srepomycesmicroflavus5發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

srepomycesmicroflavus5發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1材料和方法1.1病毒streptic微藻組2005已從河北省中國(guó)科學(xué)院微生物研究所分離并保存。1.2培養(yǎng)基的制備1:蛋白胨0.5%,葡萄糖1%,氯化鈉0.5%,pH7.2～7.4。121℃滅菌30min。2:蔗糖1.5%,可溶性淀粉5%,豆餅粉1.7%,K2HPO4·3H2O0.4%,酵母膏0.3%,(NH4)2SO40.2%,CaCO30.2%,NaCl0.2%,pH7.2～7.4。豆餅粉沸水煮1h后,用8層紗布過(guò)濾,蒸餾水洗濾渣2次,棄去濾渣,合并濾液用于培養(yǎng)基配制。121℃滅菌30min。3:玉米粉2.0%,可溶性淀粉2.0%,蔗糖2.0%,豆餅粉1.5%,酵母粉0.1%,(NH4)2SO40.25%,MgSO40.0025%,K2HPO40.02%,NaCl0.5%,CaCO30.5%,pH7.2～7.4。豆餅粉需沸水煮1h后,用8層紗布過(guò)濾,蒸餾水洗濾渣2次,棄去濾渣,合并濾液用于培養(yǎng)基配制。121℃滅菌30min。4:可溶性淀粉4.5%,蔗糖2.5%,豆餅粉3.0%,NaNO30.8%,ZnSO40.01%,KH2PO40.001%,pH7.0。豆餅粉需沸水煮1h后,用8層紗布過(guò)濾,蒸餾水洗濾渣2次,棄去濾渣,合并濾液用于培養(yǎng)基配制。121℃滅菌30min。5:可溶性淀粉2%,KNO30.1%,K2HPO40.05%,MgSO40.05%,FeSO40.001%,NaCl0.05%,pH7.2～7.4。121℃滅菌30min。1.3液體種子培養(yǎng)將用高氏1號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)好的斜面菌種接種一環(huán)到裝有100mL高氏1號(hào)液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中,28℃振蕩培養(yǎng)24h,轉(zhuǎn)速210r/min。種子培養(yǎng)完畢后,將液體種子按7%接種量接種發(fā)酵培養(yǎng)基(1000mL三角瓶裝培養(yǎng)基200mL),28℃振蕩培養(yǎng)120h,轉(zhuǎn)速210r/min進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。8000r/min離心10min收集菌體,蒸餾水洗滌3次,105℃烘干至恒重,稱量菌體干重。1.4菌液用量及培養(yǎng)時(shí)間在大試管內(nèi)裝入等量蛭石,每管加入培養(yǎng)液40mL。每管加玉米“農(nóng)大108”種子2粒,按每公頃施用0、1500、3000、4500、6000mLStreptomycesmicroflavus005菌液計(jì)算每管用量,拌種,每個(gè)處理重復(fù)4次。定時(shí)補(bǔ)充培養(yǎng)液,每天輪換試管位置,相同條件下培養(yǎng)21d。觀察出苗率和出苗時(shí)間,測(cè)量株高、葉面積、地上部分干重和根重。1.5不同施肥方案試驗(yàn)在河北省微生物研究所院內(nèi)實(shí)驗(yàn)田進(jìn)行,土質(zhì)為砂壤土,肥力中上。采用隨機(jī)區(qū)組排列,4次重復(fù),每小區(qū)長(zhǎng)10m,寬2m,面積20m2。玉米品種為“農(nóng)大108”。試驗(yàn)設(shè)4個(gè)處理,處理1為對(duì)照,采用常規(guī)施肥,每公頃施尿素250kg;處理2為每公頃菌液1500mL+常規(guī)施肥;處理3為每公頃施菌液3000mL+常規(guī)施肥;處理4為每公頃施菌液6000mL+常規(guī)施肥。尿素基施,菌液稀釋后拌種。小區(qū)內(nèi)分4行,每行30穴,每穴播種2～3粒。3葉期進(jìn)行間苗,去除弱苗、病苗,缺株的要及時(shí)補(bǔ)苗,5葉期定苗,每穴留單株。拔節(jié)期和大喇叭口期分別追施尿素200kg/hm2。2結(jié)果與分析2.1培養(yǎng)基成分對(duì)菌體產(chǎn)量的影響分別用5種基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)Streptomycesmicroflavus005,發(fā)酵結(jié)束離心收集菌體并干燥稱重。不同培養(yǎng)基得到的生物量干重分別為:1號(hào)培養(yǎng)基1.40g/L;2號(hào)培養(yǎng)基15.12g/L;3號(hào)培養(yǎng)基8.71g/L;4號(hào)培養(yǎng)基17.67g/L;5號(hào)培養(yǎng)基1.66g/L。結(jié)果表明4號(hào)培養(yǎng)基菌體產(chǎn)量最高,2號(hào)培養(yǎng)基次之,1號(hào)培養(yǎng)基菌體量最低。比較幾種培養(yǎng)基組成證明C、N源較豐富的培養(yǎng)基能獲得更多的菌體量。所以以4號(hào)培養(yǎng)基為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)L9(34)正交試驗(yàn),考察不同含量的可溶性淀粉、蔗糖、豆餅粉和NaNO3對(duì)菌體產(chǎn)量的影響,每個(gè)處理設(shè)2次重復(fù),試驗(yàn)方案見表1。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行極差分析,試驗(yàn)結(jié)果和數(shù)理統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表2。由表2可見,極差R蔗糖>豆餅粉>可溶性淀粉>NaNO3。蔗糖含量對(duì)菌絲產(chǎn)量影響最大,過(guò)高的蔗糖含量并不利于菌體生長(zhǎng)。豆餅粉含量對(duì)菌絲產(chǎn)量也有較高影響,豆餅粉含量的增加有利于菌體生長(zhǎng)?？扇苄缘矸酆繉?duì)菌體產(chǎn)量的影響小于蔗糖和豆餅粉的影響,適當(dāng)?shù)牡矸酆孔钣欣诰w生長(zhǎng)。NaNO3含量對(duì)菌體產(chǎn)量影響較低,為了降低成本可以選擇一個(gè)較低的含量。適當(dāng)?shù)腃源和N源含量最有利于菌體生長(zhǎng),因此優(yōu)化后的培養(yǎng)基為:可溶性淀粉4.5%,蔗糖0.5%,豆餅粉4.5%,NaNO30.2%,ZnSO40.01%,KH2PO40.001%。2.2蘋果果粒的制備在1000mL三角瓶?jī)?nèi)分別裝入100、150、250、350mL培養(yǎng)基,接種量7%,28℃,210r/min振蕩培養(yǎng)120h,結(jié)果見圖1。試驗(yàn)結(jié)果證明當(dāng)裝液量為150mL/L時(shí),能夠得到最高的菌體產(chǎn)量,菌體產(chǎn)量達(dá)到48.3g/L。裝液量350mL/L時(shí)菌體產(chǎn)量最低,但干重也達(dá)到23.3g/L,比培養(yǎng)基優(yōu)化前的17.67g/L也有很大提高。當(dāng)裝液量為100mL/L時(shí),菌體雖然生長(zhǎng)迅速,但自溶時(shí)間提前,從而造成最終菌絲產(chǎn)量有所下降。證明Streptomycesmicroflavus005為好氧菌,適當(dāng)提高通氣量有利于菌體生長(zhǎng)。2.3菌劑對(duì)出苗的影響分別按每公頃施用1500、3000、4500、6000mL發(fā)酵液計(jì)算使用量,以不施菌劑做對(duì)照,培養(yǎng)21d,觀察出苗時(shí)間、出苗率、測(cè)量株高、地上部分干重、根重。對(duì)照和使用不同劑量菌液處理的出苗率均為100%,使用菌液的處理比對(duì)照出苗時(shí)間整體早1～2d。株高、地上部分干重、根重試驗(yàn)結(jié)果見表3。用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果表明,不同用量菌劑的處理與對(duì)照比平均株高增加了9.8%～12.6%,都達(dá)到極顯著差異水平。對(duì)葉面積也有促進(jìn)作用,比對(duì)照增加了6.2%～15.6%,但未達(dá)到顯著差異水平。地上部分干重有不同程度的增加,處理1和處理4與對(duì)照比達(dá)到極顯著差異水平。菌劑促進(jìn)了玉米苗期根系的發(fā)育,根重均有不同程度增加,但與對(duì)照比未達(dá)到顯著差異水平。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果看,菌劑對(duì)地上部分的促生效果要好于對(duì)根的促生效果。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)使用Streptomycesmicroflavus005菌液后能明顯促進(jìn)玉米苗期生長(zhǎng)。2.4不同用量對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響不同處理的小區(qū)玉米成熟收獲后分別測(cè)量禿尖、千粒重并計(jì)算單產(chǎn),結(jié)果見表4。用最小顯著差數(shù)法(LSD法)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。小區(qū)試驗(yàn)表明施用不同用量S.microflavus005菌液后均能促進(jìn)玉米生長(zhǎng)。禿尖長(zhǎng)度均比對(duì)照短,與對(duì)照比差異均達(dá)到極顯著水平。千粒重比對(duì)照均有所增加,其中3000mL/hm2處理與對(duì)照比達(dá)到顯著差異水平,6000mL/hm2處理達(dá)到極顯著差異水平。單產(chǎn)分別比對(duì)照增加6.9%,11.1%和15.3%,與對(duì)照比都達(dá)到極顯著差異水平,其中最高單產(chǎn)達(dá)8300kg/hm2。3發(fā)酵條件的確定通過(guò)正交試驗(yàn)初步確定了S.microflavus005的發(fā)酵培養(yǎng)基,結(jié)果表明C和N源對(duì)菌體生長(zhǎng)有較大影響。不同裝液量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌生長(zhǎng)所需通氣量較大,適當(dāng)加大通氣量能提高菌體產(chǎn)量。按優(yōu)化后的培養(yǎng)條件菌體產(chǎn)量接近初始條件菌體產(chǎn)量的3倍。玉米的水培和小區(qū)實(shí)驗(yàn)表明S.microflavus005發(fā)酵液對(duì)玉米有促生作用:苗期促進(jìn)種子發(fā)芽、根系發(fā)達(dá),植株粗壯;后期促進(jìn)干物質(zhì)積累,千粒重增加,單產(chǎn)最高比對(duì)照增加15.3%。試驗(yàn)證明液體培養(yǎng)S.microflavus005與固體培養(yǎng)5406抗生菌肥具有相似的肥效,施用量更低。液體發(fā)酵與原來(lái)的土法固體培養(yǎng)相比勞動(dòng)強(qiáng)度更低,更易于控制菌劑質(zhì)量以便于工業(yè)化大生產(chǎn)。研究表明細(xì)黃鏈霉菌能夠分泌促生激素并促進(jìn)作物對(duì)氮磷的吸收利用,進(jìn)而提高產(chǎn)量,對(duì)于S.microflavus005菌株的深入促生機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。生物肥料是指以微生物生命活動(dòng)導(dǎo)致農(nóng)作物得到特定肥料效應(yīng)的制品,國(guó)際上對(duì)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的菌肥稱為生物肥料(Biofertilizer),我國(guó)稱之為微生物肥料(Microbialfertilizer)。目前,微生物肥料按其制品中特定的微生物種類可分為細(xì)菌肥料(如根瘤菌肥)、放線菌肥料(如5406)、真菌類肥料(如菌根真菌)等;以微生物肥料的作用機(jī)理可劃分為固氮菌類肥料、解磷菌類肥料、解鉀菌類肥料、外生菌根菌肥料等。我國(guó)自20世紀(jì)50年代開始使用放線菌5406,該菌株經(jīng)鑒定為細(xì)黃鏈霉菌乳糖變種。在小麥、蔬菜、煙草、人參等多種大田和經(jīng)濟(jì)作物上的使用結(jié)果表明能夠促進(jìn)作物生長(zhǎng),提高產(chǎn)量并具有一定抗病、驅(qū)蟲作用。研究表明放線菌5406能夠產(chǎn)生生長(zhǎng)刺激素和抗菌素,轉(zhuǎn)化土壤中的氮素和磷素物質(zhì)提高土壤肥力進(jìn)而有促進(jìn)作物生長(zhǎng)的作用。5406的生產(chǎn)傳統(tǒng)工