晚,其生理功能可能是在髓鞘形成的過程中與終止信號的發(fā)出有關(guān)。OMgp可能是引起某些自身免疫性疾病(如多發(fā)性硬化)的靶抗原。4跨膜分子與nrNgR含473個(gè)氨基酸殘基,氨基端有1個(gè)信號肽,其后為8個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)區(qū),羧基端含豐富的半胱氨酸,與GPI相連。但作為一個(gè)糖基醇磷脂結(jié)合蛋白,它缺乏細(xì)胞內(nèi)片段,所以其信號向胞內(nèi)傳導(dǎo)必定要借助其它跨膜分子。有人認(rèn)為,NgR借GPI錨定于胞膜脂質(zhì)層,所以它和配基結(jié)合后可能改變與脂質(zhì)層有關(guān)的胞膜內(nèi)分子的信號。但目前被多數(shù)人認(rèn)同的觀點(diǎn)是,存在某種跨膜分子與NgR共同作用,將NgR接受到的來自髓磷脂的抑制信號傳遞到軸突胞質(zhì)。實(shí)驗(yàn)表明,中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂中另外2種軸突生長抑制性蛋白——MAG與OMgp,均通過NgR及與其相連的受體復(fù)合物發(fā)揮作用。Nogo-66與MAG結(jié)合于NgR的不同位點(diǎn),而Nogo-66與OMgp在NgR上的結(jié)合位點(diǎn)有重疊,故二者存在競爭。因此NgR似乎是中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓磷脂中各種軸突生長抑制性蛋白發(fā)揮作用的集中點(diǎn)。人類的NgR與小鼠的NgR有89%的同源性,其基因的外顯子位于22q11染色體上。NgR在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中分布廣泛,灰質(zhì)中含量較高,大腦皮質(zhì)、海馬、腦橋、小腦蒲肯野細(xì)胞也有分布,但不存在于少突膠質(zhì)細(xì)胞,外周組織中只有心臟和腎臟有極少量的分布。5神經(jīng)元營養(yǎng)因子目前普遍認(rèn)為,NgR通過P75(neurotrophinreceptor,NTR),激活小鳥嘌呤核苷三磷酸酶(smallGTPases)的Rho家族成員——rho、rac1、cdc42,內(nèi)源性第二信使在其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用。用神經(jīng)營養(yǎng)因子提高神經(jīng)元內(nèi)cAMP水平,激活PKA,使Rho磷酸化而失活,可以阻斷髓磷脂對軸突生長的抑制作用。細(xì)胞內(nèi)游離鈣也與生長錐延伸和收縮過程密切相關(guān)。Nogo-A導(dǎo)致生長錐潰變之前,細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度明顯升高。Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合后,激活蛋白激酶,也可以導(dǎo)致Rho磷酸化而失活,促進(jìn)生長錐延伸。因此可以認(rèn)為,中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元損傷后,溶解的少突膠質(zhì)細(xì)胞釋放Nogo-A氨基端和Nogo-66的可溶性蛋白水解片段,與其特異性受體復(fù)合物結(jié)合,通過第二信使作用于Rho,對生長錐中的微絲進(jìn)行調(diào)節(jié),使生長錐潰變,抑制軸突再生。除上述機(jī)制外,Nogo-A還對軸突生長相關(guān)基因有下調(diào)作用。5.1髓磷脂協(xié)同受體它是一種跨細(xì)胞膜的神經(jīng)營養(yǎng)素受體,其胞質(zhì)部分與Rho作用,而Rho已被證明能介導(dǎo)髓磷脂對軸突生長的抑制作用,所以P75被認(rèn)為是NgR的協(xié)同受體。截除P75的跨膜和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域,與堿性磷酸酶融合形成融合蛋白P75-AP,發(fā)現(xiàn)其仍然可以和全長的NgR結(jié)合,說明P75是通過其細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域和NgR相互作用。5.2基于權(quán)值的其他膜組體以往認(rèn)為NgR的受體復(fù)合物由NgR和P75組成,關(guān)于其組成近年還有不少新發(fā)現(xiàn)。有研究者發(fā)現(xiàn)GTI-b(一種神經(jīng)節(jié)苷脂)的抗體可中和MAG的抑制活性,認(rèn)為它可能是NgR受體復(fù)合物中的一員。2004年,Lee等報(bào)道另一種NgR的協(xié)同受體LINGO-1,也是富亮氨酸重復(fù)序列(leucine-richrepeat,LRR)包含Ig受體之一。他們發(fā)現(xiàn),NgR-p75復(fù)合體只有與LINGO-1共同表達(dá)才能傳導(dǎo)OMgp的抑制信號,激活胞內(nèi)的RhoA;在原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)中,如沒有LINGO-1,將明顯削弱髓鞘成分的抑制作用。因此LINGO-1被認(rèn)為是NgR-P75受體復(fù)合物的一個(gè)功能組。GPI-結(jié)合于Nogo-66受體(NgR)通過跨膜受體LINGO-1和P75或TROY將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)。5.3e-g-ro在NgR-P75復(fù)合體的下游即神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi),存在一種GTP結(jié)合蛋白RhoA。正常狀況下,Rho-GDI(Rho鳥嘌呤裂解抑制子)與Rho-GDP結(jié)合,并隱藏在細(xì)胞質(zhì)中處于靜止?fàn)顟B(tài)。髓磷脂相關(guān)抑制因子能促進(jìn)P75與Rho-GDI的結(jié)合,使Rho-GDP釋放,在鳥苷酸交換因子(GMPexchangefactor,GEF)的作用下,形成Rho-GTP而激活。Madura等通過體外實(shí)驗(yàn)證明,在Nogo蛋白的作用下,Rho明顯激活,脊髓損傷的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)在損傷區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞突起有大量的Rho激活。近年有實(shí)驗(yàn)將C3酶用于視神經(jīng)和脊髓的損傷部位,抑制Rho-A,發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜的軸突和皮質(zhì)脊髓束的纖維明顯增生。胞質(zhì)內(nèi)還存在Rho相關(guān)激酶(Rho-associatedproteinkinases,ROCK)。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ROCK的抑制因子Y-27623能逆轉(zhuǎn)髓磷脂引起的軸突再生抑制,體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明它能促進(jìn)軸突的再生和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)。這些都提示ROCK是Rho-A的效應(yīng)器。Nogo及Rho、ROCK通路對細(xì)胞遷移、觸突導(dǎo)向、樹突棘多態(tài)性、突觸再生和細(xì)胞存活有重要作用。5.4troy在體內(nèi)的功能軸突生長抑制信號主要通過Rho-A途徑實(shí)現(xiàn),此外還存在其它信號途徑,如Enabled途徑和LIMK途徑。LIMK是由磷酸激酶(phosphorylatedp21-activatedkinase,PAK)或ROCK催化而磷酸化作為磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase,PI3K)的下游信號,它們共同作用,傳遞髓鞘的抑制信號,抑制神經(jīng)軸突的生長再生。此外還存在其它間接的、調(diào)節(jié)性的信號途徑。近年研究發(fā)現(xiàn),外周神經(jīng)損傷導(dǎo)致初級神經(jīng)元內(nèi)cAMP的水平升高,激活蛋白激酶A(PKA),使P75磷酸化,從而改變它在脂質(zhì)層中的定位;cAMP的水平升高,還可使Rho-A磷酸化而失活,并能上調(diào)精氨酸酶Ⅰ的水平,增加聚胺合成。這些都可以阻斷髓磷脂對軸突生長的抑制作用。此外,鈣離子也被證明是參與Nogo信號的細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)的組成之一。2004年美國科學(xué)家MiSha發(fā)現(xiàn)在體外非神經(jīng)元細(xì)胞COS27試驗(yàn)中NgR1與P75的結(jié)合并不能激活細(xì)胞內(nèi)RhoA信號通路,而只有NgR1、P75與LINGO-1三者的結(jié)合才能激活。LINGO-1是LRR家族的成員,它的N端含有12個(gè)LRR,有1個(gè)Ig區(qū)域、1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)傳導(dǎo)信號功能的細(xì)胞內(nèi)尾端。LINGO-1在成年哺乳動(dòng)物CNS中廣泛表達(dá),它在成年動(dòng)物腦組織中呈高表達(dá),而在正常脊髓中表達(dá)很低。但在損傷脊髓軸索中的表達(dá)可上升至正常脊髓的5倍。然而,在成年哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中只有除背根神經(jīng)節(jié)的部分神經(jīng)元和其它少數(shù)的神經(jīng)元表達(dá)P75外,其它神經(jīng)元并不表達(dá)。難道在中樞神經(jīng)系統(tǒng)還存在另外一種與P75同一家族且能代替P75的物質(zhì)嗎?2004年2個(gè)相互獨(dú)立的研究小組開始驗(yàn)證這一假設(shè)。他們對TNF家族在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中能夠廣泛表達(dá)的分子TROY(TAJ)、CD40、DR6、Fn14、TNFR1和TNFR2通過多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)只有TROY能夠與NgR1和LINGO-1形成復(fù)合物L(fēng)INGO-1/NgR/TROY,而且TROY的作用幾乎是P75的8倍。在實(shí)驗(yàn)中2個(gè)小組發(fā)現(xiàn)TROY能夠在體外存在Nogo-A、MAG和OMgp的培養(yǎng)基中調(diào)節(jié)背根神經(jīng)節(jié)和小腦顆粒神經(jīng)元軸突的生長,通過提高病毒載體介導(dǎo)的TROY的表達(dá)加強(qiáng)抑制因子介導(dǎo)的軸突生長抑制作用,然而當(dāng)除去TROY頂端域的表達(dá)時(shí)這一作用明顯減弱,軸突生長不再受到抑制。這些結(jié)果表明,TROY能夠傳遞抑制相關(guān)因子信號,并證明TROY從功能上代替LINGO-1/NgR/P75復(fù)合物中的P75。TROY的發(fā)現(xiàn)能更好地解釋為什么敲除P75基因的小鼠在脊髓損傷后,神經(jīng)再生不明顯的現(xiàn)象,為今后研究中樞神經(jīng)損傷后再生與修復(fù)提供了一條新的思路。6ogmp基因缺失抑制軸突生長的信號機(jī)制目前的研究已經(jīng)證實(shí)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的Nogo是髓磷脂中最重要的一種抑制軸突生長錐再生的蛋白質(zhì),Nogo-A具有中樞神經(jīng)抑制活性,Nogo-66僅能特異性地抑制神經(jīng)纖維的生長,而Nogo的氨基片段則作用更為廣泛,除可阻斷神經(jīng)纖維生長,還可抑制非神經(jīng)細(xì)胞的伸展和遷移。MAG能與膠質(zhì)細(xì)胞相互作用,能促進(jìn)損傷區(qū)域少突膠質(zhì)細(xì)胞的存活,還可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化的啟動(dòng)。此外,MAG通過所謂的受控的膜內(nèi)蛋白水解作用(RIP),先后經(jīng)α和γ-分泌酶2次對P75進(jìn)行剪切,使之釋放出25kD的胞內(nèi)區(qū)(ICD),ICD是蛋白激酶PKC和小GTP酶Rho激活所必需的,由此啟動(dòng)下游信號途徑來抑制軸突生長。OMgp不僅對成年軸突生長具有抑制作用,且可以促進(jìn)新生神經(jīng)元軸突生長,其富含亮氨酸重復(fù)片段結(jié)構(gòu)域參與蛋白間的相互作用,發(fā)揮DNA修復(fù)、RNA剪接、細(xì)胞間黏附及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等功能。研究還發(fā)現(xiàn)神經(jīng)營養(yǎng)因子需要的細(xì)胞內(nèi)信號由結(jié)合于細(xì)胞表面的Trk和P75受體的配體觸發(fā)。來自Trk受體的信號支持存活、生長和突觸延伸,而來自P75的信號誘導(dǎo)凋亡、