我的課件-第五章-酶工程原理及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用

第五章酶工程及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用第一節(jié)酶工程原理概述（一）酶工程的定義

利用酶的特異催化功能，或?qū)γ附Y(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾改造，并借助于生物反應(yīng)器和工藝優(yōu)化過程，有效地發(fā)揮酶的催化特性來生產(chǎn)人類所需產(chǎn)品的技術(shù)。它包括酶、細(xì)胞固定化技術(shù)、酶化學(xué)修飾技術(shù)和酶反應(yīng)器設(shè)計(jì)等。一、酶工程概述酶工程技術(shù)的應(yīng)用范圍大致有：（1）對(duì)生物寶庫中存在天然酶的開發(fā)和生產(chǎn)；（2）自然酶的分離純化及鑒定技術(shù)；（3）酶的固定化技術(shù)（固定化酶和固定化細(xì)胞技術(shù)）；（4）酶反應(yīng)器的研制和應(yīng)用；（5）與其它生物技術(shù)領(lǐng)域的交叉和滲透。其中固定化酶技術(shù)是酶工程的核心。

食品酶工程是將酶的理論與技術(shù)應(yīng)用在食品領(lǐng)域，將酶學(xué)基本原理與食品工程相結(jié)合，為新型食品和食品原料的開發(fā)提供技術(shù)支持。加酶洗衣粉中加入一些酶可大大加強(qiáng)其去污能力。用葡萄糖生產(chǎn)果糖行業(yè)來說，將葡萄糖異構(gòu)酶固定起來，不僅能使其在常溫、常壓下行使專一的催化功能，而且由于酶密度提高，使催化效率更高、反應(yīng)更易控制。菠蘿蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶、胃蛋白酶等十幾種可以進(jìn)行食物轉(zhuǎn)化的酶都已進(jìn)入食品和藥物中，以解除許多有胃分泌功能障礙患者的痛苦，此外還有抗腫瘤的L-天冬酰胺酶、白喉毒素，用于治療炎癥的胰凝乳蛋白酶，降血壓的激肽釋放酶，溶解血凝塊的尿激酶等。新型青霉素產(chǎn)品及青霉素酶抑制劑等也都是酶工程在醫(yī)藥醫(yī)療領(lǐng)域的成功應(yīng)用實(shí)例。目前已鑒定的酶約2500多種，有工業(yè)應(yīng)用前景的50一60種，大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的僅16種，小批量生產(chǎn)的商品酶只有100多種。酶在工業(yè)上應(yīng)用受到限制的原因：①大多數(shù)酶脫離生理環(huán)境后極不穩(wěn)定，而酶在生產(chǎn)和應(yīng)用過程中的條件與其生理環(huán)境差別很大；②分離純化酶的技術(shù)繁瑣、復(fù)雜，酶制劑成本高，價(jià)格貴，不利于廣泛應(yīng)用。因此有人根據(jù)酶工程研究和解決問題的手段不同，將酶工程分為化學(xué)酶工程和生物酶工程。

酶工程的內(nèi)容

化學(xué)酶工程

化學(xué)酶工程亦稱初級(jí)酶工程，是指自然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及化學(xué)人工酶的研究和應(yīng)用。它主要是由酶學(xué)原理與化工技術(shù)相互滲透和結(jié)合而形成的一門科學(xué)技術(shù)。自然酶:由材料中分離出來，制成酶制劑，應(yīng)用于紡織、食品、制藥等行業(yè)?；瘜W(xué)修飾酶:通過酶分子的化學(xué)修飾達(dá)到改性改構(gòu)的目的。常采用：酶分子功能基團(tuán)修飾、交聯(lián)反應(yīng)，酶與高分子結(jié)合等方法。主要應(yīng)用于酶學(xué)研究和疾病治療。固定化酶:酶分子通過吸附、交聯(lián)、包埋及共價(jià)鍵結(jié)合等方法束縛于某種特定支持物上而發(fā)揮酶的作用。它在醫(yī)藥和食品工業(yè)上具有極大的使用價(jià)值。人工合成酶:這是化學(xué)家模擬酶的催化功能，用化學(xué)方法合成的催化劑，稱之為人工酶。人工酶的制備有兩種：半合成法和全合成法。這類酶目前尚未具備使用價(jià)值。生物酶工程

生物酶工程是酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物，亦稱高級(jí)酶工程。生物酶工程主要包括三個(gè)方面:用基因工程技術(shù)大量生產(chǎn)酶（克隆酶），目前已經(jīng)克隆成功的酶基因有100多種，其中尿激酶，纖溶酶原激活劑與凝乳酶等已獲得有效的表達(dá)，已經(jīng)或正在投入生產(chǎn)。修飾酶基因產(chǎn)生遺傳修飾酶（突變酶），這方面的研究很少，但己揭開了序幕。設(shè)計(jì)新酶基因，創(chuàng)造優(yōu)質(zhì)酶，用于特殊的高價(jià)化學(xué)藥品和超自然生物制品的生產(chǎn)，滿足人類的其他需要。

酶反應(yīng)器和酶?jìng)鞲衅?/p>

酶反應(yīng)器是完成酶促反應(yīng)的裝置。其研究內(nèi)容包括：酶反應(yīng)器的類型及特性；酶反應(yīng)器的設(shè)計(jì)、制造及選擇等。

酶?jìng)鞲衅饔址Q酶電極。酶電極是由感受器（如固定化酶）和換能器（如離子選擇性電極）所組成的一種分析裝置。用于測(cè)定混合液中某種物質(zhì)的濃度。酶工程的研究進(jìn)展及其重要意義

由于酶制劑不穩(wěn)定，不能重復(fù)使用，從20世紀(jì)60年代起，人們?cè)炎⒁饬械矫负图?xì)胞的固定化研究上。

1953年,Crubhofet和Schleith,將胃蛋白酶、淀粉酶、梭膚酶和核糖核酸酶等結(jié)合在重氮化的樹脂上，實(shí)現(xiàn)了酶的固定化。1969年，日本千煙一朗首次應(yīng)用固定化氨基?；复笠?guī)模生產(chǎn)L-氨基酸?，F(xiàn)在已有十多種固定化酶用于工業(yè)生產(chǎn)。例如：利用固化定葡萄糖異構(gòu)酶生產(chǎn)高果糖漿；利用固定化青霉素酞化酶生產(chǎn)6-氨基青霉烷酸；利用固定化乳糖酶生產(chǎn)低乳糖牛奶。

酶技術(shù)應(yīng)用十分廣泛：

（1）運(yùn)用酶技術(shù)生產(chǎn)有重要價(jià)值產(chǎn)品例如：利用固定化氨基酰化酶拆分DL一酞化氨基酸，自動(dòng)連續(xù)地生產(chǎn)L一氨基酸；利用固定化青霉素酰化酶合成青霉素；利用固定化木瓜蛋白酶合成高甜度低熱量的甜味二肽；利用a-淀粉酶、糖化酶以及固定化葡萄糖異構(gòu)酶從淀粉生產(chǎn)高果糖漿等。（2）利用酶制劑改進(jìn)生產(chǎn)工藝，提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)率，降低生產(chǎn)成本

（3）酶技術(shù)在醫(yī)療衛(wèi)生和環(huán)保方面，亦發(fā)揮著極其重要的作用

在治療疾病方面，不少酶制劑可以作為治療疾病的藥用酶，有很好的療效。例如：尿激酶在治療各種血栓病方面，有特效；天冬酰胺酶能治療白血病，抗腫瘤；人尿胰蛋自酶抑制劑能使急性胰腺炎患者轉(zhuǎn)危為安；豬、牛凝血酶在外科手術(shù)過程中用于止血，效果很好。第二節(jié)食品酶的生產(chǎn)與改造2.1酶的生產(chǎn)

從理論上講，人們可以通過兩條途徑獲得酶制劑，即:①化學(xué)合成；②從生物體內(nèi)直接提取分離獲得。酶的生產(chǎn)早期，人們主要是從動(dòng)植物體中提取獲得酶制劑。目前仍有蛋白酶、淀粉酶、溶菌酶等少數(shù)幾種酶，以動(dòng)植物體為原料獲得。目前酶的生產(chǎn)主要以微生物為原料。近年來在合成酶的類似物和模似酶方面取得了一定進(jìn)展，但它們的催化性和專一性方面都很低。所以，在較長的一段時(shí)間內(nèi)，酶只有直接從生物體中提取。

2.1.1酶生產(chǎn)菌的要求作為酶制劑生產(chǎn)菌的要求：

（1）不能是致病菌。特別是對(duì)于食品用酶和醫(yī)藥用酶尤其如此，現(xiàn)已經(jīng)過某些國家和國際機(jī)構(gòu)鑒定后認(rèn)為可用于食品工業(yè)和醫(yī)藥工業(yè)的生產(chǎn)菌種有：枯草桿菌、黑曲霉、米曲霉、啤酒酵母和脆壁酵母等。

（2）不易退化，不易感染噬菌體。

（3）產(chǎn)酶量高，而且最好產(chǎn)生胞外酶。

（4）能利用廉價(jià)的原料，發(fā)酵周期短，易培養(yǎng)。

2.1.2發(fā)酵方法與發(fā)酵條件用于酶生產(chǎn)的發(fā)酵方法有：

（1）固體發(fā)酵法

即以鼓皮、米糠等為基本原料，加無機(jī)鹽和適量水分（通常50％左右）進(jìn)行的一種微生物培養(yǎng)法。固體發(fā)酵方法，最簡單的是淺盤法，培養(yǎng)基一般不超過5cm厚。其次是轉(zhuǎn)鼓法，培養(yǎng)基在轉(zhuǎn)鼓內(nèi)翻動(dòng)。近年來多用通氣式后發(fā)酵，培養(yǎng)基可達(dá)20-30cm，一般用于霉菌，如用曲霉和毛霉生產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶，用青霉和曲霉生產(chǎn)果膠酶，用木霉生產(chǎn)纖維素酶仍沿用這種固體發(fā)酵法，設(shè)備簡單，便于推廣，但培養(yǎng)基利用不完全，勞動(dòng)量大。

利用合成的液體培養(yǎng)基在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行攪拌通氣培養(yǎng)，是目前主要的方式。①間歇發(fā)酵產(chǎn)酶量高，同時(shí)營養(yǎng)物質(zhì)與誘導(dǎo)物浪費(fèi)少。②連續(xù)發(fā)酵法提高勞動(dòng)生產(chǎn)率，同時(shí)還可能打破酶合成的反饋?zhàn)瓒?，使產(chǎn)酶率提高。

(2)液體發(fā)酵法先確定菌體生長的最適條件，然后作出調(diào)整以滿足酶生成的需要。首先，培養(yǎng)基組成對(duì)菌的生長和酶的合成具有最直接的影響。其次，通風(fēng)量、培養(yǎng)溫度等因素不僅影響菌體生長，也影響酶的合成。一般來說在低于生長溫度下產(chǎn)酶量高。培養(yǎng)溫度還影響酶活力的穩(wěn)定性。另外，在生產(chǎn)中掌握適宜酶的回收時(shí)期也很重要，對(duì)于大多數(shù)胞外酶來說，酶合成與菌株生長大致平行，生長停止時(shí)酶產(chǎn)量達(dá)最大，再培養(yǎng)酶產(chǎn)量多要下降。

發(fā)酵條件既要有利菌體生長繁殖，又不影響酶的形成2.1.3提高酶產(chǎn)量的方法在正常情況下，酶產(chǎn)量受其合成調(diào)節(jié)機(jī)制的調(diào)控，因此要提高酶產(chǎn)量就必須打破這種調(diào)控機(jī)制?？偟膩碚f，真核細(xì)胞酶的合成調(diào)節(jié)遠(yuǎn)比原核細(xì)胞的復(fù)雜。除了組織器官的調(diào)節(jié)外，在細(xì)胞水平上有復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯水平調(diào)節(jié)；有轉(zhuǎn)錄、翻譯后水平調(diào)節(jié)；還有染色體、核等因素的調(diào)節(jié)；另外有神經(jīng)遞質(zhì)、激素水平的晝夜周期性調(diào)節(jié)。酶合成主要取決于轉(zhuǎn)錄的速度，調(diào)控環(huán)節(jié)為轉(zhuǎn)錄，原核細(xì)胞的調(diào)控目前接受的是操縱子模型。操縱子（operon）是由結(jié)構(gòu)基因、操縱基因和啟動(dòng)基因等組成的染色體上控制蛋白質(zhì)合成的功能單位。（1）酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制一些基因調(diào)控蛋白可以控制基因轉(zhuǎn)錄的開啟和關(guān)閉，大腸桿菌的乳糖操縱子就是這樣一個(gè)雙重控制的例子。葡萄糖和半乳糖的水平控制著乳糖操縱子轉(zhuǎn)錄的起始，決定操縱子是“開”還是“關(guān)”。1.培養(yǎng)大腸桿菌時(shí)，如果不加入乳糖，一個(gè)抑制蛋白就會(huì)結(jié)合到操縱子上，阻止RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄操縱子基因。此時(shí)操縱子就處于關(guān)閉狀態(tài)。2.當(dāng)加入誘導(dǎo)物乳糖后，乳糖就會(huì)和抑制蛋白結(jié)合，并改變抑制蛋白的構(gòu)象使得它不能結(jié)合到操縱子上。只要沒有抑制蛋白的結(jié)合，RNA聚合酶就可以識(shí)別啟動(dòng)子并轉(zhuǎn)錄操縱子的結(jié)構(gòu)基因，得到mRNA。此時(shí)操縱子是開啟的。(2)誘導(dǎo)與阻遏①誘導(dǎo)

有些酶在通常情況下不合成或者很少合成，加入誘導(dǎo)物后，就能大量合成，這種現(xiàn)象叫誘導(dǎo)。誘導(dǎo)作用是由于阻遏蛋白與誘導(dǎo)物結(jié)合而發(fā)生別構(gòu)，失去與操縱子結(jié)合的能力，所以結(jié)構(gòu)基因能轉(zhuǎn)錄并翻譯成相應(yīng)的酶，這些酶便叫誘導(dǎo)酶。許多參加分解代謝的酶類如淀粉酶、纖維素酶都是誘導(dǎo)酶。②阻遏

阻遏有兩種，即尾產(chǎn)物阻遏和分解代謝產(chǎn)物阻遏。尾產(chǎn)物阻遏是指有些酶當(dāng)它們的作用產(chǎn)物積累到一定濃度，并能滿足機(jī)體需要后，它們的合成就受阻。這是由于阻遏蛋白本身沒有與操縱子結(jié)合的能力，在正常時(shí)不產(chǎn)生阻遏，但它能以酶作用產(chǎn)物為效應(yīng)物（輔阻遏物）并與之結(jié)合產(chǎn)生別構(gòu)，變?yōu)槟芘c操縱子結(jié)合而關(guān)閉了結(jié)構(gòu)基因。這些酶一般是參加合成代謝的酶接受這種調(diào)節(jié)，某些參與分解代謝的酶也直接或間接地接受這種調(diào)控。另外一種情況是當(dāng)細(xì)胞在容易利用的碳源（葡萄糖）上生長時(shí)，有些酶，特別是參與分解代謝的酶類的合成受阻。這叫分解代謝產(chǎn)物阻遏又叫葡萄糖效應(yīng)。

酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制：1.酶合成的誘導(dǎo)：加進(jìn)某種物質(zhì)，使酶生物合成開始或加速進(jìn)行；2.末端（尾）產(chǎn)物阻遏：由某代謝途徑末端產(chǎn)物的產(chǎn)量過量累積引起的阻遏；3.分解代謝物阻遏：指細(xì)胞內(nèi)同時(shí)有兩種分解底物（碳源或氮源）存在時(shí)，利用快的那種分解底物會(huì)阻遏利用慢的底物的有關(guān)酶合成的現(xiàn)象。2.1.4打破酶合成調(diào)節(jié)機(jī)制限制的方法酶合成調(diào)節(jié)控制能保證機(jī)體最經(jīng)濟(jì)有效地將體內(nèi)原料和能量用于合成生命活動(dòng)最需要的物質(zhì)，但是人們?yōu)榱诵枰鼓承┟复罅亢铣删捅仨毚蚱七@種調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)。打破這種調(diào)節(jié)機(jī)構(gòu)一般有：①控制條件：包括添加誘導(dǎo)物和降低阻遏物濃度；②遺傳控制：包括基因突變和基因重組；③也有其他如添加表面活性劑、產(chǎn)酶促進(jìn)等一些方法。A.添加誘導(dǎo)物這種方法只適應(yīng)于誘導(dǎo)酶的合成。其關(guān)鍵在于選擇適宜的誘導(dǎo)物及其濃度。

誘導(dǎo)物：一是酶的作用底物，但有些底物并不一定是誘導(dǎo)物；

二是一些難以代謝的底物類似物，如異丙基-β-D-琉基半乳糖不易被作用，但可使β-半乳糖苷酶產(chǎn)量增加1000倍。

三是誘導(dǎo)物的前體物質(zhì)，如犬尿氨酸能誘導(dǎo)犬尿氨酸的前體,Trp也有同樣效果。此外對(duì)于參加分解代謝的胞外酶，它們的產(chǎn)物也往往有誘導(dǎo)作用，如纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶。誘導(dǎo)與阻遏之間沒有絕對(duì)界限，其關(guān)鍵在于濃度

eg:纖維二糖,濃度為0.05mg/mL以下能誘導(dǎo)纖維素酶形成，當(dāng)濃度提高100倍時(shí)纖維素酶合成受阻。

2.1.4.1通過條件控制提高酶產(chǎn)量B.降低阻遏物濃度對(duì)于受分解代謝產(chǎn)物阻遏的酶，常采用直接限制碳源或相應(yīng)的生長因子供應(yīng)。對(duì)于合成代謝的酶有兩種方法解決尾產(chǎn)物阻遏：一是于培養(yǎng)基中添加尾產(chǎn)物類似物或添加尾產(chǎn)物形成的抑制劑.二是采用營養(yǎng)缺限型菌株，并限制其生長必需因子的供應(yīng)。

2.1.4.2通過基因突變提高酶產(chǎn)量根據(jù)酶合成的調(diào)節(jié)機(jī)制，要使酶產(chǎn)量因基因突變而提高，不外乎有兩種可能：一是使誘導(dǎo)型變成組成型，即獲得的突變株在沒有誘導(dǎo)物存在的條件下酶產(chǎn)量達(dá)誘導(dǎo)的水平；二是使阻遏型變?yōu)槿プ瓒粜?，即獲得的突變株在引起阻遏的條件下，酶產(chǎn)量達(dá)到無阻遏的水平。

誘導(dǎo)的方法有物理方法：紫外線、x-射線、快中子等；化學(xué)方法有：5-嗅代尿嘧啶、亞硝酸等。(1）組成型變異株篩檢的篩選方法

①將誘變后的產(chǎn)酶株在以低誘導(dǎo)力的誘導(dǎo)物為主要碳源或氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并同時(shí)限制誘導(dǎo)物為一定水平，或同時(shí)加人誘導(dǎo)抑制劑，在此條件下增殖的為組成突變型株。

②將誘導(dǎo)后產(chǎn)酶菌在含誘導(dǎo)物和不含誘導(dǎo)物的培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)可獲得變異株。

(2）抗分解代謝產(chǎn)物阻遏型變異株篩檢

①以被阻遏的酶的底物為惟一氮源。如產(chǎn)氣桿菌誘變后在含有葡萄糖以His為惟一氮源的培養(yǎng)基上培養(yǎng)便得到產(chǎn)HIS酶的抗葡萄糖效應(yīng)的變異株。②變異后的產(chǎn)酶菌在含葡萄糖和不含葡萄糖培養(yǎng)基上交替培養(yǎng)。(3）抗尾產(chǎn)物阻遏變異株的篩檢往往采用在誘變后的菌株的培養(yǎng)基中加入結(jié)構(gòu)上和尾產(chǎn)物相類似的毒性抗代謝物。(l）添加表面活性劑人們發(fā)現(xiàn)許多表面活性劑能提高酶的產(chǎn)量，特別有利于霉菌胞外酶的生產(chǎn)，而且它們對(duì)菌和酶沒有專一性。通常用的是非離子型表面活性劑如Tween8O、TritonX-100等。表面活性劑可能是提高了細(xì)胞膜的透性，有助于打破細(xì)胞內(nèi)酶合成的“反饋平衡”。

(2）其它產(chǎn)酶促進(jìn)劑

有時(shí)除了表面活性劑外，添加其他一些物質(zhì)也能提高酶的產(chǎn)量。如枯青霉培養(yǎng)基中添加植酸鈣鎂，可使5’-P-二酯酶產(chǎn)量增加10-20倍。

(3）通過基因重組提高酶的產(chǎn)量2.1.4.3其他提高酶產(chǎn)量的方法酶的使用目的不同，要求的純度不同。一般工業(yè)上用的酶制劑用量大，純度不高。但不同的工業(yè)用酶的純度也不一樣，如工業(yè)上銷售的a-淀粉酶，用于食品工業(yè)和用于織物退漿其純度質(zhì)量差別甚大；同樣用于皮革工業(yè)和食品工業(yè)的蛋白酶其純度和質(zhì)量要求也相差甚遠(yuǎn)。酶的應(yīng)用如生化試劑、分析工具、靜脈注射等需用純化的酶。2.2酶的分離純化酶的分離提純包括三個(gè)基本的環(huán)節(jié)：抽提，即把酶從材料轉(zhuǎn)入溶劑中來制成酶溶液；純化，即把雜質(zhì)從酶溶液中除掉或從酶溶液中把酶分離出來；制劑，即將酶制成各種劑型。

根據(jù)酶本身的特征，在分離純化工業(yè)中必須注意下列問題。

(l）要注意防止酶變性失活。

除少數(shù)情況外，所有操作必須在低溫下進(jìn)行，特別是有機(jī)溶劑存在時(shí)更要特別小心；大多數(shù)酶在pH<4或pH>l0的條件下不穩(wěn)定，故不能過酸過堿；酶溶液常易在表面上形成泡沫而變性，故應(yīng)防止泡沫的形成；重金屬能引起酶失效，有機(jī)溶液能使酶變性，微生物污染、蛋白酶使酶分解，都必須予以防止。

(2）酶的分離純化的目的是將酶以外的所有雜質(zhì)盡可能除去，因此在不破壞酶所需的條件下，可使用各種“激烈”的手段，此外，由于酶和它的底物、抑制劑等具有親和性，當(dāng)這些物質(zhì)存在時(shí)，酶的理化性質(zhì)和穩(wěn)定性又會(huì)發(fā)生一定的變化，從而提供了更多可供采用的條件和方法。

(3）通過檢測(cè)酶活性，跟蹤酶的來龍去脈，為選擇適當(dāng)方法和條件提供了直接依據(jù)。3化學(xué)修飾酶與化學(xué)人工酶(自學(xué)）p185-p1954固定化酶固定化酶（immoblizedenzyme）是20世紀(jì)60年代開始發(fā)展起來的一項(xiàng)技術(shù)。最初主要是將不溶性酶與水不溶性載體結(jié)合起來，成為不溶于水的酶的衍生物，所以曾叫做“水不溶酶”

后來發(fā)現(xiàn)，也可以將酶包埋在凝膠內(nèi)或置于超濾裝置中，高分子底物與酶在超濾膜一邊，而反應(yīng)產(chǎn)物可以透過膜逸出，在這種情況下，酶本身仍是可溶的，只不過是固定在一個(gè)有限的空間內(nèi)不再自由流動(dòng)罷了。1971年第一屆國際酶工程會(huì)議上，正式建議采用“固定化酶”這一名稱。20世紀(jì)60年代起，固定化酶研究的發(fā)展很快。初期，集中于各種制備方法的研究，近年，轉(zhuǎn)向固定化酶和固定化細(xì)胞在工業(yè)、醫(yī)學(xué)、化學(xué)分析、親和層析和環(huán)境保護(hù)、能源開發(fā)等方面的應(yīng)用研究。

固定化酶（immobilized

enzyme）：酶本身還是溶于水的，只是是用物理的或化學(xué)的方法使酶與水不溶性大分子載體結(jié)合或把酶包埋在載體中，使得酶在水不溶性凝膠或半透膜的微囊體中從而導(dǎo)致流動(dòng)性降低。酶固定化后一般穩(wěn)定性增加，易從反應(yīng)系統(tǒng)中分離，且易于控制，能反復(fù)多次使用。便于運(yùn)輸和貯存，有利于自動(dòng)化生產(chǎn)。固定化酶與水溶性酶相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)：①極易將底物、產(chǎn)物分開；②可以在較長時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)；③在大多數(shù)情況下，可以提高酶的穩(wěn)定性；④酶反應(yīng)過程可以加以嚴(yán)格控制；⑤產(chǎn)物中沒有酶的殘留，簡化了工業(yè)設(shè)備；⑥較水溶性酶更適合于多酶反應(yīng)；⑦可以增加產(chǎn)物的收得率，提高產(chǎn)物的質(zhì)量；⑧酶使用效率提高，成本降低。

固定化酶在使用中存在如下的缺點(diǎn)：①固定化時(shí)，酶活力有損失；②增加了固定化的成本，工廠初始投資大；③只能用于水溶性底物，而且較適用于小分子底物，對(duì)大分子底物不適宜；④與完整菌體比，不適于多酶反應(yīng)，特別是需要輔因子的反應(yīng)；⑤胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離手續(xù)。

4.1酶的固定方法酶的固定方法有下述四種，即吸附法、共價(jià)鍵結(jié)合法、交聯(lián)法、包埋法。A.吸附法物理吸附法

通過氫鍵和π電子親和力等物理作用，將酶固定在水不溶載體上的方法。常用的載體：無機(jī)吸附劑如高嶺土、硅藻土、硅膠、磷酸鈣膠、微孔玻璃等。無機(jī)吸附劑吸附容量低，一般小于lmg蛋白/g吸附劑，還易發(fā)生解吸。有機(jī)吸附劑有纖維素、骨膠原、賽璐玢、火棉膠等。吸附容量可達(dá)70mg蛋白/cm2

膜。物理吸附法制成的固定化酶，酶活力損失少，但酶易脫落很少實(shí)用價(jià)值。離子吸附法

離子吸附法是將酶同含有離子交換劑的水不溶性載體相結(jié)合。酶吸附較牢固，在工業(yè)上用途很廣。常用載體有：①陰離子交換劑DEAE（二乙氨基乙基）-纖維素、ECTEOLA-（混合氨類）-纖維素、TEAE（四乙氨基乙基）-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等；②陽離子交換劑如CM-纖維素、纖維素-檸檬酸等。B.包埋法將聚合物單體和酶溶液混合，再借助于聚合促進(jìn)劑（包括交聯(lián)劑）的作用進(jìn)行聚合，使酶包埋于聚合物中以達(dá)到固定化。合成的高聚物：聚丙烯酰胺、聚氯乙烯、聚乙烯、光敏樹脂、尼龍、醋酸纖維等。天然高聚物：卡拉膠、海藻酸、角叉菜膠、明膠、膠原、瓊脂、大豆蛋白等。此法由于酶分子僅僅是被包埋，未受到化學(xué)反應(yīng)，故酶活力高，但此法對(duì)作用于大分子底物不適宜。

聚丙烯酰胺凝膠包埋法:將1mL酶液，加人含有750mg丙烯酞胺單體和40mg甲叉丙烯酸胺（交聯(lián)劑)的3mL溶液中，再加人0.5mL的5％二甲氨基丙腈（加速劑）,加人1％過硫酸鉀作為引發(fā)劑，混合23℃保溫10min。此凝膠孔徑為1-4nm?？ɡz包埋法:卡拉膠是由角叉菜（一種紅色海藻）提取的一種多糖。將100mg酶在37-50℃溶于蒸餾水中。又將1.7g卡拉膠在40-60℃溶于34mlL生理鹽水中，混合后，冷卻到10℃，使凝膠化，后浸在0.3mol/LKCL溶液中，做成顆粒即為固定化酶。大豆蛋白質(zhì)包埋法:將酶放在大豆蛋白溶液中，在6℃用碳酸鎂處理使其凝結(jié)、過濾、作成粒狀，干燥，取后用戊二醛或六甲叉二胺處理，使其硬化。微膠囊法

它是將酶包埋于半透性聚合體膠內(nèi)，形成微囊，直徑為1-100um，如Asn酶，此酶供醫(yī)療之用。界面聚合法液體干燥法分相法液膜法C.共價(jià)結(jié)合法

是指將酶與聚合物載體以共價(jià)鍵結(jié)合的酶的固定方法。

酶與載體共價(jià)結(jié)合的功能基團(tuán)

①氨基、②羧基、③酚基、Tyr的酚環(huán)；④巰基、⑤羥基、⑥咪唑基、⑦吲哚基。常見的包括-NH2、-COOH、Tyr、His的芳香環(huán)。

偶聯(lián)反應(yīng)

選擇什么偶聯(lián)反應(yīng)取決于載體的功能基團(tuán)和酶分子上的非必需基團(tuán)。重氮化反應(yīng)異硫氰酸酯反應(yīng)溴化氫-氨碳酸基反應(yīng)芳香烴化反應(yīng)疊氮反應(yīng)酸酐反應(yīng)縮合反應(yīng)金屬偶聯(lián)反應(yīng)重氮化反應(yīng)D.交聯(lián)法

利用雙/多功能試劑在酶分子間或酶與載體間，或酶與惰性蛋白間進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)以制備固定化酶。常用交聯(lián)劑：戊二醛、苯基二異硫氰酸酯、雙重N聯(lián)苯胺-2,2‘-二磺酸、甲苯-2-異氰-4-異硫氰等，其中戊二醛用得最多。

交聯(lián)反應(yīng)可以發(fā)生在酶分子之間，也可以發(fā)生在酶分子內(nèi)部，酶濃度低發(fā)生在酶分子內(nèi)部，高酶濃度下分子間交聯(lián)比例上升形成固定化酶后往往為不溶態(tài)。交聯(lián)法各種固定化酶方法的比較4.2固定化酶的性質(zhì)A.固定化對(duì)酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響

固定化對(duì)酶活性和酶反應(yīng)系統(tǒng)的影響十分復(fù)雜，常因酶的種類、反應(yīng)系統(tǒng)的組成，特別固定的方法以及載體不同而顯著不同。為了使問題簡化，通常都要做兩個(gè)共同的假設(shè)：

(l）酶在載體表面上或在多孔介質(zhì)內(nèi)的分布完全均勻。

(2）整個(gè)系統(tǒng)各向同性。

在上述條件下，固定化酶對(duì)酶反應(yīng)體系的影響可概括為如下三種類型：

1構(gòu)象改變和立體屏蔽效應(yīng)

構(gòu)象改變指酶在固定化過程中，酶與載體的相互作用引起酶活力中心或變構(gòu)中心的構(gòu)象發(fā)生變化，從而導(dǎo)致酶活性下降。這種效應(yīng)，難以定量描寫，也難以預(yù)測(cè)，通常出現(xiàn)于吸附法和共價(jià)偶聯(lián)法。立體屏蔽效應(yīng)由于載體的空間大小，或是由于固定方法與位置的不同，對(duì)酶的活性中心或者是調(diào)節(jié)中心造成空間障礙，因而與效應(yīng)物無法接觸，從而影響酶活性。

2微環(huán)境影響

微環(huán)境是指緊鄰固定化酶的環(huán)境區(qū)域。由于載體的親水、疏水性質(zhì)和介質(zhì)的介電常數(shù)等直接影響酶的催化效率或者是酶對(duì)效應(yīng)物作出反應(yīng)的能力。通常可以通過改變載體與介質(zhì)的性質(zhì)可作出判斷和調(diào)節(jié)。3分配效應(yīng)與擴(kuò)散效應(yīng)，與微環(huán)境密切相關(guān)

分配效應(yīng)由于固定化載體的親水和疏水性質(zhì)使酶的底物、產(chǎn)物以及其他效應(yīng)物在微環(huán)境與宏觀體系間發(fā)生了不等分配，改變了酶反應(yīng)系統(tǒng)的組成平衡，從而影響了反應(yīng)速度。B.固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響大多數(shù)酶在固定化以后，有較高的穩(wěn)定性和較長的有效壽命，其原因是：①固定化增加了酶結(jié)構(gòu)型的牢固性程度；②阻擋了不利因素對(duì)酶的侵襲；③限制了酶分子的相互作用。但固定化如果觸及到酶的敏感區(qū)域。也可能導(dǎo)致穩(wěn)定性下降。增加熱穩(wěn)定化增強(qiáng)對(duì)變劑性、抑制劑的抵抗能力固定化減輕蛋白酶的破壞作用半衰期延長

固定化酶法生產(chǎn)果葡糖漿

果葡糖漿是一種以果糖和葡萄糖為主要成分的混合糖漿，國際上按果糖含量及其發(fā)展分為三代：第一代果葡糖漿含42％的果糖，其它成分為葡萄糖53%，低聚糖5%，濃度為70％一72%，甜度與蔗糖相同；第二代果葡糖漿含果糖55%，葡萄糖40%，低聚糖5%，濃度為76％一78%，甜度約為蔗糖的1.1倍；第三代果葡糖漿含果糖量在90％以上，低聚糖3%，濃度為79％一80%，其甜度為蔗糖的1.4倍。此外有的國家還生產(chǎn)果糖，純度為97％以上的結(jié)晶果糖。

5酶反應(yīng)器

酶反應(yīng)器是利用游離酶、或固定化酶將底物轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的裝置。根據(jù)使用對(duì)象的不同，可以分為游離酶反應(yīng)器、固定化酶反應(yīng)器。5.1固定化酶反應(yīng)器的類型及其特點(diǎn)A.間歇式攪拌罐間歇式酶反應(yīng)器。分為攪拌罐反應(yīng)器(BSTR)以及攪拌式反應(yīng)罐。它是由容器、攪拌器的恒溫裝置組成的。酶的底物一次性加入反應(yīng)器，而產(chǎn)物一次性取出。反應(yīng)完成，將固定化酶濾出，再轉(zhuǎn)入下一批反應(yīng)。優(yōu)點(diǎn)，反應(yīng)器結(jié)構(gòu)簡單，造價(jià)較低；由于攪拌使內(nèi)容物混合均勻；反應(yīng)溫度和pH值易于控制；傳質(zhì)阻力小，反應(yīng)能迅速達(dá)到穩(wěn)態(tài)；能處理難溶底物或膠狀底物，適用于受底物抑制的酶反應(yīng)。缺點(diǎn)，反應(yīng)效率較低，攪拌動(dòng)