微生物菌肥對(duì)西藏青龍根際微生態(tài)的影響

微生物菌肥對(duì)西藏青龍根際微生態(tài)的影響

隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的中后期和過度施用化肥對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生的影響，如土壤結(jié)結(jié)、肥力降低、面源污染和ph值的影響，而微生物作為改善土壤營養(yǎng)狀況和提高植物抗逆性的越來越受到重視。微生物酶是一種或幾種由有益微生物組成的綠色生物肥。在土壤中處理后，細(xì)菌肥料的生物生長可以礦化土壤有機(jī)養(yǎng)分，釋放土壤封閉儲(chǔ)存的有機(jī)養(yǎng)分，改善土壤結(jié)構(gòu)，提高土壤肥力。因此，微生物肥料的使用可以改善植物的營養(yǎng)條件，幫助植物吸收養(yǎng)分，提高植物的抗逆性。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，微生物肥料的研究和應(yīng)用取得了很大進(jìn)展。然而，中國目前微生物肥料和生物添加劑的市場(chǎng)品種很多。由于氣候條件、地理環(huán)境和植物種類的不同，使用微生物肥料的效果也非常不同。近年來，中國建立了一些規(guī)范的微生物肥料市場(chǎng)規(guī)則，但缺乏使用微生物技術(shù)來科學(xué)評(píng)價(jià)、有效監(jiān)測(cè)微生物肥料的效果。西藏地處我國西南邊陲,素以“世界屋脊”和“地球第三極”著稱.藏東南地區(qū)由于受高寒低溫等極端環(huán)境脅迫的影響,土壤微生物活性下降.土壤養(yǎng)分礦化能力和速率也隨之降低,導(dǎo)致土壤較貧瘠.在海拔高度4200m以上的農(nóng)田中,青稞是唯一種植的作物,是藏族群眾的基本口糧來源,也是西藏地區(qū)最具特色的原料作物.因此用微生物菌肥改善當(dāng)?shù)赝寥婪柿l件,提高青稞的產(chǎn)量和質(zhì)量,是維持當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)社會(huì)健康發(fā)展的重要保障.目前有關(guān)外來微生物菌劑對(duì)根際微生態(tài)的研究主要集中在解磷解鉀菌、固氮菌及其他PGPR促生菌方面,且大多是采用傳統(tǒng)方法,如菌落計(jì)數(shù)法等,來研究對(duì)土壤和植物的施用效果.變性梯度凝膠電泳(Denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)技術(shù)可快速從土壤中提取微生物DNA片段,揭示所研究土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)特征,該技術(shù)在分析外源物質(zhì)對(duì)土壤細(xì)菌群落多樣性的影響和種群動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)方面得到廣泛使用.本研究以西藏地區(qū)廣泛存在的棕色沙壤土為研究對(duì)象,在施用微生物菌肥后采用PCR-DGGE技術(shù)檢測(cè)微生物菌肥對(duì)土壤微生態(tài)中細(xì)菌群落多樣性的影響,研究微生物菌肥對(duì)西藏土壤微生物的影響,以期探討微生物肥料的作用機(jī)理,并初步探究采用綜合分析指標(biāo)評(píng)價(jià)微生物肥料肥效的可行性.1材料和方法1.1雅魯藏布江上游地貌試驗(yàn)地為西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)研究所4號(hào)試驗(yàn)地,位于西藏自治區(qū)東南部拉薩市雅魯藏布江支流拉薩河中游,主要地貌為河谷平原,91°02′E,29°38′N,屬高原山地氣候,海拔3650m,年均溫7.4℃,年降雨量500mm,降雨集中于6,7,8,9月份,多夜雨.1.2供試菌劑與方法供試青稞品種為藏青320,由西藏自治區(qū)農(nóng)業(yè)研究所制種.供試土壤為河谷農(nóng)區(qū)棕色砂壤土,基礎(chǔ)理化性質(zhì):全氮0.98g/kg、全磷1.72g/kg、全鉀5.49g/kg、堿解氮113.05mg/kg、有效磷17.86mg/kg、速效鉀31.63mg/kg、有機(jī)質(zhì)13.58mg/kg、pH值7.72.供試菌劑為谷特菌肥,購買自禾康肥料有限公司,菌肥配置方法為砂糖100g,黃豆粉100g,谷特菌0.25g,1000mL水.1.3.4微生物量的測(cè)定青稞收獲后,在試驗(yàn)小區(qū)內(nèi)用土鉆“S”形隨機(jī)選擇5個(gè)點(diǎn),采樣深度為0~20cm,除去可見動(dòng)植物殘?bào)w及小石塊后混勻.用于測(cè)定土壤微生物量的土壤樣品保存在4℃冰箱中.用于PCR-DGGE分析的樣品迅速凍存于-20℃冰箱,以進(jìn)行分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn).1.4測(cè)量和方法1.4.1培養(yǎng)基及微生物量測(cè)定土壤中可培養(yǎng)真菌及放線菌的分離和數(shù)量測(cè)定采用稀釋平板法,培養(yǎng)基分別為葡萄糖酵母膏培養(yǎng)基及高氏1號(hào)培養(yǎng)基.微生物量氮測(cè)定采用氯仿熏蒸提取法.1.4.2pcr擴(kuò)增及電泳檢測(cè)1)稱取0.5g土樣,用OMEGA公司E.Z.N.ASoilDNAKitD5625-01提取DNA,得到的DNA用1%瓊脂糖電泳檢測(cè),并用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其濃度和純度.由于土壤中含有腐殖酸,影響DNA的擴(kuò)增,本研究采用稀釋20倍的土壤DNA進(jìn)行擴(kuò)增.2)將基因組DNA作為PCR的模板,采用細(xì)菌16SrRNA的V3區(qū)特異性引物對(duì)F338-GC和R518進(jìn)行PCR擴(kuò)增.它們的序列分別為338F-GC(5ue10b-GC-clamp-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3ue10b)和518R(5ue10b-ATTACCGCGGCTGCTGG-3ue10b).GC夾序列為:CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)(由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成),擴(kuò)增產(chǎn)物片段長約200bp.3)50μLPCR反應(yīng)體系組成如下:TakaRaTaq(5U/μL)0.25μL、10×PCRBuffer(Mg2+)5μL、MgCl2(25mmol/L)3μL、dNTPMixture(各2.5mmol/L)4μL、模板為20倍稀釋的總DNA(100μg/mL)2μL、引物1(20μL)1μL、引物2(20μL)1μL,無菌純水補(bǔ)齊到50μL.4)PCR反應(yīng)條件:采用普通PCR,即預(yù)變性95℃3min,32個(gè)PCR循環(huán)為94℃30s,53℃30s和72℃30s,最后在72℃下延伸10min.PCR反應(yīng)的產(chǎn)物用1.8%瓊脂糖電泳檢測(cè).1.4.3denaturenu.采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離.1)雙梯度變性膠的制備:使用梯度混合裝置,制備8%的聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度從35%(16.8gurea;16mLformamide/100mLDenaturant)到60%(25.2gurea;24mLformamide/100mLDenaturant),其中變性劑和丙烯酰胺的濃度從膠的上方向下方依次遞增.2)PCR樣品的加樣:待變性梯度膠完全凝固后,將膠板放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中,取PCR樣品30μL和6*loadingbuffer混合后加入上樣孔.3)電泳、染色及拍照在70V的電壓下,60℃電泳14h.電泳結(jié)束后,將凝膠進(jìn)行SYBRGreenI避光染色后拍照.1.4.4pcr擴(kuò)增及測(cè)序?qū)GGE凝膠上不同處理的優(yōu)勢(shì)條帶用無菌、潔凈的刀片切下,放入1.5mL滅菌的離心管中,加入50μL去離子水,于4℃浸泡過夜.次日,取1μL上清液為模板,以不加GC夾的引物,按照1.3.4中的PCR反應(yīng)體系和程序再次擴(kuò)增,擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳,利用Biospin膠回收試劑盒回收目的條帶.膠回收產(chǎn)物經(jīng)pMD20-T載體連接,轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞,在含氨芐青霉素、IPTG和X-gal的LB培養(yǎng)基上選擇白色克隆子,采用T載體通用引物進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),將菌液送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序.1.5土壤細(xì)菌多樣性分析1)土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)采用Excel2007進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理,應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析,5%水平下LSD多重比較各處理平均值之間的差異顯著性.2)用Bio-Rad公司的凝膠定量軟件QuantityOne4.6.2分析DGGE指紋圖譜中微生物群落結(jié)構(gòu),計(jì)算土壤中細(xì)菌的Shannon多樣性指數(shù)(H)、豐富度(S)和聚類分析,其中聚類分析用UPGMA方法.式中:H表示Shannon-Weiner多樣性指數(shù);ni是菌種i條帶的亮度;N是該泳道中所有條帶的總亮度.H值越大代表的物種多樣性越高.S表示物種種數(shù).采用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析,采用MEGA4.0中的NEIGHBOR-JOINING程序進(jìn)行細(xì)菌聚類分析并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.2結(jié)果與分析2.1施菌肥處理對(duì)土壤放線菌的影響土壤中可培養(yǎng)放線菌與真菌數(shù)量以及兩者之間的比例是反映土壤微生物區(qū)系的常用指標(biāo).從表2可以看出,分別施入不同量菌肥,除G7和Y3(即根施23.3mL/hm2和葉面噴施40.0mL/hm2,分別是兩種施肥方式的最高施肥量處理)外,與對(duì)照相比,施肥處理顯著降低了土壤中的真菌數(shù)量(p<0.05),顯著增加了土壤中的放線菌數(shù)量(p<0.05).例如,根施菌肥處理土壤放線菌數(shù)量較對(duì)照分別提高的幅度為115.43%~485.49%,其中根施23.3mL/hm2提高幅度最低,根施20.0mL/hm2處理最高;葉施菌肥處理土壤放線菌數(shù)量較對(duì)照增長率分別為899.23%,1630.06%和994.80%,以葉施26.7mL/hm2提高最多;谷特菌肥包括的有益微生物主要是放線菌.上述結(jié)果表明施用微生物菌肥可以在很大程度上改變土壤微生物區(qū)系.根施和葉面噴施放線菌增加最多的處理并不是施肥量最多的處理,而是僅次于最高施肥量的處理,這可能是由于在相同土壤條件下,過量菌肥微生物的施入導(dǎo)致營養(yǎng)不足,無法滿足施入微生物的繁殖需求.施用菌肥青稞根際土壤中A/F值較對(duì)照增加,最大值出現(xiàn)在根施菌肥量10.0mL/hm2和13.3mL/hm2處理,根施A/F值整體上大于葉面噴施.土壤微生物量是土壤有機(jī)庫中的活性部分,是土壤生態(tài)系統(tǒng)肥力的重要生物學(xué)指標(biāo).施肥處理土壤微生物量氮整體上較對(duì)照高,根施菌肥量16.7mL/hm2和葉施菌肥量26.7mL/hm2微生物量氮含量較對(duì)照分別提高114.59%和38.86%.同時(shí)表明根施對(duì)土壤微生物區(qū)系的影響高于葉面噴施.2.2土壤細(xì)菌的dgge譜分析2.2.1srdna的擴(kuò)增在進(jìn)行了土壤養(yǎng)分和微生物指標(biāo)分析后,本研究試圖從分子生物學(xué)角度深入地了解菌肥對(duì)土壤細(xì)菌生物多樣性的影響.以等量的基因組DNA為摸板,以細(xì)菌的16SrDNA的V3區(qū)通用引物(338F-GC/518R)對(duì)每一樣品的基因組DNA進(jìn)行體外擴(kuò)增,結(jié)果顯示所用樣品均擴(kuò)增出單一的目的條帶,得到的目的片段長度約200bp左右,是16SrDNAV3區(qū)的特異性片段,可以用于后續(xù)的環(huán)境樣本多樣性分析.2.2.2噴施方式對(duì)表層細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響土壤中細(xì)菌群落DGGE結(jié)果如圖1所示.不同菌肥施用方式以及不同施用濃度的土壤樣品的帶型和條帶數(shù)目有一定差別.各處理的條帶數(shù)目、部分特異條帶的寬度與著色深度比較,大致表現(xiàn)出根施高于葉面噴施的趨勢(shì),且根施對(duì)照Gck高于根施其他處理、葉面噴施對(duì)照Yck高于葉面噴施其他處理,說明菌肥的施用的確對(duì)根際微生態(tài)產(chǎn)生了影響,且根施和葉面噴施兩種方式對(duì)土壤表層細(xì)菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)的影響存在差異.條帶1,2,13和15存在于所有處理土壤中,且條帶亮度較高,表明該條帶所代表的微生物是土著種類和優(yōu)勢(shì)菌種,對(duì)環(huán)境有很好的適應(yīng)性.條帶3,6,8,10,11和14來自土著細(xì)菌,菌肥施用量3.3mL/hm2時(shí)它們的灰度已明顯降低,隨菌肥施用量的增加逐漸減弱或消失,表明菌肥中以放線菌為主的微生物影響了這些條帶所代表的土著細(xì)菌的存活.條帶4首次出現(xiàn)在對(duì)照Gck中,隨著菌肥施用量的增加條帶4消失,但菌肥施用量達(dá)到23.3mL/hm2時(shí)條帶4又再次出現(xiàn),表明該微生物為土著細(xì)菌,來自菌肥的放線菌大量滋生時(shí)抑制了該菌的存活,23.3mL/hm2施菌肥處理放線菌較對(duì)照增量最低,條帶4細(xì)菌得以滋生;條帶16存在于菌肥施用量3.3~13.3mL/hm2之間,表明該微生物來自菌肥;條帶5,7和9為葉面噴施處理獨(dú)有,在噴施濃度為26.7mL/hm2時(shí)出現(xiàn),該處理也是葉面噴施處理中放線菌增加最多處理,表明該濃度下菌肥微生物得到較充分的繁殖條件.2.2.3不同施肥方式對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響根施和葉面噴施不同濃度菌肥處理的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)多樣性指數(shù)(H)和條帶豐富度(S)如表3所示.在兩種施用方式中,H和S均表現(xiàn)為根施高于葉面噴施.根施處理中,對(duì)照Gck的DNA條帶數(shù)量最多,條帶亮度最高(如條帶6和條帶8),且Shannon多樣性指數(shù)最高.隨著菌肥濃度的增加至13.3mL/hm2,條帶信號(hào)強(qiáng)度、多樣性逐漸下降,如Gck多樣性指數(shù)比G2,G4的分別高3.0%和3.6%.但當(dāng)濃度升高至23.3mL/hm2(G7)時(shí),其條帶數(shù)量和多樣性增加,與對(duì)照Gck的相當(dāng).該結(jié)果與土壤放線菌和真菌數(shù)量結(jié)果相似,即來自菌肥的放線菌大量滋生抑制土壤細(xì)菌多樣性.葉面噴施處理中,處理與對(duì)照的條帶數(shù)量和多樣性處理間差異不大.為進(jìn)一步了解不同施肥方式和施肥濃度對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響,用UPGMA法進(jìn)行聚類分析,結(jié)果如圖2所示.兩種施用方式土壤細(xì)菌DGGE圖譜明顯地分為兩大族群,7個(gè)根施處理聚為一簇,組間相似度最低為0.82,并進(jìn)一步和對(duì)照Gck聚為一簇.其中特別是G2和G3處理,相似性系數(shù)高達(dá)0.91.葉面噴施的Y1,Y2和Y3聚為一簇,處理組與對(duì)照間差異較大.說明菌肥的施肥方式對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響大于菌肥施用量對(duì)其的影響.2.2.4srdna序列分析根據(jù)DGGE指紋圖譜將各處理中共16條特征條帶切膠回收,其中條帶16未成功克隆,因此共獲得15條序列,在其他研究中也有類似現(xiàn)象發(fā)生.如圖2所示,將15條帶的16SrDNA進(jìn)行序列測(cè)定,獲得的序列通過NCBI數(shù)據(jù)庫的BLAST程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的16SrDNA序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析.結(jié)果表明,15條所測(cè)序列的最相似序列有4條來自GenBank數(shù)據(jù)庫中未培養(yǎng)的微生物克隆,其余的來自可培養(yǎng)微生物(表4),所測(cè)序列與數(shù)據(jù)庫中的16SrDNA序列擁有較高的相似性(≥97%).用這些序列與本實(shí)驗(yàn)所得的序列構(gòu)建進(jìn)化樹,結(jié)果如圖4所示.系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示,15個(gè)克隆分屬5個(gè)門:變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、藍(lán)細(xì)菌門(Cyanobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)和酸桿菌門(Acidobacteria).其中變形細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌和厚壁菌是優(yōu)勢(shì)菌,且是土壤中普遍存在的菌群.部分放線菌來源于菌肥,如條帶5和條帶9.根施方式中,與對(duì)照相比,菌肥的施用對(duì)酸桿菌(Acidobacteria,條帶10)、放線菌(Actinobacteria,條帶12)和芽胞桿菌(Bacillus,條帶13)等土著菌的生長產(chǎn)生了促進(jìn)作用.菌肥對(duì)土著的芽單胞菌屬(Blastomonasstrain,條帶3)、不可培養(yǎng)的根瘤菌屬(UnculturedRhizobium,條帶4)和藍(lán)細(xì)菌(Cyanobacterium,條帶6)表現(xiàn)出抑制作用,其中條帶4在菌肥施用量為23.3mL/hm2時(shí)才再次出現(xiàn).根瘤菌屬菌株具有固氮作用,可以增加土壤含氮量.葉面噴施方式中,與對(duì)照相比,處理Y2引入了放線菌(Actinobacteria,條帶5和條帶9)以及變形菌(Proteobacteria,條帶7),噴施濃度為26.7mL/hm2有利于這3種菌的生長.3不同施肥方式對(duì)瀝青土壤微型的影響本文采用了傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法結(jié)合DGGE技術(shù),研究了菌肥對(duì)青稞種植土壤中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化.一些能夠分泌抗生素的土壤微生物能夠影響植物根際微生物群體的數(shù)量和組成.薛泉宏研究組運(yùn)用傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法研究用放線菌制劑處理人參、西瓜等,發(fā)現(xiàn)土壤中放線菌的數(shù)量和比例顯著增加,真菌的數(shù)量和比例減少.KhaledA.等研究發(fā)現(xiàn)非鏈霉素放線菌同樣可以抑制土壤中真菌的生長,促進(jìn)植物的生長.本研究中,施用菌肥后,土壤中放線菌數(shù)量顯著增加,增加幅度先快后慢;真菌數(shù)量顯著降低,且真菌降低速度先快后慢,反映了谷特菌肥中放線菌與土壤真菌的拮抗和競(jìng)爭(zhēng)營養(yǎng)的關(guān)系.PCR-DGGE技術(shù)是研究環(huán)境樣品非(難)培養(yǎng)微生物的有效方法.國內(nèi)外的研究表明,施加外源微生物菌劑可以改變植物根際土著微生物類群.本研究DGGE圖譜分析表明,施入適宜量菌肥施入后,菌肥微生物能夠利用土壤有機(jī)無機(jī)養(yǎng)分迅速繁殖,本研究谷特菌肥為放線菌劑,菌肥中的放線菌產(chǎn)生抗生素及其競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分的能力抑制了真菌和細(xì)菌的生長繁殖,因而降低了土壤細(xì)菌的多樣性.過量菌肥施入后,土壤有限的養(yǎng)分不再滿足菌肥微生物大量生長的需要,表現(xiàn)為青稞土壤細(xì)菌的多樣性緩慢升高,放線菌菌數(shù)量增加有限.所以本研究充分說明菌肥的施用量必須適宜,過多除造成不要的浪費(fèi),還影響其