第六章生物制藥下游技術(shù)

第六章生物制藥下游技術(shù)研究如何從混合物中把一種或幾種物質(zhì)分離出來的科學(xué)技術(shù)，是一門應(yīng)用性很強(qiáng)、科技含量較高的學(xué)科，涉及到物理、化學(xué)、生物學(xué)等方面的知識(shí)和操作技術(shù)。一、簡(jiǎn)介

二、發(fā)酵液的預(yù)處理

三、細(xì)胞破碎

四、提?。哼^濾、離心、沉析、萃取

五、分離純化：膜分離技術(shù)、層析、結(jié)晶、電泳

六、成品滅菌、干燥基本涵義生物分離技術(shù)是指從動(dòng)植物與微生物的有機(jī)體或器官、生物工程產(chǎn)物（發(fā)酵液、培養(yǎng)液）及其生物化學(xué)產(chǎn)品中提取、分離、純化有用物質(zhì)的技術(shù)過程。主要內(nèi)容包括離心分離、過濾分離、泡沫分離、萃取分離、沉淀（析）分離、膜分離、層析（色譜）分離、電泳分離技術(shù)以及產(chǎn)品的濃縮、結(jié)晶、干燥等技術(shù)。基本原理主要是依據(jù)離心力、分子大?。êY分）、濃度差、壓力差、電荷效應(yīng)、吸附作用、靜電作用、親和作用、疏水作用、溶解度、平衡分離等原理對(duì)原料或產(chǎn)物進(jìn)行分離、純化。不同的分離對(duì)象需要采用不同的分離方法才能有效地被分離。發(fā)展歷史生物分離技術(shù)至今已有幾百年的歷史。16世紀(jì)人們發(fā)明了用水蒸氣蒸餾從鮮花與香草中提取天然香料的方法；近代生物分離技術(shù)是在歐洲工業(yè)革命以后逐漸發(fā)展形成的；到20世紀(jì)40年代初，大規(guī)模深層發(fā)酵生產(chǎn)抗菌素；近年來發(fā)展的新生物技術(shù)包括利用基因工程菌生產(chǎn)人造胰島素，人與動(dòng)物疫苗等產(chǎn)品，某粗產(chǎn)物的含量極低，而對(duì)分離所得最終產(chǎn)物的要求卻更高了。生物分離的基本過程生物分離工藝流程：一般包括原料的選取、預(yù)處理、細(xì)胞破碎、固-液分離、初步純化（分離）、精制（高度純化）和成品加工等過程。發(fā)酵液（培養(yǎng)液）胞外產(chǎn)物預(yù)處理固-液分離細(xì)胞破碎胞內(nèi)產(chǎn)物固-液分離初步純化精制成品加工動(dòng)植物原料細(xì)胞破碎萃取與預(yù)處理沉淀分離靜態(tài)吸附靜態(tài)離子交換萃取分離膜分離吸附層析離子交換層析凝膠層析親和層析疏水層析高效液相色譜脫鹽、濃縮結(jié)晶、干燥圖1-1生物分離的一般工藝過程生物分離技術(shù)的特點(diǎn)1、需要對(duì)目標(biāo)產(chǎn)物的快速分離純化2、需要對(duì)原料液進(jìn)行高度濃縮3、需要借助新型的分離技術(shù)和材料4、需要除去有害人類健康的物質(zhì)5、采用利于保持目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)品質(zhì)量的操作條件6、產(chǎn)品要求高質(zhì)量、高純度因此，生物分離過程往往成本很高，在某些產(chǎn)品的生產(chǎn)過程中，分離成本可能占到總成本的80％以上。生物分離方法的選擇對(duì)于一個(gè)未知化學(xué)結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的組分的分離制備設(shè)計(jì)，大致可按以下六個(gè)基本步驟進(jìn)行：1、查找與待分離組分相關(guān)的基礎(chǔ)性研究資料，建立相應(yīng)的分析鑒定方法；2、開展制備物的理化性質(zhì)穩(wěn)定性的預(yù)備試驗(yàn)；3、開展材料處理及抽提方法的選擇試驗(yàn)；4、進(jìn)行分離純化方法、程序的摸索及其分離效果的評(píng)價(jià)；5、進(jìn)行產(chǎn)物均一性的測(cè)定；6、進(jìn)行中間試驗(yàn)和工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用的放大設(shè)計(jì)，確定最佳的分離方法。預(yù)處理的目的1.分離細(xì)胞、菌體和其它懸浮顆粒（細(xì)胞碎片、核酸和蛋白質(zhì)的沉淀物）。2.除去部分可溶性雜質(zhì)和改變?yōu)V液的性質(zhì)，以利于后繼各步操作。預(yù)處理的方法（一）發(fā)酵液過濾特性的改變（二）發(fā)酵液的相對(duì)純化發(fā)酵液過濾特性的改變微生物發(fā)酵液的特性為：發(fā)酵產(chǎn)物濃度較低，大多為1-10%，懸浮液中大部分是水；懸浮物顆粒小，相對(duì)密度與液相相差不大；固體粒子可壓縮性大；液相粘度大，大多為非牛頓型流體；性質(zhì)不穩(wěn)定，隨時(shí)間變化，如易受空氣氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影響。改善發(fā)酵液過濾特性的物理化學(xué)方法調(diào)酸（等電點(diǎn)）、熱處理、電解質(zhì)處理、添加凝聚劑、添加表面活性物質(zhì)、添加反應(yīng)劑、冷凍-解凍及添加助濾劑等。1.降低液體粘度根據(jù)流體力學(xué)原理，濾液通過濾餅的速率與液體的粘度成反比，降低液體粘度（加水稀釋法和加熱法等）可有效提高過濾速率。注意加熱溫度與時(shí)間，不影響產(chǎn)物活性和細(xì)胞的完整性。2.調(diào)節(jié)pHpH值直接影響發(fā)酵液中某些物質(zhì)的電離度和電荷性質(zhì)，適當(dāng)調(diào)節(jié)pH值可改善其過濾特性。3.凝聚與絮凝采用凝聚和絮凝技術(shù)能有效改變細(xì)胞、細(xì)胞碎片及溶解大分子物質(zhì)的分散狀態(tài)，使其聚結(jié)成較大的顆粒，便于提高過濾速率。另外，還能有效地除去雜蛋白和固體雜質(zhì)，提高濾液質(zhì)量。（1）凝聚指在電解質(zhì)作用下，由于膠粒之間雙電層電排斥作用降低，電位下降，而使膠體體系不穩(wěn)定的現(xiàn)象。發(fā)酵液中的細(xì)胞、菌體或蛋白質(zhì)等膠體粒子雙電層的結(jié)構(gòu)使膠粒之間不易聚集而保持穩(wěn)定的分散狀態(tài)。主要是無機(jī)類電解質(zhì)，大多為陽離子。常用的凝聚劑電解質(zhì)：硫酸鋁Al2(SO4)3?18H2O；氯化鋁AlCl3?6H2O;三氯化鐵FeCl3;硫酸亞鐵FeSO4·7H2O；石灰；ZnSO4；MgCO3（2）絮凝指在某些高分子絮凝劑存在下，基于橋架作用，使膠粒形成較大絮凝團(tuán)的過程。采用絮凝法可形成粗大的絮凝體，使發(fā)酵液較易分離。絮凝劑是一種能溶于水的高分子聚合物，其相對(duì)分子質(zhì)量可高達(dá)數(shù)萬至一千萬以上，長(zhǎng)鏈狀結(jié)構(gòu)，其鏈節(jié)上含有許多活性官能團(tuán)，包括帶電荷的陰離子（如-COOH）或陽離子（如-NH2）基團(tuán)以及不帶電荷的非離子型基團(tuán)。它們通過靜電引力、范德華引力或氫鍵的作用，強(qiáng)烈地吸附在膠粒的表面。當(dāng)一個(gè)高分子聚合物的許多鏈節(jié)分別吸附在不同的膠粒表面上，產(chǎn)生橋架聯(lián)結(jié)時(shí)，就形成了較大的絮團(tuán)，這就是絮凝作用。工業(yè)上使用的絮凝劑可分為三類：1）有機(jī)高分子聚合物，如聚丙烯酰胺類衍生物、聚苯乙烯類衍生物；2）無機(jī)高分子聚合物，如聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等；3）天然有機(jī)高分子絮凝劑，如聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等。醫(yī)藥和食品工業(yè)：聚丙烯酸類陰離子絮凝劑聚苯乙烯類衍生物無機(jī)高分子聚合物絮凝劑（聚合鋁鹽、聚合鐵鹽等）天然有機(jī)高分子絮凝劑（多聚糖類膠粘物、海藻酸鈉、明膠、骨膠、殼多糖、脫乙酰殼多糖等）（3）混凝對(duì)于帶負(fù)電荷的菌體或蛋白質(zhì)來說，采用陽離子型高分子絮凝劑同時(shí)具有降低膠粒雙電層電位和產(chǎn)生吸附橋架的雙重機(jī)理；對(duì)于非離子型和陰離子型高分子絮凝劑，要采用凝聚和絮凝雙重機(jī)理才能提高過濾效果，這種包括凝聚和絮凝機(jī)理的過程，稱為混凝。4.助濾劑一種不可壓縮的多孔微粒，它能使濾餅疏松，濾速增大。懸浮液中大量的細(xì)微膠體粒子被吸附到助濾劑的表面上，改變了濾餅結(jié)構(gòu)，降低了過濾阻力。常用的助濾劑有：硅藻土、纖維素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。5.反應(yīng)劑加入反應(yīng)劑和某些可溶性鹽類發(fā)生反應(yīng)生成不溶性沉淀，如CaSO4，AlPO4等。生成的沉淀能防止菌絲體粘結(jié)，使菌絲具有塊狀結(jié)構(gòu)，沉淀本身可作為助濾劑，且能使膠狀物和懸浮物凝固，改善過濾性能。發(fā)酵液的相對(duì)純化發(fā)酵液中的雜質(zhì)：（1）高價(jià)無機(jī)離子（Ca2+、Mg2+、Fe2+）在采用離子交換提煉時(shí)，會(huì)影響樹脂對(duì)生化物質(zhì)的交換容量。（2）雜蛋白在采用離子交換和吸附法提取時(shí)會(huì)降低其交換容量和吸附能力，在有機(jī)溶劑法或雙水相萃取時(shí)，易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，使兩相分離不清。在常規(guī)過濾或膜過濾時(shí)，易使過濾介質(zhì)堵塞或受污染，影響過濾效率。高價(jià)無機(jī)離子的去除方法Ca2+——草酸、草酸鈉，→形成草酸鈣沉淀；Mg2+——三聚磷酸鈉，→形成三聚磷酸鈉鎂可溶性絡(luò)合物；Fe2+——黃血鹽，→普魯士蘭沉淀雜蛋白的去除方法等電點(diǎn)沉淀法化合沉淀法變性法吸附法等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)一般以膠體狀態(tài)存在于發(fā)酵液中。在酸性溶液中帶正電荷；在堿性溶液中帶負(fù)電荷。在某一pH下，凈電荷為零，溶解度最小，稱為等電點(diǎn)。化合沉淀法酸堿調(diào)節(jié)，使蛋白質(zhì)與鹽或離子形成沉淀。在酸性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陰離子，如三氯乙酸鹽、水楊酸鹽、鎢酸鹽、苦味酸鹽、鞣酸鹽、過氯酸鹽等形成沉淀；在堿性溶液中，蛋白質(zhì)與一些陽離子，如Ag+、Cu2+、Zn2+、Fe3+和Pb2+等形成沉淀。變性法熱變性：適于熱穩(wěn)定物質(zhì)大幅度調(diào)節(jié)pH：根據(jù)產(chǎn)物特性反向調(diào)節(jié)加酒精、丙酮等有機(jī)溶劑或表面活性劑等缺點(diǎn)：加熱法只適合于對(duì)熱較穩(wěn)定的目的產(chǎn)物；極端pH值也會(huì)導(dǎo)致某些目的產(chǎn)物失活，且要消耗大量酸堿；有機(jī)溶劑法通常只適用于所處理的液體數(shù)量較少的場(chǎng)合。吸附法1、吸附法定義和原理2、吸附法工藝在制藥中的應(yīng)用3、影響吸附的因素4、常用的吸附劑1、吸附法定義和原理吸附是指物質(zhì)在兩相界面上的濃度改變。最常見的吸附是發(fā)固體物質(zhì)作為吸附劑，從溶液中進(jìn)行的吸附過程。吸附劑對(duì)于某一物質(zhì)的吸附，總是同時(shí)存在著吸附---解吸這樣二個(gè)相反的過程，當(dāng)這二者達(dá)到平衡時(shí)，吸附劑的明附能力也就達(dá)到最大值。當(dāng)吸附劑達(dá)到吸附最大值之后，再選用適當(dāng)?shù)娜軇┻M(jìn)行洗脫，就能使得吸附---解吸平衡向解吸過程移動(dòng)，這就是洗脫。2、吸附法工藝在制藥中的應(yīng)用主要有二種應(yīng)用情況：

（1）吸附雜質(zhì)、通過吸附來除去雜質(zhì)。

（2）吸附有效成份、進(jìn)行有效成份的提純和分離。

吸附的使用方法有二種類型：

（1）靜態(tài)吸附法

（2）動(dòng)態(tài)吸附法（1）靜態(tài)吸附法在溶液中加入適量的吸附劑，通過攪拌和振蕩使其達(dá)到吸附平衡。

優(yōu)點(diǎn)----設(shè)備簡(jiǎn)單、操作方法容易掌握。

缺點(diǎn)----吸附分離的效率不高，能夠吸附80%左右就已經(jīng)十分理想。（2）動(dòng)態(tài)吸附法就是將吸附劑裝入柱中進(jìn)行流動(dòng)吸附，也就是說“柱層析”。在裝有吸附劑的柱中，加入需要分離的溶液組分，等到溶液全部流入層析柱之后，再用洗脫劑進(jìn)行洗脫。柱內(nèi)不斷地進(jìn)行著吸附—洗脫的相互作用，吸附力較弱的溶質(zhì)由于容易被洗脫，因此移動(dòng)速度就較快，最先流出層析柱。3、影響吸附的因素（1）吸附劑的特性（2）被吸附物質(zhì)的性質(zhì)（3）吸附時(shí)的外部條件（1）吸附劑的特性制備方法不同，吸附劑的特性也不同。如活性炭：

（1）在500℃時(shí)活化，結(jié)果對(duì)酸易吸附、而對(duì)堿不吸附。

（2）在800℃時(shí)活化，結(jié)果對(duì)堿易吸附、而對(duì)酸不吸附。吸附劑表面積越大，吸附量就越多。增加表面積的方法有：

（1）將吸附劑磨成濁的顆粒。

（2）通過處理使得吸附劑表面粗糙不平。

（3）使吸附劑成為凝膠狀態(tài)。

（4）將吸附劑制作成為具有大量微孔的顆粒。這些過程通稱為吸附劑的活化。（2）被吸附物質(zhì)的性質(zhì)極性吸附劑易吸附極性物質(zhì)，如硅膠能夠吸附極性物質(zhì)。非極性吸附劑如活性炭則是非極性物持的吸附劑。一定的吸附劑對(duì)不同溶質(zhì)的吸附能力是不同的。如活性炭：

（1）吸附脂肪酸時(shí)，對(duì)長(zhǎng)鏈脂肪酸容易吸附，

（2）吸附多肽的能力大于吸附氨基酸，

（3）對(duì)多糖的吸附能力大于單糖。

在實(shí)際生產(chǎn)中，脫色、除熱原常用活性炭。去過敏物質(zhì)常用白陶土。（3）吸附時(shí)的外部條件[A]、溫度[B]、PH[C]、吸附物的濃度[D]、鹽的濃度溫度、PH[A]、溫度：（A1）吸附一般是放熱的，在達(dá)到平衡之后，升高溫度會(huì)使吸附量降低。（A2）生物活性物質(zhì)在進(jìn)行吸附操作時(shí)，還應(yīng)該考慮其對(duì)熱的穩(wěn)定性，對(duì)于酶一類對(duì)熱不穩(wěn)定的物質(zhì)來說，一般在0℃進(jìn)行吸附，而對(duì)于一些熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的物質(zhì)，可考慮在室溫進(jìn)行吸附操作。[B]、PH值：

在等電點(diǎn)附近的PH值，吸附量最大。[C]、吸附物的濃度（C1）吸附物濃度越大，吸附量也就越大，（C2）吸附劑在對(duì)吸附物進(jìn)行吸附時(shí)，同時(shí)也會(huì)對(duì)其它物質(zhì)產(chǎn)生吸附。因此，在使用活性炭脫色和除去熱原時(shí)，為避免對(duì)有效成份的吸附，往往將藥液進(jìn)行穩(wěn)當(dāng)稀釋。（C3）在使用吸附劑對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離時(shí)，常常要求其濃度在1%以下，以增強(qiáng)吸附劑對(duì)明附物的選擇性。[D]、鹽的濃度鹽類對(duì)于吸附作用的影響比較復(fù)雜，有時(shí)能夠促進(jìn)吸附，而有些情況則會(huì)阻止吸附的進(jìn)行，需要根據(jù)生產(chǎn)的實(shí)際情況來確定鹽濃度。4、常用的吸附劑（1）活性炭（2）白陶土（3）滑石粉（4）硅藻土（5）皂土（6）氫氧化鋁和氧化鋁（7）硅膠（8）人造沸石（1）活性炭活性炭的分類：（1）粉末活性炭----表面積大，吸附能力也大，但不容易與溶液分離。（2）顆?；钚蕴?---表面積小，吸附能力也較小，但容易與溶液分離，同時(shí)也適宜于裝柱。（3）錦綸活性炭，介于粉末活性炭和顆?；钚蕴恐g。活性炭的吸附特性：（1）活性炭的吸附作用在水溶液中最強(qiáng)、在有機(jī)溶劑中則較弱。（2）活性炭在酸性溶液中的吸附能力較大，當(dāng)PH達(dá)到6.8以上時(shí)，活性炭的吸附能力就會(huì)明顯下降。（3）活性炭是注射液生產(chǎn)中用來吸附雜質(zhì)的最常用的吸附劑。它能必善注射液的透明度。不論溶液中的色素雜質(zhì)為什么樣的物質(zhì)，均能夠用活性炭來進(jìn)行脫色。（4）活性炭的用量為液體量的0.02-1%。（2）白陶土白陶土的分類：（1）天然白陶土------其主要成份為含有水的硅酸鋁（Al2O3*2SiO2*2H2O），新采出的白陶土經(jīng)過干燥、壓碎、420℃活化、冷卻、粉碎、過篩就可作吸附劑。（2）酸性白陶土-----其原料是某些斑土，經(jīng)過鹽酸加熱處理之后，烘干即得，其脫色效果較好。白陶土的吸附特性：（1）由于白陶土能夠吸附氫離子，因此使用白陶土可以起到中和強(qiáng)酸的作用。（2）白陶土作為藥物具有吸附有毒物質(zhì)的作用，并能夠吸附細(xì)菌。（3）在制藥生產(chǎn)中，常常使用白陶土吸附一些分子量較大的雜質(zhì)，也常常用它來進(jìn)行脫色。（3）滑石粉滑石粉的成份是偏硅酸鎂[Mg3H2（SiO3）4]滑石粉具有不易起反應(yīng)的特點(diǎn)，常常用作助濾劑。利用滑石粉吸附能力較弱的特點(diǎn)，常常使用大量滑石粉來處理稀溶液，使得有效成份損失不明顯。（4）硅藻土、皂土硅藻土硅藻土的主要成份是二氧化硅，硅藻土具有大量吸附液體的能力，常常用作助濾劑和澄清劑。皂土皂土（Bentonite）其主要成份是鋁、鎂的硅酸鹽。皂土的帶電部分能夠結(jié)合金屬離子、多肽、和堿性蛋白質(zhì)。（5）氫氧化鋁、氧化鋁、硅膠、人造沸石氫氧化鋁和氧化鋁凝膠型氫氧化鋁（Al2O3*3H2O）在蛋白質(zhì)和酶的制備中常常使用。硅膠層析用硅膠一般以SiO2*XH2O來表示，硅膠的活性與水分含量有關(guān)。人造沸石沸石（Zeolite）是一種天然存在的含堿金屬和鋁的硅酸鹽，可以用作分子篩和離子交換劑。吸附法加入某些吸附劑或沉淀劑吸附雜蛋白質(zhì)而除去。在四環(huán)素類抗生素中，采用黃血鹽和硫酸鋅的協(xié)同作用生成亞鐵氰化鋅鉀的膠狀沉淀來吸附蛋白質(zhì)；在枯草桿菌發(fā)酵液中，加入氯化鈣和磷酸氫二鈉，兩者生成龐大的凝膠，把蛋白質(zhì)、菌體及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。細(xì)胞破碎就是采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物包括目的產(chǎn)物成分釋放出來的技術(shù)，是分離純化細(xì)胞內(nèi)合成的非分泌型生化物質(zhì)（產(chǎn)品）的基礎(chǔ)。定義為了研究細(xì)胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各種生物細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)。生物類型G+細(xì)菌G-細(xì)菌酵母菌霉菌植物細(xì)胞主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質(zhì)脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質(zhì)葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋白質(zhì)（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（幾丁質(zhì)）（80-90%）脂類蛋白質(zhì)初生壁次生壁細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)細(xì)菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細(xì)菌網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不及革蘭氏陽性細(xì)菌的堅(jiān)固；酵母葡聚糖的細(xì)纖維構(gòu)成了細(xì)胞壁的剛性骨架，甘露聚糖形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結(jié)構(gòu)交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；霉菌細(xì)胞壁中含有幾丁質(zhì)或纖維素的纖維狀結(jié)構(gòu)，其強(qiáng)度比細(xì)菌和酵母菌的細(xì)胞壁有所提高；植物細(xì)胞次生壁的形成提高了細(xì)胞壁的堅(jiān)硬性，使植物細(xì)胞具有很高的機(jī)械強(qiáng)度。物理方法1：研磨法----細(xì)胞在玻璃球、或者鋼球之間被碾碎。2：搗碎法----在韋林氏搗碎機(jī)中，細(xì)胞被徹底搗碎。3：高壓勻漿法----細(xì)胞被強(qiáng)近性地通過小孔而剪碎。4：超聲波破碎法----利用超聲波的空穴作用來破碎細(xì)胞。5：快速冰凍融化法----化學(xué)方法1：滲透沖擊法----在細(xì)胞液中加入2倍量的純水，由于滲透作用，細(xì)胞外的水分進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞膜脹破，而將內(nèi)含物釋放出來。2：干燥處理法----3：自溶法----4：酶處理法----多采用溶菌酶進(jìn)行處理。此外，還有鏈霉菌酶、白細(xì)胞酶C也可用于進(jìn)行酶處理。5：表面活性劑增溶溶解法----采用洗滌劑破壞細(xì)胞壁，使內(nèi)含物釋放出來。常用的洗滌劑有：（1）十二烷基苯磺酸鈉陰離子洗滌劑，（2）含有銨鹽、或者氯化十八烷基三甲基季銨鹽的陽離子洗滌劑，（3）脂肪醇聚氧乙烯醚的非離子型洗滌劑。6：噬菌體作用法----7：電離輻射法----常用破碎方法分類作用機(jī)理適應(yīng)性機(jī)械法珠磨法固體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可較大規(guī)模操作，大分子目的產(chǎn)物易失活，漿液分離困難高壓勻漿法液體剪切作用可達(dá)較高破碎率，可大規(guī)模操作，不適合絲狀菌和革蘭氏陽性菌超聲破碎法液體剪切作用對(duì)酵母菌效果較差，破碎過程升溫劇烈，不適合大規(guī)模操作X-press法固體剪切作用破碎率高，活性保留率高，對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物不適合非機(jī)械法酶溶法酶分解作用具有高度專一性，條件溫和，漿液易分離，溶酶價(jià)格高，通用性差化學(xué)滲透法改變細(xì)胞膜的滲透性具一定選擇性，漿液易分離，但釋放率較低，通用性差滲透壓法滲透壓劇烈改變破碎率較低，常與其他方法結(jié)合使用凍結(jié)融化法反復(fù)凍結(jié)-融化破碎率較低，不適合對(duì)冷凍敏感目的產(chǎn)物干燥法改變細(xì)胞膜滲透性條件變化劇烈，易引起大分子物質(zhì)失活機(jī)械法進(jìn)入珠磨機(jī)的細(xì)胞懸浮液與極細(xì)的玻璃小珠、石英砂、氧化鋁等研磨劑（直徑小于1mm）一起快速攪拌或研磨，研磨劑、珠子與細(xì)胞之間的互相剪切、碰撞，使細(xì)胞破碎，釋放出內(nèi)含物。在珠液分離器的協(xié)助下，珠子被滯留在破碎室內(nèi)，漿液流出從而實(shí)現(xiàn)連續(xù)操作。破碎中產(chǎn)生的熱量一般采用夾套冷卻的方式帶走。1.珠磨法（Beadmill）原理：實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的細(xì)胞破碎設(shè)備有Mickle高速組織搗碎機(jī)、Braun勻漿器；中試規(guī)模的細(xì)胞破碎可采用膠體磨處理；在工業(yè)規(guī)模中，可采用高速珠磨機(jī)（瑞士WAB公司和德國(guó)西門子機(jī)械公司制造）。珠磨法的破碎率一般控制在80%以下。珠磨法適用于細(xì)胞懸浮液和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理。膠體磨德國(guó)進(jìn)口珠磨機(jī)2.高壓勻漿法（High-pressurehomogenization）利用高壓使細(xì)胞懸浮液通過針形閥，由于突然減壓和高速?zèng)_擊撞擊環(huán)使細(xì)胞破碎，細(xì)胞懸浮液自高壓室針形閥噴出時(shí)，每秒速度高達(dá)幾百米，高速噴出的漿液又射到靜止的撞擊環(huán)上，被迫改變方向從出口管流出。細(xì)胞在這一系列高速運(yùn)動(dòng)過程中經(jīng)歷了剪切、碰撞及由高壓到常壓的變化，從而造成細(xì)胞破碎。原理：——大規(guī)模細(xì)胞破碎的常用方法，在微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理中常采用高壓勻漿器的排出閥易造成堵塞的團(tuán)狀或絲狀真菌較小的革蘭氏陽性菌含有包含體的基因工程菌不宜采用高壓勻漿法的細(xì)胞類型。影響勻漿破碎的主要因素：壓力、溫度、通過勻漿器閥的次數(shù)大、中、小型高壓勻漿器利用發(fā)射15-25kHz的超聲波探頭處理細(xì)胞懸浮液。一般認(rèn)為超聲波破碎的機(jī)理是：在超聲波作用下液體發(fā)生空化作用，空穴的形成、增大和閉合產(chǎn)生極大的沖擊波和剪切力，使細(xì)胞破碎。3.超聲破碎法（Ultrasonication）影響超聲波的細(xì)胞破碎效率因素：頻率、液體溫度和粘度、處理時(shí)間等。超聲波破碎法是很強(qiáng)烈的破碎方法，適用于多數(shù)微生物的破碎。一般桿菌比球菌易破碎，G-細(xì)菌比G+細(xì)菌易破碎，對(duì)酵母菌的效果較差。該法在實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模細(xì)胞破碎中常用。非機(jī)械法1.酶溶法（EnzymaticLysis）（1）外加酶法常用的溶酶溶菌酶β-1，3-葡聚糖酶β-1，6-葡聚糖酶蛋白酶甘露糖酶糖苷酶肽鍵內(nèi)切酶殼多糖酶等利用溶解細(xì)胞壁的酶處理菌體細(xì)胞，使細(xì)胞壁受到部分或完全破壞后，再利用滲透壓沖擊等方法破壞細(xì)胞膜，進(jìn)一步增大胞內(nèi)產(chǎn)物的通透性。利用溶酶系統(tǒng)處理細(xì)胞時(shí)必須根據(jù)細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)和化學(xué)組成選擇適當(dāng)?shù)拿福⒋_定相應(yīng)的次序。酶溶法的優(yōu)點(diǎn)：選擇性釋放產(chǎn)物，條件溫和，核酸泄出量少，細(xì)胞外形完整。酶溶法的缺點(diǎn)：溶酶價(jià)格高，溶酶法通用性差，產(chǎn)物抑制的存在。酶解法的影響因素（1）酶的專一性----根據(jù)酶專一性的作用方式，來選擇具體的酶。（2）溫度----應(yīng)選擇酶的最適溫度范圍下進(jìn)行反應(yīng)。

溫度對(duì)酶的作用與時(shí)間有關(guān)，既使是在最適溫度范圍內(nèi)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶的活性也會(huì)下降。（3）PH值----每一種酶都有一個(gè)最適的PH值范圍。

最適的PH值范圍還與溫度有關(guān)，溫度越高，最適的PH值范圍越窄。（4）其它物質(zhì)的影響

酶的激活劑----K、Na、Mg、Ca、Cl、SO4、NO3。

酶的抑制劑----Pb、Hg、Ag、Cu、S、CN。（5）酶的用量----用量過少，則酶解作用太慢。用量過多，則會(huì)增加生產(chǎn)成本。誘發(fā)微生物產(chǎn)生過剩的溶胞酶或激發(fā)自身溶胞酶的活力，以達(dá)到細(xì)胞自溶的目的。影響自溶過程的主要因素有溫度、時(shí)間、pH值、激活劑和細(xì)胞代謝途徑等。缺點(diǎn)：對(duì)不穩(wěn)定的微生物，易引起所需蛋白質(zhì)的變性，自溶后細(xì)胞懸浮液粘度增大，過濾速度下降。（2）自溶法（Autolysis）某些化學(xué)試劑，如有機(jī)溶劑、變性劑、表面活性劑、抗生素、金屬螯合劑等，可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性（滲透性），從而使胞內(nèi)物質(zhì)有選擇地滲透出來。2.化學(xué)滲透法（Chemicalpermeation）TritonX-100牛黃膽酸鈉十二烷基磺酸鈉（1）表面活性劑表面活性劑可促使細(xì)胞某些組分溶解，其增溶作用有助于細(xì)胞的破碎。主要是處理G-細(xì)菌，對(duì)細(xì)胞外層膜有破壞作用。EDTA將Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子將脫落，使細(xì)胞壁外層膜出現(xiàn)洞穴。這些區(qū)域由內(nèi)層膜的磷脂來填補(bǔ)，從而導(dǎo)致內(nèi)層膜通透性的增強(qiáng)。（2）EDTA螯合劑能分解細(xì)胞壁中的類脂，使胞壁膜溶脹，細(xì)胞破裂，胞內(nèi)物質(zhì)被釋放出來。乙醇、異丙醇、甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高級(jí)醇等。（3）有機(jī)溶劑與水中氫鍵作用，削弱溶質(zhì)分子間的疏水作用，從而使疏水性化合物溶于水溶液。鹽酸胍和脲是常用的變性劑。通用性差；時(shí)間長(zhǎng)，效率低；有些化學(xué)試劑有毒?；瘜W(xué)滲透法優(yōu)點(diǎn)：缺點(diǎn)：對(duì)產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質(zhì)如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質(zhì)仍滯留在胞內(nèi)；細(xì)胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進(jìn)一步提取。將濃縮的菌體懸浮液冷卻至-25℃形成冰晶體，利用500MPa以上的高壓沖擊，使冷凍細(xì)胞從高壓閥小孔中擠出。細(xì)胞破碎是由于冰晶體的磨損，使包埋在冰中的微生物變形而引起的。此法主要用于實(shí)驗(yàn)室，適應(yīng)范圍廣、破碎率高、細(xì)胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等優(yōu)點(diǎn)，但不適應(yīng)于對(duì)冷凍敏感的生化物質(zhì)。其他方法1.X-press法將細(xì)胞放在高滲透壓的介質(zhì)中（如一定濃度的甘油或蔗糖溶液），達(dá)平衡后，轉(zhuǎn)入到滲透壓低的緩沖液或純水中，由于滲透壓的突然變化，水迅速進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞溶脹，甚至破裂。僅適用于細(xì)胞壁較脆弱的細(xì)胞或細(xì)胞壁預(yù)先用酶處理或在培養(yǎng)過程中加入某些抑制劑（如抗生素等），使細(xì)胞壁有缺陷，強(qiáng)度減弱。

2.滲透壓法（Osmoticpressure）將細(xì)胞放在低溫下突然冷凍而在室溫下緩慢融化，反復(fù)多次而達(dá)到破壁作用。一方面使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂，另一方面胞內(nèi)水結(jié)晶，使細(xì)胞內(nèi)外溶液濃度變化，引起細(xì)胞膨脹而破裂。適用于細(xì)胞壁較脆弱的菌體，破碎率較低，需反復(fù)多次。

3.反復(fù)凍結(jié)-融化法此法使細(xì)胞結(jié)合水分喪失，從而改變細(xì)胞的滲透性。氣流干燥主要適用于酵母菌，一般在25-30℃的氣流中吹干；真空干燥多用于細(xì)菌。

4.干燥法氣流干燥真空干燥噴霧干燥冷凍干燥破碎率的測(cè)定與破碎技術(shù)的研究方向

1.破碎率的測(cè)定直接測(cè)定法（革蘭氏染色法）目的產(chǎn)物測(cè)定法導(dǎo)電率測(cè)定法二：細(xì)胞破碎技術(shù)（一）物理方法（二）化學(xué)方法（三）新型技術(shù)和方法

2.破碎技術(shù)的研究方向多種破碎方法相結(jié)合與上游過程相結(jié)合與下游工程相結(jié)合新型技術(shù)和方法1：激光破碎法2：冷凍噴射法3：高速相向流撞擊法定義：在一定的壓力差下，利用多孔性介質(zhì)截留固液懸浮液中的固體粒子，進(jìn)行固液分離的方法稱為過濾。過濾過濾介質(zhì)無定形顆粒：無煙煤、砂、顆粒活性炭、鐵礦砂等成形顆粒：燒結(jié)金屬、燒結(jié)塑料以及用合成樹脂粘結(jié)的硅砂、塑料顆粒等，做成圓筒形或板狀。非金屬織補(bǔ)棉：化學(xué)纖維、玻璃纖維織品、長(zhǎng)纖維濾布、短纖維濾布。金屬織布：不銹鋼絲或鐵絲等的織布。無紡品：紙、氈、石棉板、合成纖維無紡布等。過濾設(shè)備的分類根據(jù)推動(dòng)力的不同可分為四類重力過濾 自然過濾加壓過濾 板框過濾真空過濾 真空過濾器離心過濾 離心過濾器陶瓷過濾機(jī)XKZ全自動(dòng)壓濾機(jī)過濾設(shè)備板框過濾機(jī)板框壓濾機(jī)由壓濾機(jī)濾板、液壓系統(tǒng)、壓濾機(jī)框、濾板傳輸系統(tǒng)和電氣系統(tǒng)等五大部分組成。板框壓濾機(jī)工作運(yùn)行的原理：先由液壓施力壓緊板框組，料液由中間進(jìn)入，分布到各濾布之間，通過過濾介質(zhì)而實(shí)現(xiàn)固、液分離的脫液方法。廣泛應(yīng)用于培養(yǎng)基制備的過濾及霉菌、放線菌、酵母菌和細(xì)菌（需預(yù)處理）等多種發(fā)酵液的固液分離。適合于固體含量1-10%的懸浮液的分離。濾板與濾框的工作情況優(yōu)點(diǎn)：結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、裝配緊湊、過濾面積大、允許采用較大的操作壓力，輔助設(shè)備少，動(dòng)力消耗小，過濾和洗滌質(zhì)量好，對(duì)固形物含量要求低，材料選擇范圍廣。缺點(diǎn)：設(shè)備笨重、占地面積多、輔助時(shí)間長(zhǎng)、生產(chǎn)效率低。

板框過濾機(jī)真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)優(yōu)點(diǎn)：真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)具有自動(dòng)化程度高、操作連續(xù)、處理量大。特別適合固體含量大（>10％）的懸浮液的分離，在發(fā)酵工業(yè)中廣泛用于霉菌、放線菌和酵母發(fā)酵液或細(xì)胞懸浮液的過濾分離。缺點(diǎn)：由于受真空度的限制，不適于菌體較小和粘度較大的細(xì)菌發(fā)酵液的過濾，且過濾所得固相的干度不如加壓過濾。真空轉(zhuǎn)鼓過濾機(jī)離心定義：基于固體顆粒和周圍液體密度存在差異，在離心場(chǎng)中使不同密度的固體顆粒加速沉降的分離過程。離心分離方法1.差速離心—工業(yè)上最常用的離心分離方法定義：在密度均一的介質(zhì)中由低速到高速逐級(jí)離心，用于分離不同大小的細(xì)胞和細(xì)胞器。對(duì)象：混合樣品中各沉降系數(shù)差別較大的組分。速度逐漸提高，樣品按大小先后沉淀

原理：用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細(xì)胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場(chǎng)的作用使細(xì)胞分層、分離。分類：1）移動(dòng)區(qū)帶離心

2）等密度離心常用密度梯度物質(zhì)：蔗糖、甘油、CsCl、NaBr2.密度梯度離心—多用于生化研究1）移動(dòng)區(qū)帶離心用于分離密度相近而大小不等的細(xì)胞或細(xì)胞器。此法所采用的介質(zhì)密度較低，介質(zhì)的最大密度應(yīng)小于被分離生物顆粒的最小密度。2）等密度離心細(xì)胞或細(xì)胞器在連續(xù)梯度的介質(zhì)中經(jīng)足夠大離心力和夠長(zhǎng)時(shí)間則沉降或漂浮到與自身密度相等的介質(zhì)處，并停留在該層達(dá)到平衡，從而將不同密度的細(xì)胞或細(xì)胞器分離。A移動(dòng)區(qū)帶離心B等密度離心離心機(jī)分類制備性離心機(jī)分析性離心機(jī)：超速離心機(jī)普通離心機(jī)高速冷凍離心機(jī)超速離心機(jī)實(shí)驗(yàn)型離心機(jī)工業(yè)型離心機(jī)碟片式離心機(jī)是傳統(tǒng)離心機(jī)，為目前工業(yè)上應(yīng)用最廣泛的離心機(jī)。分離因數(shù)可達(dá)1000-20000，最大處理量達(dá)到300m3/h，常用于大規(guī)模的分離過程。適用范圍細(xì)菌、酵母菌、放線菌、細(xì)胞碎片管式離心機(jī)管式離心機(jī)是一種分離效率很高的離心分離設(shè)備，其轉(zhuǎn)鼓細(xì)長(zhǎng)，可在15000-50000的高轉(zhuǎn)速下工作，分離因數(shù)可達(dá)104-6×105。它設(shè)備簡(jiǎn)單、操作穩(wěn)定。適用范圍細(xì)胞、細(xì)胞碎片、細(xì)胞器、病毒、蛋白質(zhì)、核酸等。特別適合一般分離機(jī)難以分離的固形物含量<1%發(fā)酵液的分離。影響固液分離的因素微生物種類真菌的菌體大，固液分離容易，可采用真空轉(zhuǎn)鼓式過濾或板框過濾；細(xì)菌和細(xì)胞碎片小，固液分離較難，固液分離前要進(jìn)行預(yù)處理。發(fā)酵液黏度固液分離速度與黏度成反比。其它因素培養(yǎng)基組成、發(fā)酵周期、發(fā)酵液的pH值、溫度和加熱時(shí)間等概述非膜過濾（過濾）膜過濾過濾CompanyLogo膜科學(xué)的發(fā)展史膜工業(yè)的發(fā)展史膜分離技術(shù)的發(fā)展歷史CompanyLogo膜科學(xué)的發(fā)展史1748年AbbleNelkt發(fā)現(xiàn)水能自然地?cái)U(kuò)散到裝有酒精的豬膀胱內(nèi)，首次揭示了膜分離現(xiàn)象；1827年Dutrochet引入名詞滲透（Osmosis）；1861年

Schmidt提出超濾概念；1967年以后，膜及其組件的生產(chǎn)，膜分離技術(shù)的規(guī)模應(yīng)用。CompanyLogo分離過程年代目前主要廠商應(yīng)用微濾1925MilliporeCorp，Pallcorp.，AsahiChemical微電子、醫(yī)學(xué)、食品、化工等電滲析1960OonicsIns.，TokuyamaSoda，AsahiGlass苦咸水脫鹽、水分解、氯堿工業(yè)反滲透1965FilmTech./DOW，Hydronautics/Nitto，Torray，DduPont海水脫鹽、飲用水生產(chǎn)、食品工業(yè)、造紙工業(yè)等滲析1965Enka/AKZO，Gambro，AsahiChemical血液滲析、工業(yè)廢液等超濾1970AmiconCorp.，KochEng.Inc.，NittlDenko制藥工業(yè)、乳品工業(yè)等氣體分離1980Permea/AirProd.，UbeInd.，Hoechst/Celanese醫(yī)療、燃燒過程等滲透汽化1990GFTGmbH無水乙醇生產(chǎn)膜工業(yè)的發(fā)展史CompanyLogo膜的應(yīng)用膜海水淡化工業(yè)廢水處理城市廢水資源化天然氣生物質(zhì)利用能源水資源傳統(tǒng)工業(yè)生態(tài)環(huán)境除塵CO2控制制藥食品化工與石化電子冶金燃料電池潔凈燃燒CompanyLogo膜的定義指在一種流體相內(nèi)或是在兩種流體相之間有一層薄的凝聚相，它把流體相分隔為互不相通的兩部分，并能使這兩部分之間產(chǎn)生傳質(zhì)作用。CompanyLogo

膜的分類根據(jù)膜的材質(zhì)固體膜液體膜根據(jù)材料來源天然膜合成膜無機(jī)材料膜有機(jī)高分子膜根據(jù)膜的結(jié)構(gòu)多孔膜致密膜離子交換膜滲析膜微孔過濾膜超過濾膜反滲透膜滲透汽化膜氣體滲透膜根據(jù)膜的功能CompanyLogo

固體膜根據(jù)膜斷面的物理形態(tài)根據(jù)固體膜的形態(tài)對(duì)稱膜不對(duì)稱膜復(fù)合膜平板膜管式膜中空纖維膜核徑蝕刻膜CompanyLogo對(duì)稱膜、非對(duì)稱膜和復(fù)合膜斷面結(jié)構(gòu)示意圖CompanyLogo板框式膜組件卷式膜組件管式膜組件中空纖維膜組件膜分離組件CompanyLogoCompanyLogo膜材料種類高分子分離膜材料纖維素衍生物類聚砜類聚酰胺類聚酰亞胺類聚酯類聚烯烴類乙烯類聚合物含硅聚合物含氟聚合物甲殼素類無機(jī)膜致密膜多孔膜致密的金屬膜致密的固體電解質(zhì)膜致密的”液體充實(shí)固體化“動(dòng)態(tài)原位形成的致密膜Pd膜及Pd合金膜Ag膜及Ag合金膜氧化鋯膜復(fù)合固體氧化膜多孔負(fù)載膜多孔金屬膜，多孔不銹鋼膜多孔Ni膜，多孔Ag膜，多孔Pd膜，多孔Ti膜多孔陶瓷膜，包括Al2O3膜，SiO2膜，ZrO2膜，TiO2膜（多孔玻璃膜分子篩膜，包括碳分子篩）CompanyLogo表征膜性能的參數(shù)孔的性質(zhì)水通量截留分子量分布（MWCO）耐壓能力pH適用范圍對(duì)熱和溶劑的穩(wěn)定性CompanyLogo膜的技術(shù)要求對(duì)于不同種類的膜都有一個(gè)基本要求：耐壓：0.1～0.5Mpa耐高溫：高通量帶來的溫度升高和清洗的需要；耐酸堿：防止分離過程中，以及清洗過程中的水解；化學(xué)相容性：保持膜的穩(wěn)定性；生物相容性：防止生物大分子的變性；成本低。CompanyLogo膜分離技術(shù)利用膜的選擇性，以膜的兩側(cè)存在的能量差（壓力差、滲透壓差、電位差、化學(xué)勢(shì)差）作為推動(dòng)力，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M(jìn)行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。CompanyLogo常用膜分離技術(shù)的基本特性膜過程傳遞機(jī)理推動(dòng)力操作壓力透過物截留物截留分子量過濾粒徑膜類型微濾（MF）篩分機(jī)理（顆粒大小形狀）壓力差0.01～0.2MPa水、溶劑溶解物懸浮物顆粒0.025～10μm對(duì)稱性纖維多孔膜超濾（UF）篩分機(jī)理（分子特性大小形狀）壓力差0.1～0.5MPa水、溶劑小分子膠體生物大分子500-5000001～50nm非對(duì)稱性膜納濾（NF）溶液擴(kuò)散機(jī)理（離子大小及電荷）壓力差0.5～1MPa水、一價(jià)離子、多價(jià)離子有機(jī)物1000左右0.1～1nm復(fù)合膜反滲透（RO）溶液擴(kuò)散機(jī)理壓力差2～100MPa水、溶劑溶質(zhì)、鹽<5000.1～0.5nm非對(duì)稱性膜、復(fù)合膜CompanyLogo膜過程推動(dòng)力傳遞機(jī)理透過物截留物膜類型滲析（DF）濃度差篩分機(jī)理（溶質(zhì)的擴(kuò)散傳遞）低分子量物、離子溶劑非對(duì)稱性膜電滲析（ED）電位差顆粒的電荷（電解質(zhì)離子的選擇傳遞）電解質(zhì)離子非電解質(zhì)，大分子物質(zhì)離子交換膜氣體分離壓力差氣體和蒸汽的擴(kuò)散滲透氣體或蒸汽難滲透性氣體或蒸汽均相膜、復(fù)合膜，非對(duì)稱膜滲透蒸發(fā)壓力差選擇傳遞易滲溶質(zhì)或溶劑難滲透性溶質(zhì)或溶劑均相膜、復(fù)合膜，非對(duì)稱膜液膜分離濃度差反應(yīng)促進(jìn)和擴(kuò)散傳遞雜質(zhì)溶劑乳狀液膜、支撐液膜CompanyLogoumARELATIVESIZEOFCOMMONMATERIAL過濾對(duì)象MOLECULARWEIGHT分子量0.001100.011000.110001.01041010510010001061071002001,00020,000100,000500,000Aqueoussalts中水鹽份Metalions金屬離子Sugars蔗糖FILTRATIONTECHNO-LOGY過濾方法Pyrogens熱源Virus病毒Colloidalsilica膠體硅Albuminprotein白蛋白Bacteria細(xì)菌Carbonblack碳黑Paintpigment顏料色素Yeastcells酵母Milledflour面粉Beachsand海灘沙礫Pollens花粉RO反滲透Ultrafiltration超濾Microfiltration微濾Particle

filtration一般過濾THEFILTRATIONSPECTRUM過濾譜圖NF納濾CompanyLogo膜分離的原理示意圖CompanyLogo

ROmembraneNFmembraneUFmembraneMFmembrane原理動(dòng)漫CompanyLogo典型的膜分離技術(shù)透析法1、透析法的原理2、透析膜3、透析的分類CompanyLogo1、透析法的原理原理----透析法是利用小分子物質(zhì)在溶液中能夠透過薄膜，而蛋白質(zhì)和大分子物質(zhì)則不能透過薄膜的性質(zhì)，來進(jìn)行不同大小分子分離的一種方法。透析的具體方法----將高分子物質(zhì)裝于半透膜制成的口袋中，放置在水溶液或者其它透析液之中。

CompanyLogo2、透析膜透析膜是一種由纖維素制成的膜或玻璃紙，商品名賽路玢Cellophone。其孔徑可以通過物理、化學(xué)處理加以改變：（1）用氯化鋅處理可以增大孔徑，用60%氯化鋅溶液浸泡10分鐘，形成再生纖維紙膜，其孔徑可以增大。（2）在干燥箱中85℃加熱3小時(shí)，可以使得孔徑縮小。（3）用過的透析膜浸放在50%的甘油中，可以完好地保存。CompanyLogo3、透析的分類（1）濃度透析（2）電透析（3）離子交換膜電透析

CompanyLogo（1）濃度透析將透析管一段折疊，用橡皮筋結(jié)扎成袋，試一下是否漏水。

↓

倒入需要透析的溶液，放入2-3粒玻璃珠，以便在翻轉(zhuǎn)透析袋時(shí)，起到攪拌作用。

↓

將袋口的另一端扎緊，扎緊口袋之前應(yīng)該排出其中空氣，同時(shí)預(yù)留下空間，以防水溶液進(jìn)入透析袋之中，脹破透析袋。

↓

將透析袋放入透析液之中。CompanyLogo濃度透析注意事項(xiàng)（1）為了加速透析，可對(duì)透析液進(jìn)行攪拌。（2）適當(dāng)升溫也能夠加速透析。（3）在必要時(shí)，可以加入少量甲苯作為防腐劑，以防蛋白質(zhì)變質(zhì)。CompanyLogo（2）電透析溶液在外加電場(chǎng)的促進(jìn)下所進(jìn)行的透析稱為電透析。電透析能夠增加透析的速度。電透析所需設(shè)備：

（1）陰性電極、陽性電極各一支，

（2）電壓可調(diào)式整流器，

（3）三室槽透析容器。CompanyLogo電透析的實(shí)驗(yàn)裝置在三室槽透析容器的中間一室盛裝待透析的溶液，其兩端為透析薄膜。三室槽透析容器頭尾兩室盛裝蒸餾水+電極棒，陽性電極為碳精棒、或者碳精片，陰性電極則用鉑、不銹鋼、鋅棒或者銅棒。電壓一般為100-300V、電流密度一般為10-30毫安/平方厘米。CompanyLogo電透析注意事項(xiàng)（1）開始透析時(shí)，由于鹽的濃度較高，要用低電壓，隨著鹽濃度的降低，應(yīng)逐漸升高電壓，直至將鹽完全透析出為止。（2）由于電流通過會(huì)產(chǎn)生出熱量，所以應(yīng)適當(dāng)加以冷卻。（3）應(yīng)該經(jīng)常性地注意電透析過程中的PH值變化。

CompanyLogo（3）離子交換膜電透析離子交換膜的特性是它對(duì)于溶液中的離子具有選擇性透過的機(jī)能。它只允許特定的一些離子透過膜。離子交換膜的實(shí)質(zhì)是由于離子交換膜的細(xì)微孔徑具有分子篩效應(yīng)。CompanyLogo離子交換膜分類（1）陽離子交換膜，這種膜帶有陽離子交換基團(tuán)，如磺酸基、羧基，也就是說構(gòu)成膜固定基團(tuán)的是陰離子，能夠進(jìn)行遷移的陽離子，它通過自身陽離子的遷出，可以交換待透析液中的其它陽離子。然后在電壓的作用下使溶液中的陽離子透析而出，向電場(chǎng)的陰極方向移動(dòng)。（2）陰離子交換膜，具有陰離子交換基團(tuán)，如季銨基等。CompanyLogo離子交換膜電透析的裝置（1）一張陽膜、

（2）一張陰膜、

（3）三室槽、

（4）電極、

（5）調(diào)壓整流器。要處理的陰離子通過陰離子交換膜向陽極移動(dòng)。而要處理的陽離子則通過陽離子交換膜向陰極移動(dòng)。CompanyLogo離子交換膜電透析的實(shí)際應(yīng)用離子交換膜電透析可以用來脫鹽和濃縮。在制藥工業(yè)中，此法可以用來制造去離子水。采用離子交換膜電透析法除去細(xì)胞色素C中的鹽，已經(jīng)用于生產(chǎn)實(shí)際。CompanyLogo微濾（Microfiltration，MF）微濾和微孔濾膜的特點(diǎn)：以靜壓差為推動(dòng)力，利用篩網(wǎng)狀過濾介質(zhì)膜的“篩分”作用進(jìn)行分離的膜過程。微孔濾膜為對(duì)稱性多孔薄膜，厚度：90～150μm左右，過濾粒徑：0.025～10μm，操作壓：0.01～0.2MPa。CompanyLogo微粒和細(xì)菌的過濾。微粒和細(xì)菌的檢測(cè)。藥物的除菌和除微粒。氣體、溶液和水的凈化。食糖與酒類的精制。微濾的應(yīng)用領(lǐng)域CompanyLogo超濾（ultrafiltration，UF）超濾法就是在一定的壓力下，使溶劑和較小分子的溶持能通過一定孔徑的濾膜，而大分子溶質(zhì)不能通過，從而完成大分子物質(zhì)的脫鹽、脫水、濃縮的過程。超濾和超濾膜的特點(diǎn)：過濾粒徑介于微濾和反滲透之間，約5～10nm，在0.1～0.5MPa的靜壓差推動(dòng)下截留各種可溶性大分子，如多糖、蛋白質(zhì)、酶等相對(duì)分子質(zhì)量分子量1000～500,000的大分子及膠體，形成濃縮液，達(dá)到溶液的凈化、分離及濃縮目的。CompanyLogo作為反滲透的預(yù)處理純水、飲用水的制備在醫(yī)藥和生化工業(yè)中用于處理熱敏性物質(zhì)，分離濃縮生物活性物質(zhì)，從生物中提取藥物等食品、造紙工業(yè)中的廢水處理果汁、酒等飲料的消毒與澄清汽車、家具等制品電泳涂裝淋洗水的處理超濾膜技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域CompanyLogo超濾膜裝置CompanyLogo超濾技術(shù)超濾過程由于沒有液相的變化，操作條件十分緩和，可以維持原來的離子強(qiáng)度和PH值。同時(shí)還能夠在低溫下操作，避免了蛋白質(zhì)和酶的變性、失活，也減少了制品長(zhǎng)菌的可能性。（1）超濾膜（2）超濾設(shè)備（3）實(shí)驗(yàn)室和工廠使用超濾設(shè)備的不同點(diǎn)（4）超濾的應(yīng)用CompanyLogo（1）超濾膜超濾膜一般由以下物質(zhì)制作而成： 醋酸纖維 硝酸纖維 聚砜 聚氯乙烯--丙烯腈共聚物 尼龍 其它無機(jī)材料A、超濾膜的孔徑規(guī)格B、常見的超濾范圍CompanyLogoA、超濾膜的孔徑規(guī)格（1）孔徑在0.6微米的濾膜，用于除去微粒，

（2）孔徑在0.22-0.45微米的濾膜，用于無菌過濾，

（3）孔徑在0.002-0.01微米的濾膜，用作超濾材料。我國(guó)生產(chǎn)的醋酸纖維，硝酸纖維超濾膜，其孔徑為0.15微米、0.2微米、0.3微米、0.45微米、0.65微米、0.80微米。CompanyLogoB、常見的超濾范圍肉眼可見的最小顆粒=40微米紅血球直徑=8微米最小的酵母細(xì)胞=2微米光學(xué)顯微鏡最小范圍=1微米最小細(xì)菌=0.22微米最小病毒=0.025微米電子顯微鏡范圍=0.01微米CompanyLogo（2）超濾設(shè)備超濾設(shè)備分為四種類型：

（A）靜態(tài)型

（B）攪拌震動(dòng)型

（C）錯(cuò)流湍動(dòng)型

（D）錯(cuò)流薄層層流型微孔過濾管過濾磚過濾板澄清型管式分離機(jī)CompanyLogo（3）實(shí)驗(yàn)室和工廠使用超濾設(shè)備的不同點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室最常用的是攪拌型，通過攪拌，使得累積在膜表面的大分子擴(kuò)散到溶液中去，從而加快超濾速度。工業(yè)上最常用的是錯(cuò)流薄層層流型，液體流在很薄的管道中（0.5毫米），與膜呈平行方向流動(dòng)，通過不斷在增加液體與膜的接觸來實(shí)現(xiàn)超濾。其流速可達(dá)3—30米/秒。其常見設(shè)備有：

（A）連續(xù)超濾器

（B）加壓超濾器

（C）套筒工業(yè)超濾器

（D）中空纖維型超濾器CompanyLogo（4）超濾的應(yīng)用A、濃縮和脫鹽B、分離和純化C、除菌過濾反滲透超濾生產(chǎn)純凈水裝置CompanyLogoA、濃縮和脫鹽（A1）超濾法濃縮酶是一種最為經(jīng)濟(jì)的方法，回收率可高達(dá)90%以上。超濾對(duì)于蛋白質(zhì)的濃縮也十分有效，如用德國(guó)的Sartorius超濾器，在8-10小時(shí)內(nèi)就可從30升蛋白質(zhì)溶液從1%濃縮到10%。（A2）超濾法脫鹽是在待超濾液中加入大量的蒸餾水，隨著超濾的不斷進(jìn)行，鹽、水分子、和其它小分子物質(zhì)不斷地被濾除，最終達(dá)到脫鹽目的。CompanyLogoB、分離和純化分子量不同的物質(zhì)可以通過不同孔徑的超濾器進(jìn)行串聯(lián)，最終形成小分子部份、中分子部份、高分子部份，從而達(dá)到分離目的。超濾膜1超濾膜2超濾膜30.8微米0.4微米0.15微米高分子部份中分子部份小分子部份濾液CompanyLogoC、除菌過濾超濾法是一種很好的冷滅菌法，對(duì)于那些不能進(jìn)行高壓消毒滅菌的生物制劑尤為合適，如細(xì)胞色素C、白蛋白、球蛋白等等，使用超濾法除菌效果良好。工效也要比除菌漏斗高出許多。實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用硝酸纖維超濾膜，其孔徑為0.2微米，進(jìn)行輔酶A、ATP的除菌過濾，濾壓為0.6千克/平方厘米、濾量為30升/小時(shí)、操作過程全密閉。即可實(shí)現(xiàn)無菌過濾。CompanyLogo反滲透技術(shù)（reverseosmosis，RO）反滲透技術(shù)所分離的物質(zhì)的分子量一般小于500，操作壓力為2～100MPa。反滲透膜大部分為不對(duì)稱膜，孔徑小于0.5nm，可截留溶質(zhì)分子。CompanyLogo滲透和反滲透的原理CompanyLogo反滲透、超濾和微孔過濾都是以壓力差為推動(dòng)力使溶劑通過膜的分離過程，它們組成了分離溶液中的離子、分子到固體微粒的三級(jí)膜分離過程。一般來說，分離溶液中分子量低于500的低分子物質(zhì)，應(yīng)該采用反滲透膜；分離溶液中分子量大于500的大分子或極細(xì)的膠體粒子可以選擇超濾膜，而分離溶液中的直徑0.1～10μm的粒子應(yīng)該選微孔膜。以上關(guān)于反滲透膜、超濾膜和微孔膜之間的分界并不是十分嚴(yán)格、明確的，它們之間可能存在一定的相互重疊。反滲透與超濾、微孔過濾的比較CompanyLogo反滲透膜最早應(yīng)用于海水、苦咸水的淡化制取生活用水，硬水軟化制備鍋爐用水，高純水的制備。在醫(yī)藥、食品工業(yè)中用以濃縮藥液、果汁、咖啡浸液等。印染、食品、造紙等工業(yè)中用于處理污水，回收利用廢業(yè)中有用的物質(zhì)等。反滲透膜技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域CompanyLogo反滲透裝置CompanyLogo納濾技術(shù)（nanofiltration,NF）納濾和納濾膜的特點(diǎn)納濾膜的孔徑為納米級(jí)，介于反滲透膜(RO)和超濾膜(UF)之間，因此稱為“納濾”。納濾膜的表層較RO膜的表層要疏松得多，但較UF膜的要致密得多。CompanyLogo納濾膜主要用于截留粒徑在0.1～1nm，分子量為1000左右的物質(zhì)，可以使一價(jià)鹽和小分子物質(zhì)透過，具有較小的操作壓（0.5～1MPa）。其被分離物質(zhì)的尺寸介于反滲透膜和超濾膜之間，但與上述兩種膜有所交叉。CompanyLogoMF蛋白質(zhì)細(xì)菌MW<3501000~300000.025~10um>1umROUFFNF正好介于UF和RO之間，截留分子量大概在300-1000。CompanyLogo納濾技術(shù)最早也是應(yīng)用于海水及苦咸水的淡化方面。在醫(yī)藥行業(yè)可用于氨基酸生產(chǎn)，抗生素和維生素的分離、純化、回收等方面；發(fā)酵母液中有效成分的回收。在食品行業(yè)中，納濾膜可用于果汁生產(chǎn)，大大節(jié)省能源。在石化生產(chǎn)的催化劑分離回收等方面更有著不可比擬的作用。納濾膜及其技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域CompanyLogo何謂沉析（Precipitation）？利用沉析劑使所需提取的生化物質(zhì)或雜質(zhì)在溶液中的溶解度降低而形成無定形固體沉淀的過程。沉析與結(jié)晶析出物為晶體時(shí)稱為結(jié)晶；析出物若為無定形固體則稱為沉析。特點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)、濃縮倍數(shù)高；但針對(duì)復(fù)雜體系而言，分離度不高、選擇性不強(qiáng)種類：鹽析、有機(jī)溶劑沉析、等電點(diǎn)沉析等一般沉析操作的過程Step1在經(jīng)過濾或離心后的樣品中加入沉析劑；Step2沉淀物的陳化，促進(jìn)晶體生長(zhǎng)；Step3離心或過濾，收集沉淀物；鹽析(Saltinducedprecipitation)在高濃度的中性鹽存在下，蛋白質(zhì)（酶）等生物大分子物質(zhì)去水化，在水溶液中的溶解度降低，產(chǎn)生沉淀的過程。概念生物大分子在水溶液中的存在狀態(tài)兩性電解質(zhì)，由于靜電力的作用，分子間相互排斥，形成穩(wěn)定的分散系；蛋白質(zhì)周圍形成水化膜，保護(hù)了蛋白質(zhì)粒子，避免了相互碰撞。鹽析過程當(dāng)中性鹽加入蛋白質(zhì)分散體系時(shí)可能出現(xiàn)以下兩種情況：（1）“鹽溶”現(xiàn)象—低鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度增大；（2）“鹽析”現(xiàn)象—高鹽濃度下，蛋白質(zhì)溶解度隨之下降。無機(jī)離子與蛋白質(zhì)表面電荷中和，形成離子對(duì)，部分中和了蛋白質(zhì)的電性，使蛋白質(zhì)分子之間的排斥力減弱，從而能夠相互靠攏；中性鹽的親水性大，使蛋白質(zhì)脫去水化膜，疏水區(qū)暴露，由于疏水區(qū)的相互作用導(dǎo)致沉淀。鹽析原理Cohn經(jīng)驗(yàn)公式S—蛋白質(zhì)溶解度，mol/L;I—離子強(qiáng)度β，Ks—常數(shù)β—鹽濃度為0時(shí)，蛋白質(zhì)溶解度的對(duì)數(shù)值。與蛋白質(zhì)種類、溫度、pH值有關(guān)，與鹽無關(guān)；Ks—鹽析常數(shù)，與蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽的種類有關(guān)，與溫度、pH值無關(guān)。β和Ks的物理意義Ks鹽析法：在一定pH和溫度下，改變體系離子強(qiáng)度進(jìn)行鹽析的方法；β鹽析法：在一定離子強(qiáng)度下，改變pH和溫度進(jìn)行鹽析； 其中，Ks鹽析法由于蛋白質(zhì)對(duì)離子強(qiáng)度的變化非常敏感，易產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，因此常用于提取液的前處理。而β鹽析法由于溶質(zhì)溶解度變化緩慢，且變化幅度小，因此分辨率更高，常用于初步的純化。鹽析用鹽的選擇在相同離子強(qiáng)度下，鹽的種類對(duì)蛋白質(zhì)溶解度的影響有一定差異，一般的規(guī)律為：半徑小的高價(jià)離子的鹽析作用較強(qiáng)，半徑大的低價(jià)離子作用較弱磷酸鉀>硫酸鈉>硫酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂選用鹽析用鹽的幾點(diǎn)考慮 鹽析效應(yīng)要強(qiáng)鹽析用鹽需有較大的溶解度，且受溫度影響盡可能小鹽析用鹽必須是惰性的，不影響生物分子的活性來源豐富、經(jīng)濟(jì)不引入雜質(zhì)、不給分離或測(cè)定帶來麻煩常用的鹽析用鹽硫酸銨：優(yōu)點(diǎn)：

（1）硫酸銨的鹽析能力較大，

（2）其飽和溶液的濃度較大，溶解度大（767g/L）

（3）其溶解度受溫度影響很小，

（4）不會(huì)引起蛋白質(zhì)變性。缺點(diǎn)：

（1）硫酸銨的緩沖能力較差，

（2）其PH值在4.5-5.5之間，在使用之前需要加氨水來調(diào)整PH值。硫酸鈉磷酸鹽檸檬酸鹽影響鹽析的因素（1）鹽離子的強(qiáng)度----離子強(qiáng)度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越小。硫酸銨飽和度=硫酸銨溶液的體積÷混合后溶液的總體積，有機(jī)溶劑的局部高濃度常導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，因此要適度均勻地進(jìn)行攪拌（2）蛋白質(zhì)的性質(zhì)----Ks和β值針對(duì)血漿中的蛋白質(zhì)硫酸銨飽和度達(dá)到20%時(shí)，纖維蛋白析出。硫酸銨飽和度達(dá)到28-33%時(shí)，球蛋白析出。硫酸銨飽和度達(dá)到33-50%時(shí)，擬球蛋白析出。硫酸銨飽和度大于50%時(shí)，白蛋白析出。（3）蛋白質(zhì)的濃度----蛋白質(zhì)濃度越高，所需要的鹽飽和度就越低。但是，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度較高時(shí)，常常發(fā)生其它蛋白質(zhì)的共沉作用。為了避免雜質(zhì)蛋白質(zhì)有共沉，可事先將蛋白質(zhì)母液進(jìn)行適當(dāng)稀釋。一般對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，其濃度為2％～3％比較合適。（4）氫離子濃度----影響蛋白質(zhì)表面凈電荷的數(shù)量，鹽析沉淀蛋白質(zhì)時(shí)，溶液的PH=蛋白質(zhì)的pI（等電點(diǎn)）時(shí)，蛋白質(zhì)最容易析出。（5）溫度----溫度升高，可以使蛋白質(zhì)比較容易鹽析出來。有機(jī)溶劑沉淀

（organicsolventprecipitation）向含有生化物質(zhì)的水溶液中加入一定量親水性的有機(jī)溶劑，能使生化物質(zhì)沉淀析出的分離技術(shù)稱為有機(jī)溶劑沉析。蛋白質(zhì)、酶、核酸、粘多糖等生物大分子的水溶液，在加入乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑后，其溶解度會(huì)不同程度地下降，最終從溶液中析出來，這種方法稱有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法。概念原理降低了溶質(zhì)的介電常數(shù)，使溶質(zhì)之間的靜電引力增加，從而出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致沉淀。由于有機(jī)溶劑的水合作用，降低了自由水的濃度，降低了親水溶質(zhì)表面水化層的厚度，降低了親水性，導(dǎo)致脫水凝聚。有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)分辨率比鹽析高；溶劑容易分離，并可回收使用；產(chǎn)品潔凈；容易使蛋白質(zhì)等生物大分子失活；應(yīng)注意在低溫下操作；成本高。有機(jī)溶劑的選擇沉析溶劑選擇主要應(yīng)考慮以下因素：是否與水互溶，在水中是否有很大的溶解度；介電常數(shù)小，沉析作用強(qiáng)。對(duì)生物分子的變性作用小。毒性小，揮發(fā)性適中。常用的有機(jī)溶劑沉析劑乙醇：沉析作用強(qiáng)，揮發(fā)性適中，無毒。常用于蛋白質(zhì)、核酸、多糖等生物大分子的沉析丙酮：沉析作用更強(qiáng)，用量省，但毒性大，應(yīng)用范圍不廣甲醇：沉淀作用與乙醇相當(dāng)，但對(duì)蛋白質(zhì)的變性作用比乙醇、丙酮都小，由于口服有強(qiáng)毒，限制了它的使用其他：氯仿、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、2-甲基-2，4-戊二醇（MPD）、乙腈等也可作沉析劑以極性從小到大排列如下：

已烷<四氯化碳<苯<二硫化碳<乙醚<氯仿<醋酸乙脂<丙酮<乙醇<甲醇<水。影響有機(jī)溶劑沉析的主要因素溫度：操作過程應(yīng)在低溫條件下進(jìn)行，一般0℃以下；由于乙醇等有機(jī)溶劑與水溶混時(shí)會(huì)放熱，因此提取液必須進(jìn)行預(yù)冷溶液pH值：pI離子強(qiáng)度：離子強(qiáng)度低有利于沉析樣品濃度：0.5~2%，與鹽析相似金屬離子的助沉析作用：Zn2+、Ca2+雜蛋白質(zhì)共沉現(xiàn)象的處理蛋白質(zhì)濃度越大，加入有機(jī)溶劑之后，常常發(fā)生雜蛋白質(zhì)共沉現(xiàn)象，為了避免共沉，要適當(dāng)控制蛋白質(zhì)的濃度，以0.5%-2%較為適宜。金屬離子與蛋白質(zhì)結(jié)合之后，常常使蛋白質(zhì)的溶解度變低，因此常常用鋅與蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物來提取溶液中的蛋白質(zhì)，如用醋酸鋅來沉淀胃蛋白酶、胰島素。等電點(diǎn)沉淀概念： 調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達(dá)到某一生化物質(zhì)的等電點(diǎn)，使其從溶液中沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)原理： 蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，當(dāng)溶液pH值處于等電點(diǎn)時(shí)，分子表面凈電荷為0，雙電層和水化膜結(jié)構(gòu)被破壞，由于分子間引力，形成蛋白質(zhì)聚集體，進(jìn)而產(chǎn)生沉淀。注意如果蛋白質(zhì)結(jié)合了較多的陽離子（Mg、Zn、Ca），則PH值要求偏高。如果蛋白質(zhì)結(jié)合了較多的陰離子（Cl、SO4、PO4），則PH值要求偏低。

等電點(diǎn)沉淀法的應(yīng)用利用等電點(diǎn)沉淀法不但可以沉淀蛋白質(zhì)，而且還可以除去不同pI值的雜蛋白質(zhì)。通過調(diào)節(jié)不同的PH值，使PH=pI-1、pI-2、pI-3，可以沉淀出不同的蛋白質(zhì)。從而實(shí)現(xiàn)純化和分離。應(yīng)當(dāng)注意的是，PH值的劇烈改變常常會(huì)使蛋白質(zhì)變性，因此，實(shí)際操作中多采用弱酸和弱堿來調(diào)節(jié)PH值，如醋酸、碳酸氫鈉等等。其它沉析方法其它沉淀法水溶性非離子型聚合物沉淀劑成鹽類復(fù)合物沉析劑離子型表面活性劑離子型多聚物沉析劑氨基酸類沉析劑分離核酸用沉析劑分離粘多糖用沉析劑選擇性變性沉析法親和沉析親和沉析將配基與可溶性載體偶聯(lián)后形成配基-載體復(fù)合物（親和沉淀劑），該復(fù)合物與生物分子結(jié)合，在一定的條件下可沉淀出來（即通過誘導(dǎo)沉淀）。沉析法提取抗生素、大腸桿菌L-天冬酰胺酶的提取和純化萃取定義：指利用一種溶劑對(duì)不同物質(zhì)的不同的溶解度，從混合物中分離出一種或者幾種組分的過程。根據(jù)參與溶質(zhì)分配的兩相不同分類液固萃取液液萃取雙水相萃取反膠團(tuán)萃取超臨界流體萃取提取過程的三個(gè)階段（1）提取----被提取物與溶劑緊密接觸（2）分離----成份的分離（3）回收----溶劑的回收

影響提取的因素（1）所提取物的體積----溶劑的量為原料體積的1-5倍。（2）溫度----溫度升高有利于增加物質(zhì)的溶解度和溶解的速度。但是，針對(duì)不同的物質(zhì)，提取溫度有不同的要求：酶的提取需要在0—10度之間進(jìn)行。核酸的提取要求進(jìn)行低溫操作，以防生物大分子的降解。脂類藥物的提取應(yīng)該避免加熱，以防脂類氧化。（3）PH值

蛋白質(zhì)的提取以酸性提取液為主，堿性條件會(huì)使得蛋白變性而失活。

多糖類化合物以堿性提取條件較好。（4）鹽濃度

低溶度的鹽可以增加蛋白質(zhì)的溶解度，稱為鹽解作用或者鹽溶作用。常用的鹽溶液有0.15M的氯化鈉、0.02-0.05M的磷酸鹽緩沖液、0.02-0.05M的焦磷酸鈉緩沖液。

在提取血液細(xì)胞成份時(shí)，用蒸餾水提取反而比鹽溶法更加有效，這是因?yàn)榈蜐B能夠破壞膜結(jié)構(gòu)?；驹砝靡环N溶質(zhì)組分(如產(chǎn)物)在兩個(gè)互不相溶的液相(如水相和有機(jī)溶劑相)中競(jìng)爭(zhēng)性溶解和分配性質(zhì)上的差異來進(jìn)行分離的操作。萃取效率是以分配定律為基礎(chǔ)的。一、液液萃取法分配定律分配系數(shù)：在一定溫度下，當(dāng)某一溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中分配達(dá)到平衡時(shí)，則該溶質(zhì)在兩相中的濃度之比為一常數(shù)。常用液液萃取的工藝混合器溶劑發(fā)酵液分離器提取液殘余液?jiǎn)渭?jí)萃取法多級(jí)萃取法混合器溶劑發(fā)酵液分離器提取液混合器溶劑分離器提取液混合器分離器提取液殘余液溶劑殘余液殘余液多級(jí)逆流萃取第一混合器分離器第二混合器分離器第三混合器分離器最后提取液提取液殘余液殘余液最后殘余液提取液溶劑發(fā)酵液一級(jí)二級(jí)三級(jí)A90%A70%A50%(1)乳化與去乳劑乳化：一種液體(分散相)分散在另一種不相混溶的液體(連續(xù)相)中的現(xiàn)象。常用的去乳化的方法：過濾和離心、加熱、攪動(dòng)、稀釋法、加電解質(zhì)、改變兩相之間的比例常用去乳劑：溴代十五烷基吡啶、十二烷基硫酸鈉影響液液萃取的主要因素（2）pH值（3）溫度（4）鹽析劑（5）帶溶劑1、發(fā)展歷史始于20世紀(jì)60年代,從1956年瑞典倫德大學(xué)Albertsson

發(fā)現(xiàn)雙水相體系；1979年德國(guó)GBF的Kula等人將雙水相萃取分離技術(shù)應(yīng)用于生物產(chǎn)品分離；國(guó)內(nèi)自20世紀(jì)80年代起也開展了雙水相萃取技術(shù)研究。二、雙水相萃取將兩種不同的水溶性聚合物的水溶液混合時(shí)，當(dāng)聚合物濃度達(dá)到一定值，體系會(huì)自然的分成互不相溶的兩相，這就是雙水相體系(aqueoustwo-phasesystem,ATPS)。2、雙水相的形成PEG=聚乙二醇(polyethyleneglycol)Kpi=磷酸鉀DX=葡聚糖(dextran)3、常用的雙水相體系體系類型化合物1化合物2高聚物/高聚物體系聚丙二醇聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖（Dex）、羥丙基葡聚糖聚乙二醇（PEG）聚乙烯醇、葡聚糖高聚物/無機(jī)鹽體系聚乙二醇硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、酒石酸鉀鈉高聚物/聚電解質(zhì)體系硫酸葡聚糖鈉鹽甲基纖維素聚電解質(zhì)/聚電解質(zhì)體系羧甲基葡聚糖鈉鹽羧甲基纖維素鈉鹽4、雙水相的相圖T’B’5、影響物質(zhì)分配平衡的因素聚合物的分子量：當(dāng)聚合物的分子量降低時(shí)，蛋白質(zhì)趨向分配于富含該聚合物的相中。聚合物的濃度：成相物質(zhì)的總濃度越高，系線越長(zhǎng)，兩相性質(zhì)的差別增加，蛋白質(zhì)越容易分配于其中的某一相。鹽類：鹽濃度增加促使蛋白質(zhì)兩極分化。通過調(diào)節(jié)ATPS鹽濃度，可選擇性萃取不同的蛋白質(zhì)。pH值：改變兩相的電位差，對(duì)體系中的物質(zhì)解離度的影響。溫度：分配系數(shù)對(duì)溫度的變化不敏感。系統(tǒng)含水量多達(dá)75%～90%，兩相界面張力極低，有助于保持生物活性和強(qiáng)化相際間的質(zhì)量傳遞；分相時(shí)間短(特別是聚合物/鹽系統(tǒng))；易于工藝放大和連續(xù)操作，與后續(xù)提純工序可直接相連接，無需進(jìn)行特殊處理；6、雙水相萃取技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)目標(biāo)產(chǎn)物的分配系數(shù)一般大于3,大多數(shù)情況下,目標(biāo)產(chǎn)物有較高的收率；大量雜質(zhì)能夠與所有固體物質(zhì)一起去掉,與其它常用固液分離方法相比,雙水相分配技術(shù)可省去1～2個(gè)分離步驟,使整個(gè)分離過程更經(jīng)濟(jì)；設(shè)備投資費(fèi)用少,操作簡(jiǎn)單,不存在有機(jī)溶劑殘留問題。主要由三部分構(gòu)成：目的產(chǎn)物的萃??；PEG的循環(huán)；無機(jī)鹽的循環(huán)。7、典型的雙水相萃取的工藝流程分離和提純各種蛋白質(zhì)(酶），特別是胞內(nèi)酶的提取和精制。8、雙水相萃取的應(yīng)用舉例酶菌種相系統(tǒng)η/%天冬氨酸酶E.coliPEG/鹽96β-半乳糖苷酶E.coliPEG/鹽87乙醇脫氫酶BakersyeastPEG/鹽96青霉素?；窫.coliPEG/鹽90提取抗生素和分離生物粒子采用PEG/Na2HPO4

體系提取丙酰螺旋霉素，最佳萃取條件是pH=8.0～8.5，PEG2000(14%)/Na2HPO4(18%),小試收率達(dá)69.2%,對(duì)照的乙酸丁酯萃取工藝的收率為53.4%定義反膠團(tuán)（束）或稱逆膠束(Reversedmicelle)

是指當(dāng)有機(jī)溶劑中加入表面活性劑并使其濃度超過某臨界值時(shí)，表面活性劑便會(huì)在有機(jī)溶劑中形成一種穩(wěn)定的大小為納米級(jí)的聚集體。三、反膠團(tuán)（膠束）萃取在反膠束中，表面活性劑的非極性基團(tuán)在外與非極性的有機(jī)溶劑接觸，而極性基團(tuán)則排列在內(nèi)形成一個(gè)極性核。此極性核具有溶解極性物質(zhì)的能力，極性核溶解水后，就形成了“水池”。特征常用的表面活性劑及其相應(yīng)的有機(jī)溶劑表面活性劑有機(jī)溶劑AOT異辛烷、環(huán)己烷、四氯化碳CTAB乙醇/異辛烷、己醇/辛烷Triton-X乙醇/環(huán)己烷磷脂酰膽堿苯、庚烷反膠團(tuán)萃取的工藝過程前萃取將目的蛋白質(zhì)有選擇性地從發(fā)酵液中轉(zhuǎn)移到反膠團(tuán)溶液中。后萃取再用第二種水相溶液從反膠團(tuán)中將該蛋白質(zhì)萃取出來。溶液的pH溶液的離子強(qiáng)度表面活性劑的濃度和種類其他（有機(jī)溶劑、助表面活性劑、溫度）影響反膠團(tuán)萃取的因素W減小W增大反膠團(tuán)萃取的優(yōu)點(diǎn)(1)有很高的萃取率和反萃取率并具有選擇性；(2)分離、濃縮可同時(shí)進(jìn)行，過程簡(jiǎn)便；(3)能解決蛋白質(zhì)(如胞內(nèi)酶)在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題；(4)由于構(gòu)成反膠團(tuán)的表面活性劑往往具有細(xì)胞破壁功效，因而可直接從完整細(xì)胞中提取具有活性的蛋白質(zhì)和酶；(5)反膠團(tuán)萃取技術(shù)的成本低，溶劑可反復(fù)使用等。純化和分離蛋白質(zhì)、氨基酸、酶、多肽等蛋白質(zhì)復(fù)性、酶活性復(fù)性反膠團(tuán)萃取的應(yīng)用浸取按提取溫度分為

冷溶劑提取----浸漬法（Maceration）

熱溶劑提取----浸提法（Digestion）溶劑的種類（1）酸溶液（2）堿溶液（3）鹽溶液（4）表面活性劑

脂肪酸鹽（R-COONa）

高級(jí)醇硫酸酯鹽（R-OSO3Na）

烷基苯磺酸鹽（R-C6H4-SO3Na）

烷基氨基酸（R-NH-CH2-COOH）

長(zhǎng)鏈季銨鹽

吐溫（Tween）（5）有機(jī)溶劑

極性溶劑-----甲醇、乙醇、丙酮、丁醇、醋酸乙酯

非極性溶劑-----乙醚、氯仿、苯常常用丙酮處理原材料和半成品，這是因?yàn)闉榱嗣撍兔撝?，同時(shí)，做成丙酮粉便于保存，能使細(xì)胞松散，有利于提取。從動(dòng)物原料中提取多肽時(shí)，也常常用不同濃度的丙酮作為提取溶劑，因?yàn)樵诒校鄶?shù)蛋白質(zhì)為不溶性，這樣可以減少雜蛋白質(zhì)的溶出。其他萃取方法超臨界流體萃取微波萃取SFT-150超臨界萃取反應(yīng)儀吉爾森ASPECXL4自動(dòng)固相萃取(SPE)系統(tǒng)層析法（chromatography）的基本原理層析法是利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異（如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等），使各組分在兩相（一相為固定的，稱為固定相；另一相流過固定相，稱為流動(dòng)相）中的分布程度不同，從而使各組分以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。層析的基本概念固定相：固定相是層析的一個(gè)基質(zhì)。它可以是固體物質(zhì)（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質(zhì)（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質(zhì)能與待分離的化合物進(jìn)行可逆的吸附，溶解，交換等作用。流動(dòng)相：在層析過程中，推動(dòng)固定相上待分離的物質(zhì)朝著一個(gè)方向移動(dòng)的液體、氣體等，都稱為流動(dòng)相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時(shí)稱為展層劑。

層析的分類根據(jù)層析分離機(jī)制柱層析薄層層析紙層析薄膜層析吸附層析分配層析離子交換層析凝膠層析親和層析氣相(氣-液；氣-固)層析液相(液-液；液-固)層析根據(jù)兩相所處狀態(tài)根據(jù)操作形式不同按層析過程的機(jī)理分類名稱分離原理吸附層析法各組份在吸附劑表面吸附能力不同，固定相是固體吸附劑分配層析法各組份在流動(dòng)相和靜止液相（固相）中的分配系數(shù)不同離子交換層析法固定相是離子交換劑，各組份與離子交換劑親和力不同凝膠層析法固定相是多孔凝膠，各組份的分子大小不同，因而在凝膠上受阻滯的程度不同親和層析法固定相只能與一種待分離組份專一結(jié)合，以此和無親和力的其它組份分離根據(jù)層析所使用的介質(zhì)不同，可分為1：無機(jī)基質(zhì)分離介質(zhì)2：有機(jī)高分子基質(zhì)分離介質(zhì)。無機(jī)基質(zhì)分離介質(zhì)以多孔硅膠、可控孔徑的玻璃、氧化鋯、氧化鋁、羥基磷灰石為主要載體所制成的球形、或者無定形顆粒。

（1）可控孔徑的玻璃的化學(xué)成份中SiO2，其表面可以通過涂層來進(jìn)行性能上